Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Tủ an toàn Sinh học cấp 2.
Máy Real-time PCR.
Máy in màu.
Máy ly tâm 25000 x g.
Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml.
Máy ủ nhiệt.
Máy vortex.
Micropipette.
Bộ lưu điện.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao [bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm]
Định mức sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho 2 mẫu/lần thực hiện [VD].
* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm [EQAS] là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao [với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm].
Bệnh phẩm
Huyết thanh, huyết tương.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh [xem phụ lục 3].
Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu [xem phụ lục 6].
Tiến hành kỹ thuật
Tách chiết DNA tổng số.
Thực hiện Real-time PCR.
Phân tích và đánh giá kết quả.
In và trả kết quả.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Chứng Dương phải xuất hiện đồ thị huỳnh quang trên đường giới hạn cơ bản, chứng Âm phải không có bất kỳ đường đồ thị huỳnh quang nào xuất hiện. Đường đồ thị huỳnh quang của mẫu có thể xuất hiện hoặc không xuất hiện trên đường giới hạn cơ bản, căn cứ vào đó để kết luận kết quả.
NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Trong trường positive control [PC] và negative control [NC] xuất hiện không đúng với diễn giải ở phần IV thì phải kiểm tra lại Master mix và chứng dương và quá trình tách DNA tổng số, và thực hiện lại xét nghiệm.
Nếu đường đồ thị huỳnh quang của mẫu xuất hiện ở ngoài chu kỳ thứ 40 thì phải cẩn thận kiểm tra và đánh giá lại mẫu.
Theo Mục 5 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-43:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 43: Bệnh lưỡi xanh quy định về thiết bị, dụng cụ dùng trong việc chẩn đoán bệnh lưỡi xanh như sau:
Thiết bị, dụng cụ
Sử dụng thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm sinh học, bao gồm những thiết bị dụng cụ sau:
5.1 Thiết bị, dụng cụ sử dụng chung
5.1.1 Tủ lạnh: tủ lạnh thường [từ 0°C đến 8 °C], tủ lạnh âm sâu [từ âm 20 °C đến âm 80 °C];
5.1.2 Buồng cấy an toàn sinh học cấp 2;
5.1.3 Máy lắc trộn vortex, có thể hoạt động với tốc độ từ 200 g đến 2500 g;
5.1.4 Cối, chày sứ, kéo, panh kẹp, vô trùng;
5.1.5 Xy lanh và kim tiêm loại 18G;
5.1.6 Dụng cụ tiêu hao như: găng tay, khẩu trang, bảo hộ cá nhân.
5.2 Thiết bị, dụng cụ cho phương pháp RT- PCR/ realtime RT- PCR
5.2.1 Máy PCR, realtime PCR;
5.2.2 Máy chiết tách ADN/ARN tự động [nếu có];
5.2.3 Máy ly tâm, có thể thực hiện ở 1500 g đến 2500 g, 10000 g và 12000 g;
5.2.4 Máy lắc ủ nhiệt;
5.2.5 Máy spindown, máy ly tâm lắng;
5.2.6 Bồn điện di;
5.2.7 Máy đọc gel.
5.3 Thiết bị, dụng cụ dùng cho phương pháp ELISA
5.3.1 Máy đọc ELISA, có thể đọc ở bước sóng từ 450 nm đến 650 nm;
5.3.2 Thiết bị ủ mẫu, có thể duy trì ở nhiệt độ 37 °C.
Theo đó, khi thực hiện chẩn đoán bệnh lưỡi xanh trong phòng thí ngiệm thì có thể sử dụng các thiết bị và dụng cụ theo tiêu chuẩn nêu trên.
Phương pháp ELISA được dùng đối với mẫu bệnh phẩm nào để chẩn đoán bệnh lưỡi xanh ở bò?
Theo tiểu mục 7.3 Mục 7 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-43:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 43: Bệnh lưỡi xanh quy định về việc phát hiện kháng thể như sau:
Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
...
7.3 Phát hiện kháng thể
Phương pháp ELISA
Kít ELISA được sử dụng phát hiện kháng thể kháng nguyên VP7 của vi rút Bluetongue trong huyết thanh hoặc huyết tương trâu, bò, dê, cừu [tham khảo Phụ lục E].
Như vậy, phương pháp ELISA chỉ được sử dụng khi mẫu bệnh phẩm là huyết thanh hoặc huyết tương của bò có triệu chứng mắc bệnh lưỡi xanh.
Sử dụng kít ELISA để phát hiện kháng thể kháng nguyên VP7 của vi rút Bluetongue trong huyết thanh hoặc huyết tương ở bò.
Phương pháp ELISA được dùng đối với mẫu bệnh phẩm nào để chẩn đoán bệnh lưỡi xanh ở bò? [Hình từ Internet]
Phương pháp ELISA được thực hiện theo trình tự, thủ tục như thế nào để có thể chẩn đoán bệnh lưỡi xanh ở bò?
Theo Phụ lục E Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8400-43:2019 về Bệnh động vật - Quy trình chuẩn đoán - Phần 43: Bệnh lưỡi xanh quy định về phương pháp ELISA như sau:
Phụ lục E
[Tham khảo]
Phát hiện kháng thể vi rút Bluetongue bằng phương pháp ELISA
[Ví dụ: Sử dụng bộ kít ID Screen Bluetongue competition, mã sản phẩm BTC-5P của nhà sản xuất ID.VET - Pháp]
E.1 Chuẩn bị nguyên liệu
- Đưa tất cả các nguyên liệu trong bộ kít ổn định ở nhiệt độ phòng [21 °C ± 2 °C] và lắc đều để đồng nhất trước khi sử dụng
- Chuẩn bị dung dịch rửa 1X: Lắc dều dung dịch rửa nồng độ đậm đặc [20X] để chắc chắn dung dịch rửa đã hòa tan hoàn toàn và pha loãng với nước cất theo tỉ lệ 1/20 để được dung dịch rửa nồng độ 1X
E.2 Các bước thực hiện
- Cho 50 μl của Dilution Buffer 2 đến tất cả các giếng phản ứng.
- Cho 50 μl của Positive Control đến giếng A1 và B1.
- Cho 50 μl của Negative Control đến giếng C1 và D1.
- Cho 50 μl mẫu xét nghiệm vào các giếng còn lại.
- Ủ 45 phút ± 4 phút ở nhiệt độ 21 °C ± 5 °C.
- Chuẩn bị Conjugate 1X bằng cách pha loãng Conjugate 10X theo tỷ lệ 1/10 trong Dilution Buffer 2.
Lưu ý, không rửa đĩa ở bước này.
- Cho thêm vào 100 μl Conjugate 1X đến tất cả các giếng.
- Ủ [30 ± 3] phút ở nhiệt độ [21 ± 5] °C.
- Rửa đĩa 300 μl/giếng, lặp lại 3 lần với nước rửa [Wash Solution].
- Cho 100 μl của Substrate [TMB] vào tất cả các giếng.
- Ủ [15 ± 2] phút ở nhiệt độ [21 ± 5] °C trong tối.
- Cho thêm 100 μl dung dịch dừng phản ứng [Stop Solution] đến tất cả các giếng phản ứng.
- Đọc đĩa và ghi nhận giá trị OD ở bước sóng 450 nm.
E.3 Kết quả
• Đánh giá kết quả
- Giá trị OD trung bình của đối chứng âm [OD Negative control_ ODNC] lớn hơn 0,7.
ODNC > 0,700.
- Tỷ lệ giá trị trung bình của đối chứng dương [OD Positive control_ODPC] và Giá trị OD trung bình của đối chứng âm [OD Negative control_ ODNC] phải nhỏ hơn 0,3.
ODPC/ODNC