Các phương pháp định lượng acid amin

Tóm tắt nội dung tài liệu

1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ KHOA CƠ KHÍ CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI : Phân tích acid amin bằng phương pháp sắc ký GVHD : PHẠM TRẦN THÙY HƯƠNG NHÓM :2.5    
2. A.ĐẶT VẤN ĐỀ A.Đ Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein là  chất hữu cơ mà phân tử chứa ít nhất một nhóm carboxyl  và ít nhất một nhóm amino trừ prolin chỉ có nhóm  NH[thực chất là một acid imin].  Có khoảng hơn 20 loại amino acid khác nhau, do đó  việc phân tích chúng để xác định thành phần axit amin  hoặc hàm lượng của các protein, peptide, và các chế  phẩm dược phẩm khác rất cần thiết.
3. B.NỘI DUNG B.N I.Xử lý mẫu­ Tạo dẫn xuất  1. Thủy phân protien,peptide        Có nhiều cách thủy phân : bằng axit, kiềm, enzim tùy vào loại  thực phẩm và thành phần của protien.  Thứ tự thủy phân : +Đốt nóng lò ở 105 ÷ 112oC khoảng 20 ­30 phút trước khi thủy  phân  +Cân mẫu và làm giàu protein [tùy vào loại thực phẩm] +Dùng tác nhân để thủy phân [như HCl phải có phenol để  ngăn cản halogel hóa của tyrosin ]
4. 2. Tạo dẫn xuất: 2.  Tăng độ nhạy trong quá trình phân tích người ta th ường Tăng tạo dẫn xuất acid amin, trong đó có các axit amin phản ứng với một tiền chất để mang lại khả năng hấp thụ m ạnh tia UV/Vis hoặc một tạo một hợp chất huỳnh quang. Có nhiều chất để tạo dẫn xuất với protien nh ư: Có  o-phthalaldehyde [OPA], Phenylisothiocyanate [PITC], o-phthalaldehyde carbamate 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl [AQC] ...Ứng với mỗi dẫn xuất thì chọn detector có bước [AQC] sóng khác nhau.  Việc tạo dẫn xuất phải thực hiện qua nhi ều b ước.  Quy trình sấy khô Quy Chuẩn bị hóa chất,dung dịch dùng sấy khô lại Cho vào bình định mức Tiến hành sấy khô hút chân không cho đến khô
5.   Chuẩn bị dung dich dẫn xuất Chuẩn bị hỗn hợp theo tỉ lệ các chất tùy vào phương pháp dẫn  xuất  Tạo dẫn xuất  ­ Rút 20µl hỗn hợp dung dịch tạo dẫn xuất mới pha ở trên, cho  vào mỗi ống mẫu đã sấy khô ­ Lắc vài giây   ­ Để yên 20 phút ở nhiệt độ 20­25oC ­ Sấy khô
6. a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA o-phthalaldehyde hoặc ortho-  phthalaldehyde [OPA] là các hợp chất hóa học với công thức C6 H4 [CHO]2. [CHO] Thường được viết tắt OPA, phân tử  này là một dialdehyde bao gồm hai nhóm formyl [CHO] gắn liền kề trên một vòng benzene. Là chất rắn màu vàng nhạt được dùng trong việc tổng hợp các hợp chất dị vòng và là một OPA thuốc thử trong phân tích của các acid amin.
7. a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA Ortho-phthalaldehyde [OPA] được hòa tan và ổn định  trong dung dịch nước ở pH
8. a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA a. Có 2 phương pháp tạo dẫn xuất OPA: tạo dẫn xuất ti ền cột [Precolumn derivatization] và tạo dẫn xuất sau c ột [derivatization postcolumn]. Dẫn xuất tiền cột:  Nguyên tắc chung tạo Precolumn derivatization là tạo dẫn xuất của các axit amin với o- phthalaldehyde [OPA], tiếp theo là tách HPLC ngược pha, các sắc ký lỏng được trang bị một máy dò fluorometric để phát hiện các dẫn xuất acid amin. Cường độ huỳnh quang của phức OPA- acid amin được theo dõi với bước sóng kích thích 348 nm và bước sóng phát xạ 450 nm.
9. a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA Dẫn xuất tiền cột:   o­phthalaldehyde [OPA] phản  ứng với các acid amin  với  sự  có  mặt  của  hợp  chất  thiol  để  hình  thành  các  sản  phẩm    huỳnh  quang.  N-acetyl-L-cysteine và 2 -mercaptoethanol  có  thể  được  sử  dụng  như  là  các  thiol.   OPA tự nó không phát huỳnh quang và do  đó không  ảnh hưởng đến kết quả phân tích. 
10. a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA Dẫn xuất tiền cột:  Độ hòa tan và độ ổn định của nó trong dung dịch nước cùng với tốc độ phản ứng nhanh nên có thể tạo dẫn xuất tự động và phân tích bằng cách sử dụng một máy lấy mẫu tự động, dẫn xuất này có độ nhạy rất cao, giới hạn phát hiện tối thiểu là 50 fmol [10 -15mol] mol]  Tuy nhiên, vì không có khả năng phản ứng với acid amin thứ cấp nên làm hạn chế ưu thế của phương pháp tạo dẫn xuất này. Phương pháp này không phân tích được các acid amin thứ cấp [ví dụ như proline].
11. a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA Dẫn xuất sau cột  Nguyên tắc tạo dẫn xuất sau cột là sử dụng cột trao đổi ion để tách các axit amin tự do, tiếp theo là quá trình oxy hóa các acid amid bằng hypochlorite natri rồi thực hiện phản ứng với OPA với sự có mặt của hợp chất thiol như N-acetyl-L-cysteine và 2-mercaptoethanol  Mặc dù OPA không phản ứng với các amin thứ cấp [ proline] để tạo thành các chất huỳnh quang, nhưng quá trình oxy hóa bằng hypochlorite natri cho phép các amin thứ cấp phản ứng với OPA.
12. a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA Dẫn xuất sau cột  Cường độ huỳnh quang của phức OPA- acid amin được đo với một bước sóng kích thích 348 nm và phát xạ bước sóng 450 nm vì vậy khi tiến hành phân tích dùng đầu dò huỳnh quang 348nm.  Giới hạn phát hiện tối thiểu khoảng một vài chục pmol cho hầu hết các dẫn xuất acid amin, tuyến tính trong phạm vi của một vài pmol đến vài chục nmol.  So với dẫn xuất tiền cột thì dẫn xuất này có độ nhạy thấp hơn tuy nhiên ưu điểm là có thể phân tích được acid amin thứ cấp.
13. b. Phương pháp tạo dẫn xuất NBD-F  Nguyên  tắc  chung  tạo  dẫn  xuất  NBD­F  là  phản  ứng  của  các  acid  amin  với  7­fluoro­4­ nitrobenzo­2­oxa­1.3­diazole  [NBD­F],  NBD­ F phản  ứng với các acid amin kể cả các acid  amin  thứ  cấp  để  tạo  thành  sản  phẩm  cao  huỳnh  quang,  tiếp  theo  là  tách  HPLC  pha  đảo  với  sử  dụng  đầu  dò  huỳnh  quang  bước  sóng kích thích là 480 nm và bước sóng phát  xạ là 530 nm. NBD­F
14. b. Phương pháp tạo dẫn xuất NBD-F  Các điều kiện tốt nhất cho phản ứng tạo dẫn xuất là ở nhiệt độ  60oC và môi trường kiềm trong 5 phút, sau đó dùng acid HCl  bổ sung vào hỗn hợp để hạn chế ảnh hưởng của chất chất  nền huỳnh quang.  Ưu điểm: Độ nhạy của phương pháp này gần với phương pháp tạo dẫn xuất tiền cột OPA nhưng có ưu điểm hơn là phản ứng được với acid amin thứ cấp.  Giới hạn phát hiện của phương pháp tạo dẫn xuất này cho mỗi acid amin là khoảng 10 fmol.
15. c. Phương pháp tạo dẫn xuất PITC Phenyl  isothiocyanate  [PITC]  là   một  thuốc  thử  được  sử  dụng  trong  HPLC  pha  đảo  ngược  PITC,  ít  nhạy  cảm  hơn  [OPA]  và  không  thể  hoàn  toàn  tự  động  tuy  nhiên  PITC  có  thể  tạo sản phẩm  ổn  định với tất cả các  axit amin, trong  đó có acid amin thứ  cấp [proline]. PITC  phản  ứng  với  axit  amin  để  tạo   thành phenylthiocarbamyl [PTC] hấp  thụ  cực  đại  bước  sóng  tử  ngoại  254  nm
16. c. Phương pháp tạo dẫn xuất PITC Đầu  tiên  loại  hết  HCl  dư  và  làm  khô.  Sau  khi  đã  làm  khô  bổ   sung thuốc thử tạo dẫn xuất gồm ethanol:TEA: nước cất: PITC  = 7:1:1:1, làm sạch dẫn xuất bằng cách hạ  áp suất trong 30­ 45 phút. Lưu trữ mẫu dẫn xuất PITC sau khi sấy khô, tái sử dụng dẫn   xuất  bằng  cách  hòa  tan  lại  nó  vào  dung  dịch  đệm  photphat  pH= 7,4 và acetonitrile với tỉ lệ 95:5 chỉ có thể giữ  được tối  đa  một ngày ở nhiệt độ phòng, hay 60­70 giờ khi để trong tủ lạnh.
17. c. Phương pháp tạo dẫn xuất PITC Phát hiện các dẫn xuất bằng cách sử dụng một máy dò tia cực tím ở   254 nm, giới hạn phát hiện tối thiểu được khoảng 1 pmol cho hầu  hết các dẫn xuất acid amin. Tuyến tính thu được trong khoảng 20­ 500 pmol.  Các thuốc thử PITC là dễ bay hơi, làm cho nó có thể loại bỏ thuốc   thử dư thừa, qua đó giảm thiểu khả năng ảnh hưởng của thuốc thử. PITC chỉ có thể áp dụng cho trường hợp tạo dẫn xuất tiền cột vì sự   chuẩn bị mẫu và tạo dẫn xuất yêu cầu thời gian dài.
18. II. Định lượng axit amin bằng phương II. pháp sắc ký lỏng cao áp[HPLC]  Nguyên tắc của phương pháp: • HPLC là phương pháp sắc ký  được phát triển dựa trên phương pháp ghi  sắc ký cột, các chất phân tích khi qua cột sắc ký do có ái lực khác nhau  với pha  động[ dung môi] và pha tĩnh [các hạt nhồi trong cột] mà chúng  ra  khỏi  cột  với  thời  gian  khác  nhau,chất  nào  có  ái  lực  với  pha  tĩnh  lớn  hơn sẽ giữ trong cột lâu hơn, còn chất có  ái lực nhỏ với pha tĩnh sẽ ra  khỏi cột cùng với pha động sớm hơn .  • Thay vì  để dung môi nhỏ giọt qua một cột ghi sắc ký dưới tác dụng của  trọng  lực,  người  ta  đặt  lên  dung  môi  áp  suất  khoảng  400at  để  sự  dịch  chuyển xảy ra nhanh hơn.  • Phương pháp này cho phép chúng ta sử dụng các hạt có kích thước nhỏ  trong cột hấp phụ và làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa pha tĩnh và các phân  tử chất phân tích  đi qua nó. Điều này sẽ tăng cường khả năng phân tích  các chất có trong hỗn hợp. 
19. II. Định lượng axit amin bằng phương II. pháp sắc ký lỏng cao áp[HPLC] 1. Chuẩn bị dung dịch axit amin chuẩn: Dùng pipet tự động rút 3,5,7,10 µl dung dịch axit amin chuẩn cho   vào ống nghiệm và làm dẫn xuất như đối với dung dịch mẫu  Chú ý Sấy khô mẫu tạo dẫn xuất để loại bỏ những vết cuối cùng của   PITC  Cần chuấn bị tạo dẫn xuất ở mỗi lần phân tích   Ở nhiệt độ phòng,các mẫu đã được pha loãng chỉ cho kết quả ổn   định trong vòng 10 giờ.Còn các mẫu chưa pha loãng thì có thể giữ  được trong 60 giờ,Vì vậy không nên lưu trữ các mẫu chưa pha  loãng.Những mẫu khô có thể để nhiều tuần trong tủ đông.       2. Xử lí mẫu [như đã trình bày ở trên ]
20. II. Định lượng axit amin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp[HPLC] 3. Dụng cụ hóa chất  3. D Dung dịch HCL 6M có bổ sung phenol 1% [10 μl   phenol cho  vào 1 ml hcl Bình khí nitơ   Chất tạo dẫn xuất  như Phenylisothiocyanate [ PITC] ,     Triethylamine [TEA]  Ethanol loại dùng cho HPLC             Nước cất lần 2 Dụng cụ và thiết bị hỗ trợ cho sắc ký 

Page 2

YOMEDIA

Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của protein là chất hữu cơ mà phân tử chứa ít nhất một nhóm carboxyl và ít nhất một nhóm amino trừ prolin chỉ có nhóm NH[thực chất là một acid imin]. Có khoảng hơn 20 loại amino acid khác nhau, do đó việc phân tích chúng để xác định thành phần axit amin hoặc hàm lượng của các protein, peptide, và các chế phẩm dược phẩm khác rất cần thiết.

30-08-2011 891 138

Download

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2009-2019 TaiLieu.VN. All rights reserved.