Tìm điều kiện lamda để so sánh vmaxx va fv

LINK DOCS.GOOGLE: //drive.google.com/file/d/0B8NwdnrE0vjMcEtvNVRzWmpzdnc/view?usp=sharing LINK BOX: //app...

NGUYỄN LÂ N D ŨNG , BÙI THỊ VIỆT HÀ, NGUYEN đ ì n h q u y ế n PH Ạ M V Ă N TY, PH ẠM THÀNH H ổ, LÊ V Ă N HIỆP CHUNG CHÍ TH ÀNH, LÊ THỊ HÒA

SINH LY HỌC' SINH HOA HỌC DI TRUYỀN HỌC • MIEN dịch học VÀ SINH THẢI HOC VI SINH VÂT

VỴ~7 NHÀ XUẤT BẢN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT

Nguyễn Lân Dũng, Bùi Thi Việt Hà, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Phạm Thành Hổ, Lê Văn Hiệp, Chung Chí Thành, Lê Thị Hòa

VI SINH VẬT HỌC Phần II Sinh lỹ học, Sinh hóa họCy Đi truyền học, Miễn dịch học và Sinh thái học vi sinh vật • * • •

NHÀ XUẤT BẢN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT HÀ NỘI

Nguyễn Lân Dũng, Bùi Thị Việt Hà, Nguyễn Dinh Quyến, Phạm Văn Ty, Phạm Thành Hổ, Lê Vãn Hiệp, Chung Chí Thành, Lề Thị Hòa

VI SINH VẬT HỌC tt ■ P hần II

Sinh lý học, Sinh hóa học, Di truyền học, Miễn dich hoc và Sinh thái hoc I « » vi sinh vật *

Chịu trách nhiệm xuất bản:

ĐỒNG KHÁC SỦNG

Biên tập:

TS. NGUYỄN HUY TIÊN

Trình bây bìa:

NGỌC TUẤN

NHÀ XUẤT BẢN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT 70 Trần Hưng Đạo, Hà Nội In 400 bản khổ 19 X 27cm, tại Công ty TNHH In Thanh Bình Số đăng ký kế hoạch XB: 149 - 2011/CXB/290 * 11/KHKT, ngày 14/2/2011. Quyết định XB số: 233/QĐXB - NXBKHKT, ký ngày 09/12/2011 In xong và nộp lưu chiểu Quý I năm 2012.

Lời giới thiệu Vi sinh vật [microorganisms] ỉà những sinh vật nhỏ bé đến mức chi có thế thấy được chúnẹ dưới kính hiển vi quang học hay kính hiển vì điện từ. Vi sinh vật gây ra rất nhiều bệnh hiểm nghèo cho người, cho gia súc, gia cầm, Tuy nhiên số vi sinh vật gây bệnh chi chiêm một phần rat nhỏ trong thế giới vi sinh vật. Từ xa xưa người ta đã biết ímg đụng các vi sinh vật có ích [ỉuy chưa hề biết tới sự tồn tại của chúng] để chế biển thực phẩm [như nấu rượu, làm tĩiưng, mắm, nước mắm, giam, sữa chua, chao, muối dưa, muối cà, ủ phân, ngâm vó cây ỉẩy sợi, xếp ải đất, trồng luân canh với cây họ Đậu...; hoặc sử dụng các biện pháp để ngân chộn tác hợi của vi sinh vật [như ướp muéi thịt, cá, làm múi, phơi khô cù cải, tôm, cá..]. Sau việc phát hiện ra vỉ sinh vật của Leeuwenhoek và việc phát hiện cùa Louis Pasteur về bản chắt của các vi sinh vật, íừ đỏ khai sinh ra ngành Vi sinh vật học [Microbiology], thì nhân loại bắt đầu quan tâm rẩt nhiều đến lĩnh vực khoa học mới mè này. Vi sinh vợt học [rở thành nền [áng cho sự phát triển của Công nghệ sinh học[CNSH]. Ngtỉời ta chia sự phát triển cùa CNSH ra thành 3 giai đoợn: CNSH truyền thống là các quá trình dân dã nhằm chế biến , bào quản các loại thực phẩm, *«■ ỉỷ đất đai, phân bón để phục vụ nông nghiệp...CNSH cận đại là quá trình sử dụng các nồi lên men công nghiệp để sản xuất ở quy mô lởn các sản phẩm sinh học như mỳ chinh, ỉizin và C2C acìd amin khác, các acid hữu cơ, các dung mói hữu cơ, chấí kháng sinh, một số vitamin [như vitamin B2, B I2, c...], nhiều ỉoọi enzym... CNSH hiện đại chìa ra các ỉĩnh vực như CN di truyền [genetic engineering], công nghệ tế bào [cell engineering], công nghệ ertzym và protein [enzyme/protein engineering], CN vi sinh vật/ CN ỉên men [mìcrọbìaỉ engineering / fermentation], CN môi trtỉờng [environmental engineering]. CNSH hiện đại thường gắn liền với các cơ thể mang gen tái tồ hợp [recombination gene]. Vi sinh vệư học ỉà khoa học nghiên cícu về các cơ thể hoặc các nhân tố quá nhỏ đến mức không thấy được bằng mắt thường, tức ìà các vi sinh vật [Microbiology often has been defined as the study o f organisms and agents too small to be seen clearly by the unaided eyethat is, the study a f microorganisms; L.M.Prescott et ai, 2009]. Vi sinh vật học đang đitợc giảng dạy trong râí nhiều trường Đại học, Cao đang, Trung học chuyên nghiệp và cũng được đề cập đền ừ nhiều ở bậc phổ thông. Vi sinh vật học là những kiến thức lièn quan đến cuộc sổng cùa mọi người. Bùn cạnh giáo trình Vi sinh vật học đa được biên soạn từ lâu và đã được lái bán nhiều lần, các tác giả muon cung cap thêm cho

đóng đảo bạn đọc, nhất là các thầy cô giáo đang giảng dạy về Vi sinh vật học tập tài liệu khá chi tiết vò có nhiều tranh ảnh này. Có thể nói đáy là phan [ham khảo để thiết kế các bài giàng nhằm mục tiêu cập nhật được với các tiến bộ khoa học. Để giúp các bạn trẻ tiếp cận được vói sách báo nước ngoài, nhất ỉà cập nhật kiên thức qua Internet các tác già đã cố gắng viết thềm tiếng Anh sau các thuật ngữ khoa học và để nguyên các chú thích tiêng Anh trong hình vẽ. Việc giáo viên hướng dẫn sinh viên điển tiếng Việt vào các hình vẽ sẽ giúp ích rat nhiều cho quá trình tự học của sinh viên. Vì mục đích phi lợi nhuận nên các tác giả xin phép được sử dụng các hình ảnh thu nhận từ mạng Internet vào trong giảo trình này. Vì chất ỉượng tốt của cuốn sách này và vi nhu cầu của đóng đảo sình viên và những cán bộ hoạt động trong các ỉĩnh vực liên quan đến Vi sinh vật học, tôi vui lòng được viết lời giới thiệu n à y. Mong nhận được những ý kiến đóng góp của đông đảo bạn đọc để các lần [ái bản sau sẽ có chất Ittợng tốt hơn nữa.

GS.TSKH. Hoàng Thủy Nguyên Chủ tịch H ội Vi sinh vật học Việt Nam

Chương 13

DINH DƯỠNG CỦA VI SINH VẬT

13.1. YÊU CẦU DINH DƯỠNG CỦA VI SINH VẬT 13.1.1. Thành phần hoá học của tế bào vi sinh vật Cơ sở vật chất cấu tạo nên tế bào vi sinh vật là các nguyên tố hoá học. Căn cứ vào mức độ yêu cầu của vi sinh vật đối với các nguyên tố này mà người ta chia ra thành các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng. Các nguyên tố chủ yểu bao gồm: c , H, 0 , N, p, s, K, Mg, Ca và Fe. Trong sổ này cỏ 6 loại chủ yếu [chiếm đến 97% trọng lượng khô của tế bào vi sinh vật], đó lả c , H, o , N, p và s. Các nguyên tố vi lượng thường là Zn, Mn, Na, Cl, Mo, Se, Co, Cu, w , Br và B. Tỷ lệ các nguyên tố hoá học tham gia cấu tạo tế bào vi sinh vật là không giống nhau ở các nhóm vi sinh vật khác nhau. Ví dụ nấm men, nấm sợi và vi khuẩn cỏ lượng chứa trung bình của 6 nguyên tố chủ yếu là không giống nhau [bâng 13.1]: Bảng 13.1: Lượng chứa trung bình các loại nguyên tố chủ yểu trong tế bào một sổ nhóm vi sinh vật [% trọng lượng khô] Nguyên tố

Vỉ khuẩn

Nấm men

Nấm sợi

-50

-48

-20

~31

-40

-15

-12

-1

Theo các tài liệu của Tempest [1969], Pirt [1975] và Herbert [1976] thì thành phần trung bình cùa các nguyên tố tạo nên tế bào vi sinh vật nói chung là như sau:

___

Bảng 13.2: Thành DỈĩãìĩ các nguyên tô câu tạo nên sinh khôi tê bào

Trung bỉnh

Biên độ

Các nguồn dinh dưõng điển hình được sử dung cho sinh trưỏng v s v trong môi trường

45-58 18-31 5-17

COj, bợp chất hữu cơ H20, 0 2, các hợp chất hữu cơ NH3, NO3-, các họp chất hữu cơ chứa N

H p

6-8 1.2-10

Nước, các họp chất hữu cơ. Photphat và các hợp chất chứa p.

0.3-1.3

S04'2, H2S, và các hợp chất chứa s.

K Mg Ca Cl Fe Na Những nguyên tố khác,Mo, Ni, Co, Mn, Zn,..

1 1

0.2-5 0 . 1- 1.1 0 .02 -2.0

0.5 0.5

0.01-5.0

K+[có thể thay thể bằng Rb+] Mgỉ+ Ca2+ ClFe3+, Fe2+và phức chất của Fe Na+ Lay từ các ion vô cơ khác

% trọng lượng khô* Nguyên tố

0.5

*Cảc tể bào bao gồm 70% trọng lượng ỉà nước và 30% là các ngnyêtt liệu khô khác. Mức trung bình này đuợc tỉnh theo sình trường của vi khuân Gr[~] trong điều kiện dư thừa chất dinh dưỡng ờ nuôi cấy theo mẻ. Vi khuẩn sulfua [sulfur bacteria], vi khuẩn sắt [iron bacteria] và ví khuẩn đại dương [marine bacteria] có lượng chửa các nguyên to s, Fe, Na, C1 nhiều hơn so với các nhóm vi khuẩn khác. Tảo Si lie [diatom] cỏ chứa lượng S1O2 khá cao trong thành tế bào. Thành phần các nguyên tổ hoá học còn thay đổi trong một phạm vi nhất định tuỳ thuộc vào tuổi nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. Khi nuôi cấy trên các môi trường có nguồn N phong phú thì lượng chứa N trong tế bảo sẽ cao hơn so với khi nuôi cấy trên các môi trường nghèo nguồn N. Các nguyên tố hoá học chủ yếu tồn tại trong tế bào vi sinh vật dưới dạng chất hữu cơ, chất vô cơ và nước. Chất hữu cơ thường bao gồm protein, cacbon hydrat, lipit, axit nucleic, vitamin và các sản phẩm phân giải của chúng cùng như các chẩí trao đổi chất. Đe phân tích các thành phân hữu cơ trong tê bào thường sử dụng hai phương pháp: một là, đùng phương pháp hoá học để trực tiếp chiết rút từng thành phần hữu cơ trong tế bào, sau

đó tiến hành phân tích định tính và định lượng. Hai là, phá thành tế bào, thu nhận các thành phần kết cấu hiển vi rồi phân tích thành phần hoá học của từng kết cấu đó. Chất vô cơ thường đứng riêng rẽ dưới dạng muối vô cơ hoặc kết hợp với chất hữu cơ. Khi phân tích thành phần vô cơ trong tế bào người ta thường phân tích tro sau khi đã nung tế bào ở nhiệt độ 550° c, chất vô cơ thu được dưới dạng các oxit vô cơ được gọi là thành phần tro. Dùng phương pháp phân tích vô cơ có thề định tính hay định lượng từng nguyên tố vô cơ. Bảng l3.3:Thảnh phần hóa học của tế bào vi khuẩn [theo F.C.Neidhardt et aL,1996] Phân tử khô [1] / tế bào - Nước

% khối lượng

số phân tử

Số loại phân tử 1

- Các đại phân tử

24 609 802

khoảng 2500

+Protein

2 350 000

khoảng 1850

+Polyxacarit

4 300

2 [2 ]

+Lipit

9,1

22 000 000

4[3]

+ADN

3,1 20,5

2,1

255 500

khoảng 660

+ARN - Các đon phân tử +Axit amin và tiền thể +Đường và tiền thể +Nucleotit và tiền thể - Các ion vô cơ Tổng cộng

3,0

khoảng 350

0,5

khoảng 100

khoảng 50

0,5

khoảng 200

khoảng 18

100

Chủ thích: [1] -Khối lượng khô của tể bào vi khuần Escherichia coli đang sinh trưởng là khoảng 2.8 X 10~l3g. [2] - Giả thiết Peptydoglycan và Glycogen là 2 thành phần chù yếu. [3] - Tế bào chứa vài loại photpholipit, do tính đa dạng của thảnh phần axit béo giữa các chi vi khuẩn khảc nhau và do ảnh hường của điều kiện sinh trưởng mà có nhiều hình thức tồn tại của mỗi loại photpholipit. Nước là thành phần không thể thiếu để duy trì hoạt động sống bỉnh thường của tế bào. Nước thường chiếm đến 70-90% trọng lượng tế bào. Độ chênh lệch giữa trọng lượng tươi và trọng lượng khô chỉnh lả lượng nước trong tế bào, thường biểu thị bàng tỷ lệ % tính theo công thức sau đây: [Trọng lượng tươi - Trọng lượng khô] / Trọng lượng tươi

100%.

Đơn vị trọng lượng tế bào trong dịch nuôi cấy thường được biểu thị bằng đơn vị g/] hay mg/ml. Phương pháp nung khô tế bào ở nhiệt độ 550°c thường làm phân giải một số hợp chất của tế bào vì vậy khi tính trọng lượng khô của tế bào nên dùng phương pháp sấy khô ở 105°c hay làm khô ở nhiệt độ không cao trong chân không, hoặc làm khô nhanh nhờ tia hồng ngoại... 13.1.2. Các chất dinh dưỡng và chức năng sinh lý Vi sinh vật chủ yếu thu nhận được chất dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài. Căn cứ vào chức năng sinh lý khác nhau trong tế bào mà' người ta thường chia các chất dinh dưỡng thành 5 nhóm lớn: 1] Nguồn cacbon [source of cacbon] Là nguồn vật chất cung cấp c ừong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật. Trong tế bào nguồn c trải qua một loạt quá trình biến hoá hoá học phức tạp sẽ biến thành vật chất của bản thân tể bào và các sàn phẩm ừao đổi chất, c có thể chiếm đến khoảng một nửa trọng lượng khô của tế bào. Đồng thời hầu hết các nguồn c trong các quá trình phản ứng sinh hoá còn sinh ra trong tế bảo nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống của vi sinh vật. Một số vi sinh vật dùng C 0 2 làm nguồn c duy nhất hay chủ yếu để sinh trưởng, khi đó nguồn c không phải là nguồn sinh năng lượng. Vi sinh vật sử dụng một cách chọn lọc các nguồn c . Đường nói chung là nguồn c và nguồn năng lượng tổt cho vi sinh vật, Nhưng tuỳ từng loại đường mà vi sinh vật có những khả năng sử dụng khác nhau. Ví dụ trong môi trường chứa glucoz và galactoz thl vi khuẩn Escherichia coli sử đụng trước glucoz [gọi là nguồn c tốc hiệu] còn galactoz được sử dụng sau [gọi lả nguồn c trì hiệu]. Hiện nay trong các cơ sở lên men công nghiệp người ta sừ dụng nguồn c chủ yếu là glucoz, xacaroz, ri đường [phụ phẩm của nhà máy đường] tinh bột [bột ngô, bột khoai sắn...], cám gạo, các nguồn xenluloz tự nhiên hay dịch thuỷ phân xenluloz. Năng lực đồng hoá các nguồn c ở các vi sinh vật khác nhau là không giống nhau. Có loài có khả năng sử dụng rộng rãi nhiều nguồn c khác nhau, nhưng có loài khả năng này rất chọn lọc. Chẳng hạn vi khuẩn Pseudomonas có thể đồng hoá được tới ừên 90 loại hợp chất c , nhưng các vi khuẩn thuộc nhóm dinh dưỡng metyl [metylotrophs] thi chì đồng hoá được các hợp chất 1C như metanol, metan... Nguôn c chủ yeu được vi sinh vật sử dụng gồm cố đường, axit hữu cơ, rượu, lipit, hydrocacbon, CƠ2, cacbonat... [Bảng 13.4]

Bảng 13.4: Nguồn

c đươc vi sinh

vột sử dụng

Nguồn c

Các dạng họp chất

Đường

glucoz, fructoz, mantoz, xacaroz, tinh bột, galactoz, lactoz, mannit, xenlobioz, xenluloz, hemixenluloz, kitin...

Axit hữu cơ

axit lactic, axit xitric, axit fumaric, axit béo bậc cao, axit béo bậc thấp, axit amin...

Rượu

etanol

Lipit

lipit, photphoiipit

Hydrocacbon

khí thiên nhiên, đầu thô, dầu paraíĩn

Cacbonat

NaHC03, CaCOj, đá phấn

Các nguồn c khác

Hợp chất nhóm thơm, cyanit, protein, pepton, axit nucleic...

1.8 JS u 'ọ

bỉ]

4.7 H2 0 -0 ,02 %; NaCl-0,02%; CaS04.2H20-0,01 %; C aC 03-0,5%. Cũng cỏ loại môi trường chọn lọc thêm 10% phenol sẽ làm ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn và vi nấm nhưng lại có thể phân lập được xạ khuẩn. Neu thêm vào môi trường Bi sulphat thi có thể ức chế được các vi khuẩn Gram [+]và phần lớn các vi khuẩn Gram [-], nhưng lại phân lập được vi khuẩn thương hàn [Salmonella typhi]. Thêm vào môi trường Brilliant green hay Crystal violet thì ức chế được vi khuẩn Gram [+] nhưng lại phân lập được vi khuẩn Gram [-]. Thêm vào môi trường Streptomycin thì có thể ức chế được nhiều loại vi khuẩn nhưng Ịậi phân lập được vi nấm. Thêm vào môi trường Na propionat ecrthể ức chế được nấm sợi nhưng lại phân lập được nấm men. Trong Kỹ thuật di truyền [Gentic engineering] người ta thường xuyên sử dụng các môi trường chọn lọc chứa các kháng sinh xác định để tách ra các chủng mang gen tái tổ hợp.

Trong thực tế có nhừng môi trường vừa là môi trường chọn lọc, vừa là môi trường giám biệt. Ví dụ để phân lập tụ cẩu khuẩn vàng [Staphylococcus aureus] người ta thêm vào môi trường 7,5% NaCl, Mannit và chỉ thị màu axit-kiềm. Vi khuẩn này vừa chịu được nồng độ NaCl cao , vừa chuyển hóa mannit thành axit. Sau đây là một số chất được bổ sung vào môi trường [MT] chọn lọc khi cần thiết để phân lập một so nhóm ví sinh vật nhất định: Potassium tellurite [MT Mueller tellurite] để phân lập Corynebacterium diphtheriae\ Tellurite và Crystal violet [MT Mitis-salivaríus] để phân lập Streptococcus', Na azide [MTAzide glucoz] để phản lộp Streptococcus; Phenyletanol [MT Phenyletanol] để phân lập Staphylococcus và Streptococcus; Nước ép cà chua [MT nước ép cà chua] để phân lập vi khuẩn lactic từ nước bọt; Desoxycholate, xitrat [MT Desoxycholate xitrat] để phân lập vi khuẩn đường ruột Gram[-]; Mật[bile]s xitrat, brilliant green [MT SS] để phân lập Salmonella và Shigella', Malachite green dye [MT Lowenstein-Jensen] để phân lập Mycobacterium-, Chloramphenicol [MT Emmơn] để phân lập nấm; Roz Bengal và Streptomycin [MT Martin] để phân lập nẩm...

Corynebacterium diphtheriae. Ngoài các loại môi trường kể trên còn có các loại môi trường đặc biệt khác. Đó là Môi trường phân tích [assay medium] dùng để định lượng vitamin, chất kháng sinh... Đó ]à

Môi trường khử [reduced medium] dùng để nuôi cấy các vi sinh vật kỵ khí. Đó là Môi trường nuôi cấy mô [Tissue-culture medium] chuyên phục vụ cho việc nuôi cấy tế bào và mô động, thực vật, hoặc dùng để nuôi cấy trên tế bào các nhóm vi sinh vật chuyên ký sinh như virút, Chỉamvdìa, Rickettsia, Spirochete. Một số virút và Rickettsia không phát triển được trẽn các môi trường nhân tạo mà phải nuôi cấy trên phôi gà, trên tế bào thận khi, trên cơ thể động vật thực nghiệm. Dưới đây là một vài gợi ý quan trọng khi chuẩn bị môi trường nuôi cẩy. Rất nhiều đường dễ bị phân giải trong quá trình khử trùng ở pH kiềm [đặc biệt với sự có mặt của photsphate vả pepton], làm cho màu môi trường chuyển thành màu nâu và các sản phẩm tạo thành có thể ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật. Để tránh tình trạng đó, người ta khử trùng ở môi trường pH axit nhẹ hoặc khử trùng riêng biệt đối với đường. Tất cả các kim loại vi lượng dề dàng tạo nên muối photphat không tan và kết tủa trong môi trường nuôi cấy. Điều nảy có thể được tránh bàng cách bổ sung thêm các nhân tố có ái lực với kim loại [metal-chelating agents] như là EDTA [Etylen Diamin Tetraaxetic Axit] hay NTA [Nitrilotriaxetic axit] hay đôi khi là các axit cacboxylic như xitrat hay tartrat. Việc thêm các nhân tố này có hiệu quả hai mặt. Một mặt, nỏ ngăn chặn sự kết tủa của các kim loại vi lượng, mặt khác nó hoạt động giống như một bể chứa các kim loại đó, bằng cách này có thể làm giảm tính độc nhờ giảm nồng độ tự do của chúng [tới mức mà các vi sinh vật có thể sử dụng được]. Ở môi trường pH >7, các kim loại kiềm thổ Ca và Mg [dưới dạng vi lượng] dễ dàng kết tủa với sự hiện diện của photphat [hay sự có mặt của ion Cacbonat khi sử dụng môi trường đệm là bicacbonat, hay có sẵn trong nước cứng] tạo nên hảm lượng muối không tan cao. Những kết tủa này đôi khi khó thấy bằng mắt thường, đặc biệt trong các bỉnh nuôi cấy lắc do thể tích nhỏ của môi trường. Để tránh điều này, môi trường cỏ thể được khừ trùng ở pH hơi axit [pH đuợc điều chỉnh sau], hay muối photphat được khử trùng riêng rẽ với môi trường và kết hợp sau khi đã làm nguội. Cần chú ý rằng đa số các môi trường cổ điển sừ dụng trước những năm 60 của thế kỷ trước thường không bao gồm các nguyên tố vi lượng. Sự thêm vào thường là không cần thiết bởi vì các nguyên tố vi lượng đã có chứa sẵn trong các muối không tinh sạch được sử dụng để chuẩn bị cho môi trường. Môi trường hiện nay được chuẩn bị với các muối tinh sạch cao nên không đáng ngạc nhiên là sẽ thất bại trong việc tạo ra nhiều sinh khối sản phẩm nếu không được bổ sung các nguyên tố vi lượng vào trong môi trường. Một ví dụ điển hình lả môi trường cổ điển M9 được sử dụng rất rộng rãi cho sự sinh trưởng của E.coỉi ừong các nghiên cứu đi truyền. Môi trường này không cung cấp thuận lợi các nguyên tố vi lựợng cho sự phát triển của E.colì trong một vài thế hệ, sau đó chúng sinh truởng chậm lại và cuổi cùng ià ngừng lại. 35

13.4. S ự HẨP THƯ CÁC CHÁT DINH DƯỠNG Ở VI SINH VẬT Để tồn tại, sinh trưởng và phát triển, tế bào vi sinh vật phải thường xuyên trao đôi vật chất và năng lượng với môi trường bên ngoài. Một mặt chúng tiếp nhận các chât dinh dưỡng từ môi trường, mặt khác chúng thải ra môi trường một số sản phẩm trao đổi chất. Te bào vi sinh vật sử dụng các chất đinh dưỡng bẳt đầu từ việc hấp thu chúng. Cơ chế của sự hấp thu này có tính chuyên hóa, nói cách khác chúng chỉ hấp thũ các chất cần thiết, việc hấp thu các chất không sử dụng được là bất lợi đối với tế bào. Vi sinh vật thường sống trong các môi trường nghèo chất dinh dưỡng, đo đó chúng phải có năng lực vận chuyển chất dinh dưỡng từ môi trường có nồng độ thấp vào môi trường có nồng độ cao bên trong tế bào, tức là ngược lại với gradien nồng độ. Như thế là giữa trong và ngoài tế bào có một hảng rào thẩm thấu, đó là màng sính chất có tính thẩm thấu chọn lọc' Chúng cho phép các chất dinh dưỡng xâm nhập vào tế bào và cản trở các chất khác. Do tính đa dạng và phức tạp của các chất dinh dưõng nên vi sinh vật có nhiều phương thức khác nhau để vận chuyển các chất dinh dưỡng. Quan ừọng nhất là cách Khuếch tán xúc tiến [Facilitatd diffusion], cách Vận chuyển chủ động [Active transport] và cách Chuyển vị nhóm [Group translocation]. Ở các vi sinh vật có nhân thật không thấy có cách Chuyển vị nhóm nhưng cỏ cách sử đụng quá trình Nhập bào [Endocytosis].Cấu tạo của màng sinh chất được biểu thị qua hình 13.6 sau đây:

Hình 13.6: Cấu trúc cùa màng sinh chất [Theo sách của Prescott, Harley và Klein]. 13.4.1. Sự khuếch tán xúc tiến [Facilitatd Diffusion]

Một số ít các chất, như glyxerol, có thể đi qua màng tế bào chất theo phương thức Khuếch tán bị động [Passive diffusion]. Khuếch tán bị động còn được gọi tắt là Khuyếch tán, đỏ là việc các chất dinh đường chuyển tù chỗ có nồng độ cao đến chỗ có nồng độ thấp. Khuếch tán bị động muốn làm cho tế bào hấp thụ có hiệu quả một số chất dinh dưỡng cần có nồng độ chất này bên ngoài tế bào cao hơn bên trong. Tốc độ hấp thu tùy theo lúc tế bào tăng lượng hấp thu chất này mà giảm xuống. Trừ phi loại chất dinh dưỡng này sau khi xâm nhập tế bào lập tức được sử dụng và không làm nâng cao nồng độ chất đó trong tế bào. Chỉ có nước [H 2O], O 2 và CO2, là nhừng phân tử rất nhò mới thường được vận chuyển qua màng bằng phương thức khuếch tán bị động. Các phân tử tương đổi lớn hơn, các ion và các chất có tính cực [polar substances] khó có thể đi qua màng sinh chất bằng phương thức khuếch tán bị động.

Hình 13.7: Khuểch tản bị động [đường thằng] và khuếch tán xúc tiến [đường cong] [Theo sách cùa Prescott, Harley và Klein]. Protein mang [carrier protein] còn gọi là enzym permez là một loại protein gắn ưên màng. Với sự hỗ trự của permez có thể nâng cao rất nhiều tốc độ khuếch tán qua màng có tính thẩm thấu chọn lọc. Phương thức vận chuyển qua màng với sự hỗ ừợ của permez được gọi là sự khuếch tán xúc tiến [facilitatd diffusion]. Tốc độ của quá trình khuếch tán xúc tiển tăng lên khi sự chênh lệch nồng độ chất dinh dưỡng giữa trong và ngoài tế bào tăng lên. Khi nồng độ các chất dinh dưỡng tương đối thấp thì khuôn khổ tảng lên cao hơn so với phương thức khuếch tán bị động. Lúc gradien nồng độ đạt tới một trị số nhất định thì dẫn đến hiệu ứng bão hòa. Sự tham gia của Permez đã làm dẫn đến hiệu ứng bào hòa [hình 13.7]. 37

Đáng chú ý là, lúc permez bị bão hòa, sự khuểch tán xúc tiến không tăng iên đo sự tăng mức chênh lệch chất dinú dưỡng trong và ngoài tế bào. Quan hệ giữa tốc độ khuếch tán xúc tiến và gradien nòng độ chất dinh dưỡng tưong tự-như mối quan hệ giữa enzym và cơ chất, và khác hẳn với đường biểu diễn thẳng phàn ánh sự khuếch tán bị động. Ngoài ra sự giống nhau giừa permez và enzym còn ờ chỗ có tính chuyên nhât đôi với chât vận chuyến, mỗi loại permez chi có thể vận chuyển một cách chọn lọc đối với một sô chất tương thích. Dù có sự tham gia cùa permez nhưng khuếch tán xúc tiến vẫn đúng ỉà phương thức vận chuyển khuếch tán. Việc vận chuyển vẫn phải dựa vào sự chênh lệch nông độ chất dinh dưỡng giữa trong và ngoài màng. Khi mất đi sự chênh lệch nồng độ sự vận chuyển sẽ đừng lại. Quá trình này không cần tới năng lượng trao đổi chất [metabolic energy] của tế bào. Gradien nồng độ có thể duy trì khi tế bào chuyển biến chất dính dưõng được vận chuyển thành một hợp chất khác hoặc chuyển chất dinh dường đó tới một vị trí khác của màng {ở sinh vật có nhân thật]. Thật thú vị khi thấy một so permez này liên quan đến protein chủ chốt của thau kính mắt ở động vật có vú, đó là các protein thuộc họ MIP. Trong vi khuẩn 2 loại kênh MIP phân bố rộng rãi nhất là aquaporin vận chuyển nước và các nhân tố xúc tiến glyxerol [glyxerol facilitators] vận chuyển glyxerol. Mặc đầu đã có rất nhiều nghiên cứu đổi với cơ chế khuếch tản xúc tiến nhưng quá trình này vẫn chưa được hiểu biết một cách đầy đủ. Hỉnh như phức hợp permez xuyên ngang qua màng tế bào. Sau khi chất đinh dưỡng được kết gắn bên ngoài màng, cấu hình cùa permez phát sinh biến hóa để phỏng thích được chất đinh dưõng vào bên trong màng. Permez sau đó lại hồi phục lại cấu hình ban đàu và sẵn sàng để đón nhận phân tử dinh dưỡng khác bên ngoài màng. Kết quả của quá trình này là một phân tử không tan trong lipit có thể đi vào tế bào đáp lại gradien nồng độ của nó. Nên nhớ ràng, cơ chế này có thể đảo ngược bởi gradien nồng độ, nếu nồng độ một số vật chất trong tế bào cao hơn bên ngoài thì cũng có thể thông qua phương thức này mà chuyển vận ra ngoài tế bào. Vì thông qua hoạt động ừao đổi chất mà tế bào tiêu hao rất nhanh các chất đinh dưỡng đưa vào tế bào nên không cỏ chuyện chất đinh dưỡng bị đưa ngược ra ngoài [hình 13.8]. Ở các sinh vật nhân nguyên thủy quá trình khuếch tán xúc tiến không phải lả phương thức vận chuyển chủ yếu vì nồng độ chất dinh đưomg bên ngoài tế bào thường rất thấp cho nên không thể thực hiện được quá trình khuếch tán xúc tiến để hấp thụ chất dinh dưỡng. Glyxerol được vận chuyển bời quá trình khuếch tán xúc tiến ở E.coli, Salmonella typhimumm, Pseudomonas, Bacillus và nhiều vi khuẩn khác. Sự khuếch tán xúc tiến thường gặp ờ tê bào sinh vật nhân thực, chúng đung phương thức vận chuyển này để chuyển vận các loại đường và axit amin vào tế bào.

! Bèn ngoài tế bao

M ànệsiiih chất

Bên trong tế bào

Hình 13.8. Một kiểu khuếch tản xúc tiến [Theo sách cùa Prescott, Harley và Klein]. 13.4.2. Sự vận chuyển chủ động [Active Transport] Mặc dầu sự khuếch tán xúc tiến giúp chuyển vận có hiệu quả chất dinh dường vào bên trong tế bào khi nồng độ chất hòa tan bên ngoài cao hơn bên trong tế bào, nhưng không thể vận chuyển được chất dinh dưỡng khi nồng độ chất hòa tan trong tế bào cao hom bên ngoài. Vi sinh vật thường sống ừong các môi trưởng có nồng độ chất dinh dưỡng rất thấp, để có thể sinh trưởng và phát triển chúng phải có thể vận chuyển và hấp thu được từ môi trường các chất đinh dường có nồng độ thấp. Khi đó khuếch tán xúc tiến không còn là phương thức vận chuyển hữu hiệu nữa mà phải cỏ những phương thức vận chuyển khác, trong đó quan ưọng nhất là phương thức vận chuyển chủ động [active transpore] và phương thức chuyển vị nhóm [group Ưanslocation]; cà hai phương thức này đều cần tới năng lượng. Sự vận chuyển chủ động là loại phương thức vận chuyển các phân tử chất hòa tan tới nơi có nồng độ cao hơn, tức Jà ngược lại với gradien nồng độ và cần phải tiêu hao năng lượng. Vì sự vận chuyển chủ động cần tới các protein mang [permez] nên tương tự với sự khuếch tán xúc tiến trong một sổ phương diện. Permez có tính chuyên nhất cao đối với các phân tử được vận chuyển. Các phân tử chất hòa tan có tính chất tương tự cỏ thể lên kết với permez trong cả hai trường hợp - khuếch tán xúc tiến và vận chuyển chủ động. Trong trường hợp nồng độ các chất dinh dưỡng khá cao sự vận chuyển chủ động cũng có hiệu ứng bão hòa [hình ỉ 3.9]. Tuy nhiên, sự khác nhau lớn nhất giữa hai loại này là vận chuyến chủ động có thể vận chuyển ngược nồng độ nhưng cần tiêu hao năng lượng trao đổi chất. Các chất ức chế trao đổi chất có thể làm trở ngại việc sản sinh năng lượng do đỏ làm ức 19

chế sự vận chuyên chủ động, nhưng không ìàm ảnh hướng đên quá trình khuêch tán xúc tiến [ngay cả trong thời gian ngắn]. Vi khuẩn, cổ khuẩn và các vi sinh vật nhân thật có các hệ thông vận chuyên protein kết hợp [Binding protein transport systems] hoặc protein vận chuyển hinh hộp kết họp với ATP [ATP-binding cassette transporters] hay còn gọi là protein vận chuyển ABC [ABC transporter]. Loại protein vận chuyển nàv thường được tạo thành một phức thể nhờ sự kêt hợp giữa hai vùng xuyên màng ưa nước [hydrophobic membrane - spanning domain] trên bề mặt tế bào chất và hai vùng gắn với nucleotit [hình 13.9].

Hình ỉ 3.9: Công năng của protein vận chuyển hình hộp có khả năng kết hợp với ATP [Theo sách cùa Prescott, Harley và Klein] [1]=Protein mang chất hòa tan được gắn với cơ chất vận chuyển và hướng đển phức chất protein vận chuyển ABC. [2]=Protein mang chất hòa tan gẳn vào protein vận chuyển và phóng thích cơ chất, chuyển qua màng nhờ năng lượng của sự thủy phân ATP. Vùng xuyên màng hình thành một lỗ nhỏ trong màng và vùng kết hợp nucleotit sẽ gán với ATP Tồi thủy phân ATP để hấp thụ chất hòa tan. Protein vận chuyển ABC tận dụng protein liên kết cơ chất chuyên biệt nằm trên khe chu chất của vi khuẩn Gram âm hoặc bám ưên màng lipit tại mặt ngoài của màng sinh chất ở vi khuẩn Gram dương. Các protein liên kêt này [cũng tham gia vào quá trình hóa hướng động-chemotaxis] sẽ gắn với phân tử được vận chuyên, roi tương tác với protein vận chuyển màng để chuyển phân tử hòa tan vào trong tê bào. Vi khuan E.coỉi đã dùng cơ chế này để vận chuyển nhiều loại đường [arabinoz, mantoz, galactoz, riboz] và axit amin [glutamat, histidin, leuxin].

Các chất đưa vào vi khuẩn Gram [+] phải đi qua màng ngoài truớc khi phát huy tác dụng của protein vận chuyển ABC và các hệ thống vận chuyển chủ động khác. Các phân tử nhỏ có thể sử dụng một protein lỗ phổ biến như OmpF. Các phân tử lớn hơn phải dùng tới các protein lỗ màng chuyên biệt. Trong một số trường hợp, ví dụ việc hấp thu sắt và vitamin B 12 phải dùng tới các protein vận chuyển và protein tiếp nhận màng ngoài có ái lực cao chuyên biệt. Đáng chú ý là protein vận chuyển ABC ở sinh vật nhân thật nhiều khi có tẩm quan trọng lớn trong y học. Một số tế bảo ung thư sử dụng các protein vận chuyển này để bơm thuốc ra. Việc xơ hóa nang là kết quà của một đột biến làm bất hoạt một protein vận chuyển ABC đối với chuỗi chuyển ion clorit trong phổi. Vi khuẩn cũng dùng gradien proton phát sinh ra khi chuyển vận điện từ để thúc đẩy sự vận chuyển chủ động. Các protein vận chuyển màng chịu trách nhiệm đổi với quá trình này thiếu hụt các protein liên kết chu chẩt chuyên biệt để kết họp với các chất dinh dưỡng. Lactoz permez ở vi khuẩn E.coỉi là một ví dụ điển hình. Permez này là một protein đom có phân tử lượng khoảng 30 000. Nó vận chuyển phân tử lactoz khi có một proton xâm nhập tể bào [nồng độ proton cao bên ngoải tể bào là do hoạt động của chuỗi chuyển vận điện tử]. Sự vận chuyển liên kết của hai cơ chất theo cùng một hướng được gọi là vận chuyển đồng hướng [symport]. Trong quá trinh này năng lượng tích tụ trong gradien proton được huy động để vận chuyển vật chất. Mặc dầu cơ chế của phương thức vận chuyển này còn chua được hiểu biết đầy đủ nhưng nới chung được cho rằng proton và permez sau khi kết hợp sẽ cải biển hình dạng và ải lực hấp thụ chất đinh dưỡng. Vi khuẩn E.coỉi cũng dùng sự vận chuyển đồng hướng với proton để vận chuyển axit amin và các axit hữu cơ như xuccinat và malat. Một gradien proton cũng có thể thông qua việc hình thành một gradien ion natri đe gián tiếp tác động lên sụ vận chuyển chủ động {hình 13.10]. Các chất vận chuyển được chuyển xuyên màng theo phương hướng tương phản như vậy được gọi là vận chuyên ngược hướng [antiport]. Gradien natri sinh ra trong ngoài tế bào do hệ thống vận chuyển proton ngược hướng này sẽ có thể đẫn đến việc hấp thu đường và axit amin vào tể bào. Một ion natri có thể liên kết với một protein mang và gây ra sự biến đổi hình dạng. Protein mang sẽ kết hợp mật thiết với đường hay axit amirt và định hướng chúng chuyển vào bên trong tế bào. Do nồng độ natri trong tế bào thấp, ion natri có thể tách rời ra khỏi protein mang và chất dinh dưỡng được vận chuyển cũng được tách ra theo. Cùng với việc ion natri di động vào tế bào vi khuẩn E.coỉi thì protein mang cũng sẽ chuyển đường melibioz và axit amin glutamat vào tế bào này.

dì

Màng sinh chất Ngoại bào [hay khe chu. chất ờ vikhiiẫn] -...... - «• 1

ị

Hình 13. ĨO: Tác dụng của gradien proton và natri trong vận chuyển chù động [Theo sách cùa Prescoti, Harley và Kìeinị. 1- Proton bơm ra ngoài màng sinh chất khi vận chuyển điện từ. 2- Gradien proton thông qua cơ chể vận chuyển ngược hướng [antrport mechanism] để đẩy ion natri ra ngoài. 3- lon natri liên kết với phửc hợp protein mang [carrier protein complex]. 4- Điểm kết hợp với chẩt hòa tan [đung chẩt] biến đồi hình dạng và gắn với dung chất [đường hoặc axit amin]. 5' Cẩu hình của protein mang [carrier] thay đổi, ÌOD natri được chuyển vào trong tế bào và sau đó dung chất cũng rời khỏi protein mang.

Sự vận chuyển đồng hướng [symport] hay vận chuyển hiệp đồng [cotransport] natri cũng là một quả trình quan Ưọng ở các tế bào nhân thật [eucaryotic] khi hấp thu đường và axit amin. Nhưng gradien ion natri thường sinh ra do việc thủy phân ATP chứ không phải do lực chuyển động của proton. Vi sinh vật thưcmg thông qua nhiều hệ thống vận chuyển để hấp thu một chất dinh dưỡng. Ví dụ như ở vi khuẩn E.coìỉ, ít nhất cũng có tới 5 hệ thống vận chuyển để hấp thu đường galactoz, 3 hệ thống vận chuyển để hấp thu glutamat và leuxin, 2 hệ thống vận chuyển để hấp thu ion kali. Khi có nhiều hệ thống vận chuyển như vậy đoi với cùng một cơ chất, các hệ thống cỏ sự khác nhau về nguồn năng lượng tiêu hao, về ái lực đối với chất dinh dưỡng và về phương thức điều tiết hệ thống vận chuyển. Tính đa dạng về các phương thức vận chuyển như vậy đã giúp cho vi sinh vật càng có ưu thể cạnh tranh mạnh mẽ trong điều kiện môi trường dễ biến đổi. 13.4.3. Sự chuyển vị nhóm [Group Translocation] Trong việc vận chuyển chủ động, các phân tử hòa tan vận chuyển qua màng mà không cần cải biến. Nhiều vi sinh vật nhân sơ còn có thể thông qua việc chuyển vị nhóm để hấp thu chất đinh dưõng. Trong quá trình này vật chất được vận chuyển sẽ có phát sinh biến hóa hóa học. Nhóm này có thể xểp vào loại vận chuyển phụ thuộc năng lượng vì cần sử dụng năng lượng trao đổi chất. Hệ thống chuyển vị nhóm quen biết nhất ỉà Photphoenolpyruvat: hệ thống photphotransferaz đường [PTS]. Nhiều loại đường thông qua phương thức vận chuyển này để chuyển vào tế bào vi sinh vật nhân sơ khi bị photphoryl hỏa và sử dụng photphoenolpyruvat [PEP] làm thể cho photphat: PEP + Đường [ngoại bào] -*■ pyruvat + Đường + p [nội bào] PET rất phức tạp, ở vi khuẩn E.coli và Salmonella typhimurium PTS tạo thành bời 2 enzym [EI và Eli] và 1 protein ổn định nhiệt có phân tủ lượng thấp [HPr]. HPr và Enzym EI là tồn tại trong tế bào chất. Enzym Eli có nhiều biến hóa trong cấu trúc, thường đo hợp thành bời 3 tiểu đơn vị [subunits] hay vùng kết cấu [domains], trong đó EIIA [trước đây gọi !à EIII] là protein tế bào chất có thể hòa tan, EIIB cùng là một protein ưa nước [hydrophilic], EIIC ỉà protein kỵ nước năm trên màng tế bảo, hai loại sau thuờng kết hợp lại với nhau. Trong quá trình vận chuyển, dưới tác dụng của EI và HPr một photphat cao năng từ PEP chuyển đến enzym Eli với sự giúp đõ của En2 ym I và HPr. Sau đó E lĩđ ư a 1 phân tử đường qua màng vào tế bào và được photphoryl hóa. Eli chỉ vận chuyển chuyên hóa từng loại đường và ừong các hệ thống PTS khác nhau có cảc Eli khác nhau, còn EI và HPr là giống nhau trong mọi hệ thống PTS.

Hình 13.11: Chuyển vị nhóm [Theo sách Microbiology cùa Prescott, Harley và Klein.] Hệ thống PTS phân bố rộng rãi ở các vi sinh vật nhân sơ. Các chi vi khuẩn Escherichia, Salmonella, Staphylococcus và các vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc [facultatively anaerobic] khác đều có hệ thống PTS. Một số vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, như thuộc chi Clostridium, cũng có hệ thống PTS. Một số vi khuẩn thuộc chi Bacillus có cả hai hệ thong Đường phân [Glycolyse] và PTS. Nhưng các vi khuẩn hiếu khí hầu như không cỏ hệ thống PTS. Nhiều cacbohydrat được vận chuyển bời hệ thống này. Vi khuẩn E.coli hấp thu glucoz, fructoz, mannitol, xacaroz, N-acetylglucozsamin, xenlobioz và nhiều cacbohydrat nằng phương thức chuyển vị nhóm. Ngoài vai trò dùng để vận chuyển, protein PTS còn là cơ quan cảm thụ hóa học - cảm thụ khí trong quá trình hóa hướng động. 13.4.4. Sự hấp thụ sắt [Iron Uptake] Hâu như tât cả vi sinh vật đều cần sử dụng sắt [Fe] để cấu tạo nên các Cytocrom và nhiêu enzym. Săt rất khó hấp thụ vì ion sắt [Fe3+] và các dẫn xuất của chúng rất khó hòa tan, trong môi trường thường có rất ít các hợp chất sắt dễ hòa tan để có thể vận chuyển vào tê bào. Việc hâp thu săt của vi sinh vật là hết sức khó khăn. Nhiều vi khuẩn và nấm phải khăc phục khó khăn này băng cách thông qua thể mang sất [siderophore]. Đó là những 44

phân tử có phân tử lượng thấp lại liên kết với sắt và chuyến vận được vào tế bào, thường đó là các muối hydroxamat hoặc phenolat - catecholat. Ferrichrome là một loại hydroxamat được sinh ra bời nhiều nấm; enterobactin là loại catecholat được sinh ra bởi E.coli... Trong hình bên ta thấy 3 loại thể mang sắt dưới các dạng khác nhau.

Ferrichro fííC

Bitcic-baotỈPì

CHj

I c =

Vé3.

TOa I [ N H - C H j- CO]j P J H - C H - C 0]3

ÍCO-CH—C K j- 0 ]a [lì]

[•1] B itc ro b a c tin -iro ri c o m p le x

Hình ỉ ĩ. 12. Sỉderophore. Khi môi trường cỏ chứa với hàm lượng thấp các sát có thể sử dụng vi sình vật sẽ tiết ra các thể mang sắt [siderophones] để kết hợp với sắt và chuyển đến màng tế bào. Lúc đỏ sẽ kết hợp tiếp với protein thụ thể [receptor-protein] để chuyển sắt vào trong tế bào, hoặc toàn bộ phức thể Sắt-siderophone được chuyển vào trong nhờ một protein vận chuyển ABC [ATP-binđing cassette transporter]. Ở vi khuẩn E.coli thụ thể siđerophone nàm màng 45

ngoài [outer membrane], sau khi Fe3+ được chuyển đến khe chu chất [periplasmic space] thì với sự hỗ trợ cùa protein vận chuyển sắt sẽ được chuyển qua màng sinh chat [plasma membrane], sau đó Fe3+ sẽ được khử thành Fe2+. Vì sất rất cần cho quá trình sinh trưởng, phát triển của vi sinh vật cho nên vi sinh vật cần sử dụng nhiều phưcmg thức hấp thu khác nhau để đáp ứng nhu cầu này.

Chương Ị4

SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT

Sinh trưởng là biểu thị sự tăng trưởng các thành phần cùa tế bào. Đối với các vi sinh vật có hình thức sinh sản bằng này chồi hay phân đôi thì sinh trường dẫn tới sự gia tăng số lượng tế bảo. Tế bào tăng trưởng đến một mức độ nhất định thì sẽ phân cất thành hai tế bào thế hệ con có kích thước hầu như bàng nhau. Đối với các vi sinh vật đa nhân thì sự phân cách nhân không đồng hành với sự phân cắt tế bào - sự sinh trưởng làm tăng kích thước tế bào mà không làm tăng số luợng tế bào. Vì vi sinh vật rất nhỏ bé cho nên là đối tượng rất không thuận tiện để nghiên cứu về sinh trưởng và phát triển. Chính vì vậy mà khi nghiên cứu về sinh trường, người ta thường xét đến sự biến đổi về số lượng của cả quần thể vi sinh vật. 14.1. ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG Sự sinh trưởng quần thể vi sinh vật được nghiên cứu bẳng cách phân tích đường cong sinh trưởng trong một môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp nuôi cấy theo mẻ [batch culture] hoặc trong một hệ thống kín. Có nghĩa 1 I

Hình 14.1: Đường cong sinh trưởng trong hệ thong kín là vi sinh vật được [Theo sách cùa Prescott, Harley và Klein]. nuôi cấy trong một thiết bị kín, trong quá trình nuôi cấy không thay đổi môi trường và thời gian nuôi cấy càng kéo dài thì nồng độ chẩt dinh dưỡng càng giảm sút, các chất phế thải của trao đổi chất càng 47

tãng lôn. Nếu lẩy thời gian nuôi cẩy là trục hoành và lây sô iogarit cùa sô lượng tê bào sống làm trục tung sẽ có thể vẽ được đường cong sinh trưởng của các ví sinh vật sinh sản bằng cách phân đôi. Đường cong này có 4 giai đoạn [phazs] khác nhau. 14.1.1. Giai đoạn Tiềm phát [Lag phaz] Khi cấy vi sinh vật vào một môi trưcmg mới số lượng thường không tăng lên ngay, đó là giai đoạn Tiềm phát hay pha Lag. Trong giai đoạn này tế bào chưa phân cắt nhưng thể tích và khối ỉượng tăng lên rõ rệt đo có sự íăng các thành phần mới của tế bào. Nguyên nhân là do tế bào ở trạng thái già, thiếu hụt ATP, các cofactor cần thiết và riboxom. Thành phần môi trường mới không giống môi trường cũ cho nên tế bào cần một thời gian nhất dịnh để tổng hợp các enzym mới nhằm sừ dụng được các chất dinh dưỡng mới. Các tế bào cũng có thể bị thương tổn và cần một thời gian để hồi phục. Bất kỳ vì nguyên nhân gì thì kết quả vẫn lả tể bào phải tự trang bị lại các thành phàn của mình, tái tạo ADN và bắt đầu tăng khổi lượng. Giai đoạn tiềm phát đài hay ngắn liên quan đển bản thân từng loại vi sinh vật và tính chất của môi trường. Nếu tỉnh chất hóa học của môi trường mới sai khác nhiều với môi trường cũ thỉ giai đoạn tiềm phát sẽ kéo dài. Ngược lại, nếu cấy từ giai đoạn logarit vào một môi trường có thành phần tương tự thì giai đoạn tiềm phát sẽ rút ngắn lại. Nếu cấy vi sinh vật từ giai đoạn tiềm phát hay từ giai đoạn tử vong thì giai đoạn tiềm phát sẽ kẻo dài. 14.1.2. Giai đoạn logarit [Log Phaz] hay Pha chỉ sổ [Exponential Phaz] Trong giai đoạn này vi sinh vật sinh trưởng và phân cắt với nhịp độ tối đa so với bàn tính di truyền của chúng nếu gặp môí trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Nhịp độ sinh trưởng của chúng là không thay đổi trong suốt giai đoạn này, các tế bào phân đôi một cách đều đặn. Do các tế bào sinh ra chỉ khác nhau rất ít cho nên đường cong sinh trưởng là một đường trơn nhẵn chứ không gấp khúc [kình 14.ỉ]. Quần thể tế bào trong giai đoạn này có trạng thái hóa học và sinh lý học cơ bản là như nhau cho nên việc nuôi cấy ở giai đoạn này thường được sử dụng để nghiên cứu sinh hỏa học và sinh lý học vi sinh vật. Sinh trường logarit là sinh trưởng đồng đều, tức là các thành phần tế bào được tổng họp với tôc độ tương đôi ôn định. Nêu cân bằng dinh dưỡng hay các điều kiện môi trường thay đổi sẽ dẫn đến sự sinh trường không đồng đều. Sự sinh trường khi nhịp độ tổng hợp các thành phần của tế bào tương đổi biến hỏa sẽ biến đổi theo cho đến khi đạt tới một sự cân bằng mới. Phản ứng này rất dễ quan sát thấy khi làm thực nghiệm chuyển tế bào từ một môi trường nghèo dinh dưỡng sang một môi trường giàu hom. Tế bào trước hết phải tạo nên các riboxom mới cỏ thể nâng cao năng lực tổng hợp protein, sau đó là sự tăng cường tổng hợp protein và ADN. Cuối cùng tất yếu dẫn đến tốc độ phát triển nhanh chóng.

Lúc chuyển quần thể tế bào từ một môi trường giàu dinh dưỡng tới một môi trường nghèo thì cũng có kểt quả về sự sinh trưởng không đồng đều như vậy. Vi sinh vật trước đó có thể thu được từ môi trường nhiều thảnh phần của tế bào nhưng khi chuyển sang môi trường nghèo chúng cần có thời gian để tạo ra các enzym cần thiểt để sinh tổng hợp các thành phần không có sẵn trong môi trường. Sau đó tế bào mới có thể phân cat, ADN mới có thể tái tạo, nhưng việc tổng hợp protein và ARN là chậm cho nên tể bào nhỏ lại và tổ chức lại sự trao đổi chất của chúng cho đến khi chúng có thể sinh trưởng tiểp. Sau đó sự sinh trưởng càn bằng sẽ được hồi phục và trở về lại giai đoạn logarit. Các thí nghiệm trên đây cho thấy sự sinh trưởng cùa vi sinh vật được kiểm soát một cách chính xác, phổi hợp và phản ứng nhanh chóng với những sự biến đổi của môi trường. Khi sự sinh trưởng của vi sinh vật bị hạn chế bởi nồng độ thấp của các chất dinh dưỡng cần thiết thì sản lượng tế bảo cuối cùng sẽ tăng lên cùng với sự tăng lên cùa các chất dinh dưỡng bị hạn chế [hình Ỉ4.2Ò]. Đây chính là cơ sở để sử dụng vi sinh vật trong việc định lượng vitamin vả các nhân tố sinh trưởng khác. Tốc độ sinh trưởng cũng tăng lền cùng với sự tăng nồng độ các chất dinh dưỡng [hình I4.2b]. Hình dáng của đường cong hầu như phản ánh tốc độ hấp thu chất đinh dưỡng nhờ sự chuyển vận protein của vi sinh vật. Lúc nồng độ chẩt dinh dưỡng đủ cao thỉ hệ thống vận chuyển sẽ bão hòa và tốc độ sinh trưởng không tăng lên cùng với sự tăng lên cùa nồng độ chất dinh dưỡng.

[a ]- Ảnh hưởng cùa sự hạn chế chất dinh dưỡng đối với sản ỉượng chung của vi sinh vật, Lúc nồng độ đủ cao thì sản lượng chung sẽ đạt tới ổn định. [b]- Ành hưởng của sự hạn chế chất dinh dưỡng tới tốc độ sinh trưởng.

14.1.3. Giai đoạn Ỏn định [Stationary Phaz] hay Pha Cân bằng °

Qua giai đoạn Logarìt sự sinh trưởng của quần thể cuối cùng sẽ đừng lại, đường cong sinh trưởng đi ngang [hình ỉ 4. Ị]. Nồng độ vi khuẩn trong giai đoạn ôn định thường vào khoảng 109/ml. Với các vi sinh vật khác thuờng không đạt được đến nồng độ này. Với động vật nguyên sinh và vì tảo thường chi đạt đến nồng độ 106/ml. Đương nhiên, sô lượng tế bào cuối cùng quyết định bởi ảnh hưởng chung của điều kiện dinh đưỡng, chủng loại vi sinh vật và các nhân tố khác. Trong giai đoạn này số lượng tế bào sống là không thay đổi, có thể do số lượng tế bào mới sinh ra cân bằng với số lượng tế bào chết đi, hoặc là tể bào ngừng phân cắt mà vẫn giữ nguyên hoạt tính trao đổi chất. Cỏ nhiều nguyên nhân làm cho quần thể vi sinh vật chuyển sang giai đoạn ổn định. Trong đó nguyên nhân chủ yếu là sự hạn chế của chất dinh dưỡng. Nếu một chất dinh dưỡng thiết yếu bị thiếu hụt nghiêm trọng thì sự sinh trưởng sẽ chậm lại. Vi sinh vật hiếu khí thường bị hạn chế bởi nồng độ oxy. Oxy thường hòa tan ít trong nước, O 2 trong nội bộ môi trường rẩt nhanh chóng bị tiêu thụ hết, chỉ có các vi sinh vật sinh trưởng ở bề mặt môi trường mới có đù nồng độ O 2 để sinh trường. Vỉ vậy khi nuôi cấy vi sinh vật phải sử dụng tới máy lắc hay các biện pháp thông khí khác. Quần thể vi sinh vật cũng có thể bị đình chỉ sinh trưởng khi gặp sự tích lũy của các sản phẩm trao đổi chất có hại. Một số vi sinh vật kỵ khí [như Streptococcus] có thể lên men đường làm sản sinh một lượng lớn axit lactic hay các axit hữu cơ khác, làm axit hỏa môi trường và ức che sự sinh trưởng của vi sinh vật. Đồng thời sự tiêu hao hết đường cũng làm cho tể bào đi vào giai đoạn ổn định. Sau nữa là, một số chửng cứ cho thấy khi số lượng vi sinh vật đạt đến một giới hạn nhất định thì sự sinh trưởng có thể bị đình chỉ. Sự sinh trưởng của vi sinh vật chuyển sang giai đoạn ổn định có thể do kết quả chung của rẩt nhiều nhân tố khác nhau. Như chúng ta.đã thấy vi khuẩn khi nuôi cấy theo mẻ sẽ chuyển sang giai đoạn ổn định khi thiếu thức ăn. Trong tự nhiên, đo nhiều môi trường có nồng độ chất dinh dưỡng rất thấp nên vi sinh vật thường chuyển sang giai đoạn ổn định. Đổí với vi khuẩn việc chuyển sang giai đoạn ổn định có thể là một loại thích ứng tốt. Nhiều loại vi khuẩn không có sự biến hóa rõ rệt về hình thái [như hình thành bào tử nội sinh-endospore] nhưng chúng có thể thu nhỏ kích thước lại, thường đo chất nguyên sinh co lại và nhân giả [nucleoid] đậm đặc lại. Một biến đổi quan trọng hơn là, khi thiếu thức ăn vi khuẩn sẽ sinh ra một loại protein đoi [starvation proteins] lam cho te bào đê kháng nhiêu hơn với các thương tổn bàng nhiều con đường khác nhau. Chúng làm tãng các liên kểt peptidoglycan và sự bền vừng của thành tế bào. Chẩng hạn Dps [ADN-binding protein from starved cells], một ỉoại protein kết hợp với ADN lấy từ các tế bào đói, có thể bảo vệ cho ADN. Phân tử Chaperon cản trở sự biến tính của protein và hồi phục lại được các protein bị tổn thương. Vì những 50

việc đó và nhiều cơ chế khác mà các tế bào đói có thể khó bị chết đi và đề kháng được với tình trạng bị đói, với sự biến hỏa của nhiệt độ, sự tổn thương về oxy hỏa và sự thẩm thấu, cũng như tăng sức đề kháng với các hóa chất có hại [như clorit chẳng hạn]. Những cải biến này rất có hiệu quà và làm cho một số vi khuẩn có thế sống lại sau vài năm bị đói. Rõ ràng việc hiểu rò những vấn đề này sẽ có tầm quan trọng thực tiễn to lớn đổi với y học và vi sinh vật học công nghiệp. Chúng còn có thể chứng minh vi khuẩn thương hàn [Salmonella typhimurỉum] và nhiều vi khuẩn gây bệnh khác cỏ thể có khả năng gây bệnh mạnh hơn khi bị đói. 14.1.4. Giai đoạn tử vong [Death Phaz] Việc tiêu hao chất dinh dưỡng và việc tích lũy các chất thài độc hại sẽ làm tổn thất đen môi trường sống cùa vi sinh vật, làm cho số lượng tế bào sống giảm xuống. Đó là đặc điểm của giai đoạn tử vong. Giống như giai đoạn logarit, sự tử vong của quần thể vi sinh vật cũng cỏ tính logarit [tỷ lệ tế bào chết trong mỗi giờ là không đổi]. Tồng số tế bào sống và tế bào chết không thay đổi vì các tế bảo chết chưa bị phân hủy. Muốn xác định số lượng tế bào sống phải pha loãng ra rồi cay lẽn thạch đĩa và đưa vào điều kiện thích hợp để xác định số khuẩn lạc xuất hiện. Mặc dầu phần lớn vi sinh vật tử vong theo phương thức logarit nhưng sau khi số luợng tế bào đột nhiên giảm xuống thì tốc độ chết của tế bào chậm lại. Đỏ là do một số cá thể sống lại nhờ có tính đề kháng đặc biệt mạnh. Vì điều này và nhĩmg nguyên nhân khác làm cho đường cong của giai đoạn tử vong có thể khá phức tạp. 14.1.5. Tính toản về quá trình sinh trưởng Không ít các nhà vi sinh vật học đã tính toán về tốc độ sinh truờng của vi sinh vật ừong giai đoạn logarit. Tịnh toán nhịp độ sinh trưởng sẽ làm cơ sở cho các nghiên cứu về sinh lý học, sinh thải học vi sinh vật, và còn để giải quyết một số vấn đề ứng dụng trong sản xuất công nghiệp. Trong giai đoạn logarit mỗi cá thể vi sinh vật tiến hành phân cắt trong một thời gian hằng định, sổ lượng tế bào tăng theo phương thức 2n. Thời gian giữa hai lần phân chia liên tiếp hay thời gian cần cho sự tăng đôi sổ tế bào được gọi là thời Igian thế hệ [genration time hay doubling time]. Ví dụ đưa một tế bào vào môi trường nuôi cấy, cứ 20 phút phân cát một lần thì sau 20 phút cỏ 2 tế bào, sau 40 phút có 4 tế bào và tiểp tục như vậy [bảng Ĩ4.Ị].

Thòi gian*

Số lần phân cắt

số lượng [No X2"]

IglD N,

2°-ỉ

0,000

2'=2

0,301

23=4

0,602

23-8

0,903

t* II Ch

1,204

100

25=32

1,505

120

K]oII

Bảng 14.1: Một ví dụ về sinh trưởng theo logarỉt

1,806

* Thời gian thế hệ là 20 phút, giả thiết là nuôi cấy từ ỉ tế bào Số lượng logarit tế bào là 2n, n là số thế hệ. Có thể biểu thị các số liệu trong bảng ỉ 4.1 bàng công thức sau đây: N, = N 0 X 2"

Trong đó: No là số lượng tế bào ban đầu; Nt là số lượng tế bào ở thời gian t; n là số thế hệ. Từ công thức trên có thể biến đổi như sau và số thế hệ n được tính bằng logarit thập phân: log

\= log Nữ+n log 2

n - ĨQg Nĩ - Ịọg log 2

_ log

- ĩog N n 0,301

Khi nuôi cây phân mẻ [batch culture] tôc độ sinh trưởng trong giai đoạn logarit có thể biểu thị băng hảng sổ tổc độ sinh trưởng bình quân k [mean growth rat constant k]. Đó là sô thế hệ sinh ra trong đơn vị thời gian, thường biểu thị băng số thế hệ trong 1 giờ: h _n t

log#, - logjyn 0,301 t

Thơi gian cân thiêt đê tăng gâp đôi tông sô tế bảo là thời gian thế hệbình quân [mean genration time] hay thời gian tãng gâp đôí bình quân[meandoubling time] và được biểu thị bằng g. Nếu t=g thì N,= 2N0. Thay vào công thức ữên ta có: k _ log [2N ồ] - log N0 0>30l£

lo g

2 + log Nữ - log Nn 0,301 g

Thời gian thể hệ bình quân là đảo sổ của hàng số tốc độ sinh trưởng bình quân: g

_Ị_

Thời gian thể hệ bình quân g có thể căn cứ trực tiếp vào đồ thị bán logarit [semilogarithmic plot] và hàng số tốc độ sinh truởng để tính ra [hình 14.4]. Ví dụ ,số lượng vi khuẩn tại giờ thử 10 là từ 103 tăng lên đến 109 t h ì : k=

Log 10ọ - loglO3 [0,301][10h]

_ 9 -3 3.01/1

\= 2.0 [thế hệ/h]

g = — = 0.5 giờ/thế hệ hay 30 phút/thế hệ

[Theo sách của Prescott,Harley và Klein].

trưởng cùa vi sinh vật Lắỹ thời gian là trục hoành và lay so lượng tế bào làm trục tung. Thời gian tăng gấp đôi số lượng của quần thế [thời gian thế hệ] cỏ thể đọc trực tiếp trên đồ thị.

Thời gian thế hệ thay đổi tùy theo chủng loại vi sinh vật, điều kiện nuôi cấy. Một số vi khuẩn thời gian thế hệ không quá 10 phút [0,17h] trong khi ờ một sổ vi sinh vật nhân thực [eucaryotic] lại dài tới vài ngày [Bảng 14.2]. Thời gian thế hệ trong tự nhiên thường là dài hơn so với khi nuôi cay.

Bảng 14.2: Thời gian thể hệ của một số loài vi sinh vật Vi sinh vật

Nhiệt độ [°C]

Thòi gian thế hệ [giờ]

Vi khuẩn và Vi khuẩn lam Beneckea natriegens

0,16

Escherichia coỉi

0,35

Bacillus subíỉlis

0,43

Staphylococcus aureus

0,47

Pseudomonas aeruginossa

0,58

Clostridium botuỉinum

0,58

Rhodospiriỉỉum rubrum

4,6-5,3

Anabaena cylindrica

10,6

Mycobacterium tuberculosis

Khoảng 12

Treponema paìỉidum

Tảo Scenedesmus quadricauda

5,9

Clolìa pyrenoidosa

7,75

Asterioneỉỉa formosa

9,6

Euglena gracilis

10,9

Ceratỉum tripos

82,8

Động vật nguyên sinh Tetrahymena geỉeiỉ

2,2-4,2

Leishmania donovani

10-12

Paramecium caudatum

10,4

Acanthamoeba castellaniì

11-12

Giardia lambỉia

Nấm Saccharomyces cerevisiae

Monilinia Jructicola

14.2. XÁC ĐỊNH s ự SINH TRƯỞNG CÙA VI SINH VẬT Có nhiêu cách thông qua việc xác định sự biến đổi số lượng và chất lượng vi sinh vật đe hieu được sự sinh trưởng của vi sinh vật, biêt được tốc độ sinh trưởng vả thời gian thế hẹ, Dươi đây sẽ giới thiệu các phương pháp thường dùng nhất cùng các ưu, khuyết điểm

cùa các phương pháp này. Không có phương pháp nào là tốt nhất, lựa chọn phương pháp nào còn phụ thuộc vào từng trường hợp cụ thể. 14.2.1. Xác định số lượng tế bào Phương pháp đơn giản nhát đê xác định số lượng tế bào là đếm trực tiếp dưới

.Lá kính

kính hiển vi. Dùng các phòng đếm để đếm vừa nhanh chóng, dễ dàng, lại rẻ tiền nhất, lại có thể quan sát thấy kích cõ và hình dáng tế bào. Thường dùng phòng đếm

Phòng đếrti chúa vi khuân

í*]

Petroff-Hausser để đếm tế bào động vật nguyên sinh. Dùng phòng đếm hồng càu cỏ thể đếm được các tế bảo nhân nguyên thủy cũng như tế bào nhân thật. Với tế bào nhân nguyên thủy cần nhuộm màu hoặc là dùng kỉnh hiển vi tương phản pha hay kính hiển vi

huỳnh

quang

[phaz-constrast

fluoresence microscope] để dễ quan sát hơn. Phòng đếm có cấu trúc để có một độ sâu nhất định lại có chia ra thành các ô nhỏ {hình ỉ 4.5]. Khi đếm số lượng ta đưa dịch -

pha loãng vào phòng đếm, đậy lá kính i

[lamelle/ cover glass] lên trên, sau đó tiến hành đếm số lượng dưới kính hiển vi.

' “T sss Bpn —

"T &

1 9Hầ

Khuyết điểm của phương pháp này là không xác định được với các mẫu có sổ lượng vi khuẩn quá nhỏ, độ chính xác cũng không cao vì không phân biệt được giữa tế bào sống và tế bảo chết.

r? pn n | “ j m u _L„ Mi mSỀ

imm

•

ỉ

1 -

ị

¥^ 1

•4

J_ Tj “tr 'i.

m WÊếm H* m a Ỉ1R I m rr ư u rr~ H ỉ 0 H Ị ị * T ị LillJ I ___ __i_>_ *1 '

Hình 14.5: Phòng đếm Petrojf-Hauser: [a]- Mặt nhìn nghiêng cùa phòng đếm- Phòng đếm chứa dịch huyền phù vi khuẩn là khoáng không gian bẽn dưới lá kính; [b]- Giữa phiển kính có phòng đếm với các ô nhò; [c] Ờ độ phóng đại khoảng X 400-500 tiến hành đém số htợvg vì khuân trong các ô nhỏ. Lay sô lượng bình quân để tinh ra mật độ vi khuân trong mâu vật. Trong phợm vi ỉmm có 225 ô nhỏ, do đó so lượng vi kỉiuấn 55

trên ỉmm2 lử [số vi khuẩn/mm] X 25; V ỉ' phòng đếm có chiều dầy là ọ,02mm cỉo đó nồng độ vi khuân trong phòng đếm là: [số vi khuàn]/m■X 25 [tông số ô nhò] X 50= sú vỉ khuân/mm3. Vi ỉ cm 3= l m m 3 X 103cho nên giả thử sổ lượng vi khuẩn bình quân trong mỗi ô nhỏ là 28 thì trong 1 cm 3 có nồng độ vi khuẩn là 28 X 25 X 50 x io 3— 3,5 X 107vi khuân. Nhân với độ pha loãng

ban đầu [nếu có] sẽ biết được nồng độ vi khuẳn trong mẫu kiểm tra. Với động vật nguyên sinh, vi tảo và nấm men có thể đùng máy đếm điện tử như loại máy Coulter Counter để xác định số lượng. Nguyên lý là hai bên mỗi lỗ nhỏ có điện cực và nối điện. Khi tế bào trong dịch huyền phù đi qua lỗ nhỏ thì cứ mỗi tế bào đi qua thì điện trở lại tăng lên [hoặc tính dẫn điện giảm xuống] và sinh ra một tín hiệu điện, máy đếm sẽ tự động ghi số. Kểt quả xác định của loại máy này khá chính xác, có thể ứng dụng rộng rãi để xác định số lượng hồng càu và bạch cầu, nhưng phương pháp này không thích hợp xác định số lượng vi khuẩn vì dễ bị can thiệp bởi các hạí nhỏ và các vật chất dạng sợi trong mẫu vật. Cả hai phương pháp nói trên đều không phân biệt được tể bào sống và tế bào chết. Đê xác định số lượng tể bào sống người ta thường dùng phương pháp cấy dịch pha loãng lên bề mặt môi trường thạch đĩa. Sau khi nuôi cấy mỗi vi khuẩn sẽ tạo thành 1 khuẩn lạc. Ví dụ ở độ pha loãng 1 X 10-6 đếm được 150 khuẩn lạc thì cỏ nghĩa là mật độ vi khuẩn trong mẫu là 1,5 X 108. Dùng dụng cụ đếm khuẩn lạc càng thêm thuận tiện. Phưcmg pháp này cho biết số lượng các tế bào sổng của vi sinh vật. Phương pháp này đơn giản, nhạy cảm và thích hợp ứng dụng rộng râi để xác định số lượng vi sinh vật sống khi phân tích các mẫu thực phẩm, nước, đất...Tuy nhiên kết quả cũng chịu ảnh hưởng của một sổ nhân tố. Nếu vi khuẩn dính thành khối không tách rời nhau ra thì kểt quả thu được là thẩp hơn thực tế, vì mỗi khuẩn lạc không phát triển từ một tế bào riêng rẽ. Vì vậy kết quả thu được từ phương pháp này được coi là sô đơn vị hình thanh khuẩn lạc [CFU-colony forming unit]. CFƯ không hoàn toàn phù hợp với sô tê bào song trong mẫu vật. Trong quá trinh sử dụng phương pháp này nên sủ đụng độ pha loãng nào cho sô khuân lạc xuất hiện trên đĩa chỉ nằm trong phạm vi khoảng 30-300 mà thôi. Đương nhiên môi trường dinh dưỡng không thể đáp ứng chung cho mọi loại vi sinh vật, do đó kêt quả thu được bao giờ cũng thẩp hom thực tế. Khi trộn thạch VỚI dịch pha loãng thì thạch đã đủ nguội để không làm chết vi khuẩn hay làm thương tôn VỚI một sô loại mân cảm với nhiệt độ. Việc cấy dịch pha loãng trên bề mặt rồi dàn đều bang que gạt thuy tinh thường cho kêt quả cao hơn vê sô lượng vi sinh vật so với phương pháp trộn với môi trường thạch chưa đông.

Hình 14.6: Tách khuẩn lọc và phương pháp kiểm tra số lượng vi sinh vật thông qua đếm khuẩn ỉạc mọc trên mỏi trường thạch đĩa. [a [b]- Cách ria cạy đe tách khuẩn lạc riêng rẽ [không dùng để đếm sổ lượng] [c][d]~ Cách pha loãng rồi trộn với mỏi tricờng thạch chưa đông. [e][f]- Cách dàn dịch pha hãng bằng que gọt trên mật [hạch [cho sổ htựng khuẩn lạc nhiều hơn]. Theo sách của K.P. Talơro,2005. Đe xác định sổ hrợng vi sinh vật còn có thể nuôi cấy giấy lọc đã lọc dịch pha loăng mẫu vật. Phương pháp này gọi là phương pháp màng lọc [membrane filter]. Dùng một thiết bị lọc đậc biệt đặt vừa một giấy lọc hình tròn có các lỗ nhỏ hơn kích thước vi khuẩn và các vi sinh vật khác. Sau khi lọc đặt giấy lọc lên môi trường thạch thích hợp hoặc thấm ướt màng lọc băng dịch môi trường thích họp rồi để nuôi cấy 24 giờ. Đếm sổ khuần lạc mọc ưên giấy ìọc để tính ra mật độ vi khuẩn sổng có mặt trong mẫu vật [hình 14.7].

úynùị \

■

lọc ravẲ ÍỊÍ Ỹằữ ÍÍI c k íi

Hiôitiròng Đ ịittá n ịlọ c v ù

thiết ỵ lọc

Dịch r a il v ít b c qua

nuôi u y

[ÌÚđlltOỊI.

|* * & 2 > ì «à«lọc[0.45[il]

\ 'ì Hình 14.7: Phương pháp ỉọc màng để xác định sổ lượng vi sinh vật Phương pháp này thích hợp để sử dụng phân tích vi sinh vật trong nước. Có thể dùng các môi trường khác nhau thích hợp với các nhóm vi sinh vật khác nhau [hình ỉ 4.8].

fl>]

[e]

[dì

Hỉnh Ị 4.8: Các loợi khuẩn ỉạc mọc trên màng lọc. Theo sách cùa Prescott,Harley và Klein [2005] [a]~ Tồng sể vi khuẩn mọc trên môi trường tiêu chuẩn, dùng chi thị màu để nhuộm đỏ khuẩn lạc cho dè điềm; [b]- Dụng môi trưởng thích hợp để kiểm tra nhóm vi khuẩn coliform có nguồn gốc từ phân [khuẩn ỉợc bắt màu xanh]; [c]~ Dũng mói trường thạch m-Endo đế xác định vi khuẩn E.coỉi và các Coli/orm kháckhuẩn ỉạc cô màu lục; [á]- Nắm sợi và nẩm men mọc trên môi trường Thạch - Mạch nha. Phương pháp màrtg lọc còn dùng để đếm trực tiếp vi khuẩn. Dịch mẫu vật được lọc qua một màng polycacbonat màu đen. Vi khuẩn trên màng lọc được nhuộm màu huỳnh quang băng thuoc nhuộm acridin da cam hoặc DAPI [diamidino-2-phenylindole]. Quan sát dưới kính hiên vi huỳnh quang có thể thẩy các tế bào vi sinh vật hiện lên màu da cam hay

màu lục trên một nền đen. Hiện đã có những kit thương mại cho phép phân biệt tể bào sống và tế bào chết khi kiểm tra. 14.2.2. Xác định khốỉ lượng tế bào Sự sinh trưởng của vi sinh vật không chỉ biểu hiện ở số lượng tể bào mà còn ờ cà sự tăng trưởng của tổng khối lượng tế bào. Phương pháp trực tiếp nhất là xác định trọng lượng khô của tể bào. Trước hết cần ly tâm để thu nhận sinh khối tể bào. Sau đó rừa tế bào rồi làm khô trong lò sấy rồi cân trọng lượng khô. Phương pháp này thích hợp để xác định sự sinh trường của nấm. Phương pháp này tốn thời gian và không thật mẫn câm. Đổi với vi khuẩn vì trọng lượng từng cá thể là rất nhỏ, thậm chí phải ly tâm tới vài trăm ml mới đù số lượng để xác định ừọng lượng sinh khối khô. Thang chĩa độ cùa quang phổ kế

p ỉ í

Đèo

ống đựng địch huyền phù vi khuẩn

Tế tào quang điện hay bộ tách sóng

Hình Ỉ4.9: Đo sổ ỉượng vi sinh vợt bằng phương pháp đo độ đục. Phương pháp nhanh hơn, mẫn cảm hem là dùng phương pháp đo độ đục nhờ tán xạ ánh sáng. Mức độ tán xạ ảnh sáng tỷ lệ thuận với nồng độ tế bào. Lúc nồng độ vi khuẩn đạt đến 107 tế bào/ml thi địch nuôi cẩy sẽ vẩn đục, nồng độ càng tăng thì độ đục cùng tãng theo và làm cản trở ánh sáng đi qua địch nuôi. Có thể đo độ tán xạ ánh sáng bằng quang phổ kế [spectrophotometer]. Ở một mức độ hấp thụ ánh sáng thẩp, giữa nồng độ tế bào và 59

giá trị hấp thụ ánh sáng có quan hệ tuyến tính {hình Ỉ4.9]. Chi cần nồng độ vị sinh vật đạt tới nồng độ có thể đo được là đều có thể dùng phương pháp đo độ đục trên quang phô kê để xác định sự sinh trưởng của vi sinh vật. Nếu hàm lượng một số vật chất trong mỗi tể bào là giống nhau thì tổng lượng chất đó trong tế bào có tương quan trực tiêp với tông sinh khối vi sinh vật. Chẳng hạn, thu tế bào trong một thể tích nhất định của dịch nuôi cấy, rửa sạch đi rồi đo tổng lượng protein hay tổng lượng nitơ, có thể thấy sự tăng quần thể vi sinh vật là phù hợp với sự tăng tổng lượng protein [hay N]. Cũng tương tự như vậy, việc xác định tổng lượng chlorophyl có thể dùng để đo sinh khối tảo; đo hàm lượng ATP có thể biết được sinh khối của các vi sinh vật sống. Thông qua việc đo độ hấp thụ ánh sáng có thể xác định được sinh khối vi sinh vật. Khí số luợng tế bào tăng lên sẽ dẫn đến việc tăng độ đục, mức độ tán xạ ánh sáng nhiều hơn và quang phổ kế sẽ đo được mức độ tăng lên của trị số hấp thụ ánh sáng. Trên quang phổ kế có hai thang chia độ: phía dưới là trị số hấp thụ ánh sáng, phía trên là mức độ thấu quang. Khi trị số hấp thụ ánh sáng tăng lên thì mức độ thấu quang hạ xuống. 14.3. NUÔI CÁY LIÊN TỤC VI SINH VẶT Trong các phần trên chúng ta xem xét việc nuôi cấy phân mẻ [batch cultures] trong các hệ thống kín, tức là không có chuyện bổ sung chất dinh dường, cũng không thải loại các sản phẩm có hại sinh ra trong quá trình sổng. Giai đoạn logarit chỉ duy trì qua vài thế hệ sau đó chuyển vào giai đoạn ổn định. Nếu nuôi cấy vi sinh vật trong một hệ thống hở, trong quá trình nuôi cấy thường xuyên bổ sung chất dinh dưỡng và thải loại các chất cặn bã thì có thể làm cho môi trường luôn giữ ả trạng thái ổn định. Đó là hệ thống nuôi cấy liên tục [continuous culture system]. Trong hệ thống này sự sinh trưởng của vi sinh vật luôn giữ được ờ ừạng thái logarit, nồng độ sinh khối vi sinh vật luôn giữ được ồn định trong một thời gian tương đối dài. Giả thử ta có một bình nuôi cấy trong đó ví khuẩn đang sinh trường, phát triển. Ta cho chảy liên tục vào bình một môi trường mới có thành phần không thay đổi. Thể tích bình nuôi cây giữ ôn định. Dòng môi trường đi vào bù đáp cho dòng môi trường đi ra với cùng một tốc độ. Ta gọi thể tích của bình là V [lit], tốc độ dòng môi trường đi vào là f [lít/ giờ]. Tốc độ [hay hệ số] pha loãng được gọi là D [f/v]. Đại lượng D biểu thị sự thay đổi thể tích sau 1 giờ. Nêu vi khuân không sinh trưởng và phát triển thì chủng sẽ bị rút dàn ra khỏi bình nuôi cấy theo tốc độ: v = — = D .ỵ dt X là sinh khối tế bào. Người ta thường dùng hai loại thiết bị để nuôi cấy liên tục vi sinh vât. Đó là Chemostat và Turbiđostat.

14.3.1. Chem ostat Khi sử dụng Chemostat để nuôi cấy vi sinh vật người ta đưa môi trường vô khuẩn vào bình nuôi cấy với lượng tương đương với tốc độ đưa môi trường chửa vi khuẩn ra khỏi bỉnh nuôi cấy [xem hình Ì4.Ỉ0]. Trong môi trưcmg một số chất dinh dường thiết yếu [như một vải axit amin ] cần khống chế nồng độ trong một phạm vi nhẩt định. Vì vậy tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật trong hệ thống quyết định bởi tốc độ môi trường mới được đưa vào hệ thống và nồng độ tế bào phụ thuộc vào nồng độ các chất dinh dưỡng được hạn chế. Nhịp độ đổi mới chất đinh dường biểu thị bởi nhịp độ pha loãng D [dilution rat]. Tốc độ ỉưu thông của chất dinh dưỡng [ml/h] được biểu thị bằng/và thể tích bình nuôi cẩy là V [ml]: D ^ f/V

Chẳng hạn n ế u /là 30ml/h và V là 100ml thì nhịp độ pha loãng D là 0,30h‘l. Cà số lượng vi sinh vật và thời gian thế hệ đều có liên quan đến nhịp độ pha loãng {hình Ị 4. ỉ ỉ]. Trong một phạm vi nhịp độ pha loãng tương đối rộng thì mật độ vi sinh vật trong hệ thống là không thay đổi.. Khi nhịp độ pha loãng tăng lên, thời gian thế hệ hạ xuống [tốc độ sinh trưởng tăng lên], khi đó chất dinh dưỡng hạn chế bị tiêu hao hết. Neu nhịp độ pha loãng quá cao thì vi sinh vật bị loại ra khỏi bỉnh nuôi cấy trước khi kịp sinh sôi nẩy nở bởi vì lúc đó nhịp độ pha loăng cao hơn tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật. Nồng độ các chất dinh dường hạn chế tăng lên khi nhịp độ pha loãng tăng cao vì có ít vi sinh vật sử dụng chúng. Turbidoslal

Chemastat

■ "à Dụng cụ lọc

.Dõng mùi Iruủng vàõdữlỂ bảo quangđiện

Môi trường mớì

điều chình Ĩ T Ĩ I — Bình mỏi trucng

V an kiểm soát

Không khi vầo

\==53--.. y Bỏ phận điều chinh 11 ' dòng mõi trường vào Không khí váo

Cụng cấp khí Cấu tạo íúl ách vi khuẩn

Không khi ra

Bĩnh nuôi

*■ iVlôi

trưđíig ra

\J X » —

n , I

■

Binh nuôi cáy

—

U j Té bão ] quang diện l__Biểu l __ Oil chinh -

Hình 14.10: Nuôi cấy Hên tục trong Chemostal và Turbidostat.

—

Bình tiếp n h ậ n !

Hình ỉ 4.1 ì: Hệ thống nuôi cấy liền tục [Chemostat].

Khi nhịp độ pha loãng rất thấp thì nếu tăng nhịp độ pha loãng sẽ làm cho cả mật độ tế bào và tốc độ sinh trưởng đều tăng lên. Đó là do hiệu ứng của nồng độ chất dinh đường đối với nhịp độ sinh trưởng [growth rat]. Quan hệ này có ỉúc được gọi là quan hệ Monod [Monod relationship]. Trong điều kiện nhịp độ pha loãng thấp , chỉ có ít ỏi chất dinh dưỡng được cung cấp thì tế bào phải đùng phần lớn năng lượng để duy tri sự sống chứ không dùng để sinh trường, phát triển. Lúc nhịp độ pha loãng tăng lên, chất dinh dưỡng tăng lên, tế bào có nhiều năng lượng được cung cấp, không những để duy trì sự sống mà còn có thể dùng để sinh trưởng, phát triển, làm tăng cao mật độ tể bào. Nói cách khác, khi tế bào có thể sử đụng nãng lượng vượt quá năng lượng duy trì [maintenance energy] thì nhịp độ sinh trưởng sẽ bát đầu tăng lên.

Nhịp độ pha loãng

Hình 14. Ị2: Tỳ lệ pha ỉoàng trong chemostat và sinh trưởng cùa Vỉ' sinh vật. 14.3.2. Turbỉdostat Turbidostat là loại hệ thống nuôi cấy liên tục thứ hai. Thông qua tế bào quang điện [photocell] để đo độ hấp thụ ảnh sáng hay độ đục trong bình nuôi cấy để tự động điểu chỉnh lưu lượng môi trường dinh dưỡng, làm cho độ đục hay mật độ tế bào giữ ở mức độ như dự kiến. Turbỉdostat và Chemostat có nhiều điểm khác nhau. Trong hệ thống Turbidostat môi trường không chửa các chất dinh dưỡng hạn chế, nhịp độ pha loãng không cổ định. Turbidostat hoạt động tổt nhất khi nhịp độ pha loẫng cao trong khi Chemostat lại ổn định nhất và hiệu quả nhất khi nhịp độ pha loãng tương đối thấp.

Hệ thống nuôi cấy liên tục là rất có lợi vi các tế bào luôn ở trạng thái sinh trưởng thuộc giai đoạn logarit. Hơn nữa có thể dùng làm mô hình để nghiên cứu sự sinh trưởng của vi sinh vật trong điều kiện nồng độ chất dinh dưỡng thấp tương tự như ở môi trường tự nhiên. Hệ thống nuôi cấy liên tục rất cỏ ích trong việc nghiên cứu nhiều ITnh vực khác. Chẳng hạn, để nghiên cứu tác dụng tương hồ giữa các loài vi sinh vật trong điều kiện môi trường tương tự như môi trường nước ao hồ nước ngọt. Hệ thống nuôi cấy liên tục đă được sử dụng trong các ngành vi sinh vật học công nghiệp và thực phẩm. 14.4. ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC NHÂN TỚ MỒI TRƯỜNG ĐÉN s ự SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẶT Như chúng ta đã biết ví sinh vật có khả năng đáp ứng với sự biến hóa của nồng độ chất dinh dưỡng, nhất là các chất dinh dư&ng hạn chế. Sự sinh trưởng của vi sinh vật chịu ảnh hưởng rẩt lớn đối với các nhân tố vật lý, hỏa học cùa môi trường sổng. Hiểu biết về ảnh hưởng của các nhân tố môi trường đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật giúp ích rất nhiều cho việc khổng chế vi sinh vật cũng như đổi với việc nghiên cứu sự phân bố sinh thái của vi sinh vật. Đáng chú ý là một số vi sinh vật có thể sống được trong những điều kiện cực đoan [extreme] và khó sống [inhospitable]. Các vi sinh vật nhân nguyên thủy [Procaryotes] có thể sinh tồn tại ở mọi nợi có thể sinh sổng. Nhiều nơi các vi sinh vật khác không thể tồn tại được nhưng vi sinh vật nhân nguyên thủy vẫn có thể sinh truờng rất tốt. Chẳng hạn vi khuẩn Bacillus infernus có thể sống ở độ sâu 1,5 dặm dưới mặt đất, nơi không có ôxy và cỏ nhiệt độ cao đến 60°c. Những vi sinh vật có thể sinh trưởng được trong những hoàn cảnh hà khắc như vậy được gọi là các vi sinh vật ưa cực đoan. Trong phần này chúng ta sẽ xem xét ảnh hưởng của một số nhân tô chủ yếu của môi trường đổi với sự sinh trưởng của vi sinh vật {bảng ỉ 4.3]. Bảng 14.3: Phản ứng cửa vi sinh vật với các nhân tố môi trường Thuậỉ ngữ

Vi sinh vật ưa áp [Osmotolerant]

Vi sink vậí ưa mạn ịtìaỉophiỉe]

Ưa axit [Axitophỉle] .

Định nghĩa Hoạt tính cùa nưởc và dung chất Có thể sinh trưởng trong một phạm vi rộng về hoạt tính cùa nước và nồng độ thẩm thấu. Cần sinh trường ở nồng độ NaCl cao, thưcmg là từ 0,2 mol/L trở lên. pH Sinh trường tốt nhất trong phạm vi pH 0-5,5

Vỉ sinh vật đại diện

Staphylococcus aureus, Saccharomyces

Haỉobacterium,Dunalielỉa, Ectothỉorhodospira

Sulfolobus.Picrofilus, Ferroplasma, Aconíium, Cyaniảum caldarium. 63

Thuật ngữ

Định nghía

Vi sinh vật dại điện

ưa trung tính [Neutrophile]

Sinh trưởng tốt nhất trong phạm vi pH 5,5- 8,0

Escherichia, Eugỉenu, Paramecium

ưa kiềm[Alkalophile]

Sinh trường tốt nhất trong phạm vi pH 8,5-11,5

Bacillus aỉcalophỉỉits, Naironobacterium

Nhiệt độ Sinh trưởng tốt nhất ờ 15°c hay thấp hơn.

Bacillus psychrophỉỉus, CMamydomonas nivalis

ưa ìạnhịPsychrophyỉe] Chịu ỉạnhịPsychrotroph]

Có thể sinh trưởng ở 0-7°C nhưng sinh trường tốt nhất ở 20-30°c, còn có thê sinh trường được ờ khoảng 35°c

Listeria monocytogens, Pseudomonas fluorescens

ưa ấm[Mesophile]

Sinh trường tốt nhất ờ 2545 c.

Escherichia coỉi, Neisseria, Gonorrhoeae, Trichomona vaginalis.

ưa nhiệt[Thermophiìe]

Có thể sinh trưởng ở nhiệt độ 55°c hoặc cao hcm, nhiệt độ thích hợp nhất thường là giữa 55 và 65°c

ưa nhiệt cao [Hyperthermophile]

Thích hợp phát triển ở nhiệt độ giữa 80 và khoảng 113°c

Bacillus stearothermophilus, Thermus aquaticus, Cyanidium caldarium, Chaetomium thermophile Sitlfolobus. Pyrodictium, Pyrococcus,

Nồng độ Ôxy Hiểu khí bắt buộc [Obligate aerobe]

Hoàn toàn dựa vào 0 2 của không khỉ để sinh trưởng

Micrococcus luteus, Pseudomonas, Mycobacteriun, phần lớn Tào, Nấm và ĐV nguyền sinh

Kỵ khỉ không bất buộc [Facultative anaerobej

Không cần 0 2 để sinh trưởng nhưng sinh trưởng tôt hơn khi có mặt 0 2

Escherrichia, Enterococcus, Saccharomyces cerevìsiae

Kỵ khí chịu Oxy [Aetoỉerant anaerobe]

Sinh trưởng như nhau khi có mặt hay không có ôxy

Streptococcus pyogens

Kỵ khỉ bẳt buộc [Obligate anaerobe]

Bị chết khi có mật O'!

Vi hiểu khỉ [Microaerophũe]

Cần 0 2 ở mức độ thẩp hơn2- 10% đề sinh trưởng và bị tổn hại trong không khí [20 %] Ap suât Sinh trường nhanh hơn khi áp suất thủy tĩnh cao

Clostridium, Bacteroides, Metanobacterhm, Trepomonas agiỉis. Campylobacter, Spirillum voỉutans, Treponema pallidum

ưa áp [Barophile]

Photobacterium profindum, Shewanella benthica, Metanococcus jannaschii

14.4.1. Hoạt tính của niróc và dung chất Vỉ tế bào ví sinh vật tách với môi trường cùa chúng bằng loại màng sinh chất có tính thẩm thấu chọn lọc cho nên vi sinh vật chịu ảnh hường cùa sự biến đổi nồng độ thấm tháu trong môi trường. Neu một vi sinh vật được đưa vào dung dịch có nồng độ thẩm thấu thấp thi nước sẽ xâm nhập vào te bào, nếu không có sự khống chế hữu hiệu thì tế bào sẽ bị trương lên và vỡ ra. Nhờ có các thể nội hàm mà có thể giảm thấp nồng độ thẩm thấu của tể bảo chất. Lúc tính thẩm thấu của môi trường thấp hon tính thẩm thấu của tế bào chất, các vi sinh vật nhân nguyên thủy cũng có thể phá vỡ các kênh mẫn cảm với áp suất làm cho dung chất thấm ra. Phần lớn vi khuẩn, tảo và nấm thường có thành tế bào vừng chắc, có thể duy trì hình thái và tính hoàn chỉnh của tế bào. Lúc đua tế bào các vi sinh vật có thành tá bào vững chắc vào mồi trường ấp suất thẩm thấu cao thỉ nước sẽ thoát ra, màng sinh chất sẽ tách ra khỏi thành tế bào và tạo ra tình trạng co nguyên sinh. Sự mất nước này của tế bào sẽ tổn hại tới màng tế bào chất, tế bào sẽ mất khả năng trao đổi chất và ngừng sinh trường. Điều này liên quan đến việc bảo quàn thực phẩm nhờ muối mặn hoặc tẩm đường [làm mứt, ngâm mật ong...]' Nhiều vi sinh vật sử dụng dung chất hỗn hợp [compatible solute] để làm cho nồng độ thẩm thấu cùa nguyên sinh chất cao hơn môi trường chung quanh, làm cho màng sinh chất vẫn gắn được với thành tế bào. Sở dĩ gọi là dung chẩt hỗn hợp là vì dung chất đó có thể thích hợp để tế bào sinh trưởng và phát triền ngay khi cỏ nồng độ cao trong tế bào. Phần lớn vi sinh vật nhàn nguyên thủy có thể nàng cao nồng độ thẩm thấu trong tế bào ở môi trường áp suất thẩm thấu cao là nhờ tổng hợp hoặc hấp thu colin, betaine, proline, axit glutamic và các axit amin khác. Việc nâng cao nồng độ K+ cùng có thể ờ một mức độ nào đó giúp nâng cao nồng độ thẩm thấu trong tế bào. Tảo và nấm thì sử đụng xacaroz và các polyol, ví dụ như arabitol, glyxeroi, mannitol,... để đạt được mục đích như vậy. Polyol và axit amin là những đung chất lý tuởng để nâng cao nồng độ thẩm thấu trong tế bào bởi vì chúng không phá hủy cấu trúc và chức năng của enzym. Nhiều vi sinh vật nhân nguyên thủy như Haỉobacterium salỉanarium sử dụng K+ để nâng cao nồng độ thẩm thấu trong tể bào, Na+ cũng cỏ tác dụng này nhưng không sử dụng được cao như K+. Các enzym của Halobacterỉum cần nồng độ muối cao để đuy trì hoạt tính. Động vật nguyên sinh đo không có thành tế bào nên phải sử dụng các không bào [vacuoles] để bài xuất phần nước dư thừa khi sống trong m ô i trường có nồng độ thẩm thấu thấp. Tác dụng tương hỗ giữa phân tử nước và phân tử dung chất được gọi là hiệu ứng thẩm thấu [osmotic effect] còn hiệu ứng cơ chất [matric effect] là biểu thị các phần từ nước bị hấp phụ [adsorption] trên bề mặt các chất rắn. Hai hiệu ứng này dẫn đến việc giám sút phần hước có thể được vi sinh vật sử dụng. Vì nồng độ thẩm thấu trong môi trường có

ành hưởng sâu sắc đối với vi sinh vật cho nên để định iượng khả năng sử dụng nước các nhà vi sinh vật học thường dùng khái niệm hoạt độ nước aw [water activity aw] đê biêu thị tính hữu hiệu của nước. Cũng có thể dùng thế nàng nước [water potential] tương quan với awđể biểu thị tính hừu hiệu của nước. Hoạt độ nước của một dung dịch ]à 1/100 cùa độ âm tương đối của đung dịch này [tính theo %], cũng là tương đương vói tỷ lệ giữa áp suất bay hơi của dung dịch này [Psoin] và áp suất bay hơi của nước tinh khiết [Pwater]:

Hoạt độ nước của một dung địch hay một chất rắn có thể xác định bằng cách đưa vào một vật chứa kín và đo độ ẩm tương đối sau khi hệ thống đạt tới trạng thái càn bàng [equilibrium]. Ví dụ, một mẫu vật sau khi đạt tới trạng thái cân bàng trong hệ thống này mà không khí đạt tới 95% bão hòa, thì cũng tức là không khí chứa 95% độ ẩm khi đạt tới cân bàng ở cùng nhiệt độ với một mẫu nước thuần khiết, hoạt độ nước của mẫu vật này là 0,95%. Hoạt độ nước tỷ lệ nghịch với áp suất thẩm thấu, nếu áp suất thẩm thấu cao thì trị số awlà thấp. Các vi sinh vật khác nhau có năng lực thích ứng khác nhau rất lớn đối với môi trường có hoạt độ nước thấp [bảng 14.4]. Bảng 14.4: Trị sỗ tương đối về hoạt độ nư&c [a„] thấp nhất đối với sự sinh trưởng của vi sình vệt [theo A.Đ. Brown, 1976] Hoại độ nước

Môi trường

Vi khuẩn, Nấm, Tảo

1,00

Nước thuần khiết

Phần lớn VK Gram ['] không ưa mặn

0,95

Bảnh mỳ

Phần lớn trực khuẩn Gram [-] Basidiomycetes Fusarium Phần 1ỚĨ1Mucor,Rhìzopus, Bacillus.

0,90

Đùi gia súc

Phần lớn cầu khuẩn, nấm men cỏ bào tử túi.

0,85

Salami Ý

Staphylococcus

Thực phẩm muối

Saccharomyces rouxii [trong muối], Penicillium

0,75

Hồ muổi Cả muối

Haỉobacterium,AspergiUus, Dunaỉìeỉla, Âctìnospora

0,70

Ngũ côc,kẹo, quả khô

Aspergillus

0,60

Sôcôla, mật ong, sữa bột

Saccharomyces rouxii [trong đường], Xeromyces bisporus

0,55

ADN bị phá hùy

Có thế kể thêm vài ví đụ khác về trị sổ aw: máu người- 0,995; quả tươi- 0,97-0,98; nước biển- 0,98; thịt gia súc tươi- 0,97; sirỏ- 0,90; giăm bông- 0,90; lạp xường- 0,85; mứt quả- 0,80; nước đường bão hòa- 0,76; bột mỳ- 0,65... Vi sinh vật muốn giữ lượng nước bằng cách duy trì dung chất nội bào ở nồng độ cao khi sinh trưởng trong môi trường có hoạt độ nước thấp sẽ gặp khó khăn khá lớn. Nhừng vi sinh vật có thể tồn tại trong những điều kiện như vậy được gọi là các vi sinh vật chịu áp [osmotolerant]. Chúng có thể sinh trưởng được trong một phạm vi nồng độ thấm thấu hoặc hoạt độ nước khá rộng. Ví dụ , vi khuẩn Staphylococcus aureus có thể nuôi cấy trên môi truờng có nồng độ NaCl cao tới 3 mol/L. Chúng cũng có thể thích ứng sinh trường trên da người. Nấm men Saccharomyces rouxii có thể sinh trường trên dung dịch đường có hoạt độ nuớc thấp đến 0,6. Tảo lục Dunalieỉla viridỉs có thể chịu được nồng độ NaCl cao đến ỉ ,7mol/L hoặc nồng độ bão hòa. Mặc dầu một sổ ít vi sinh vật có thể thực sự chịu áp nhưng phần lớn vi sinh vật chỉ cỏ thể sinh trường tốt ở hoạt độ nước khoảng 0,98 [tương đương với aw của nước biển] hoặc cao hơn nữa. Lợi đụng điểu nảy người ta sử dụng phương pháp sấy khô hay dùng muối, đùng đường để bảo quản thực phẩm, phòng tạp nhiễm bởi vi sinh vật. Tuy nhiên nhiều nam chịu áp vẫn có thể làm hư hỏng các thực phẩm đã sấy khô hoặc ướp muối, tẩm đường. Vi sinh vật ưa mặn [Halophile] hoàn toàn thích ứng với môi trường cao áp [hypertonic], cần nồng độ NaCl cao để sinh trưởng. Phạm vi nồng độ muối cần thiết để sinh trường đối với nhóm vi khuẩn ưa mặn cực đoan [extreme halophilic bacteria] là 2 ,8 6,2 mol/L [nồng độ muối bão hòa]. Tại Biển Chết [Dead Sea]- một hồ thấp nhất thế giới nằm giữa Israel và Jordan, và tại hồ Đại Diêm [Great Salt Lake] ở bang Utah [Hoa Kỳ] và tại các môi trường khác có nồng độ muối gần với bão hòa, có thể phân lập được các c ổ khuẩn [archeon] thuộc chi Haỉobacterium, Chúng cùng các vi khuẩn ưa mặn cục đoan khác không giống với phần lớn các vi sinh vật chịu áp [osmotolerant] ở chỗ không phải là đơn giản thông qua việc nâng cao nồng độ dung chất nội bào, mà chủ yếu là sửa đổi cấu trúc protein vả màng của mình để thích ứng vói nồng độ muối cao. Những vi khuẩn ưa mặn cực đoan này duy trì nồng độ kali nội bào sao cho áp suất thẩm thấu cao hơn môi trường sống; nồng độ K+ nội bào có thể tới 4-7 moỉ/L. Các enzym, riboxom và protein vận chuyển của các vi khuẩn này cần nồng độ K+ cao để duy tri tính ổn định và hoạt tính. Ngoài ra nồng độ Na+ cao cũng giúp cho sự ổn định cùa tế bảo và màng sinh chất cùa vi khuẩn Halobacterium. Nếu nồng độ Na+ quá thấp thì thành tế bào và màng sinh chất sẽ hoàn toàn bị phá hủy. Vi khuẩn ưa mặn cực đoan thích ứng thành công với điều kiện môi trường muối cao, nơi có thể tiêu diệí hầu hết các sinh vật khác. Tuy nhiên chúng cũng đã biệt hóa [specialized], mất đi tính linh hoạt [flexibility] sinh thái và chỉ có thể sinh trưởng trong một ít môi trường cực đoan.

14.4.2. pH pH là số đo hoạt tính ion hydro của một dung dịch và đó là số logarit âm của nồng độ ion hydro [biểu thị bàng nồng độ phân tử]: pH = -log[H+] - !og [Ỉ/[H+J] Thang pH từ pH 0,0 [1,0 mol H+] đến pH 14,0 [1,0 X 10',4mol H+]. Mỗi đon vị pH đại biểu cho sự biến đổi 10 lần về nồng độ ion hydro. Hình ỉ 4. ỉ 3 cho thấy nơi cư trú mà vi sinh vật có thể sinh trưởng là rất rộng, từ pH rất axit [pH 1-2] đến những hồ hay đất rất kiềm với pH giữa 2 và 10. pH có ảnh hưởng rõ rệt đối với sự sinh trường của vi sinh vật. Mỗi vi sinh vật đều có một phạm vi pH sinh trưởng nhất định và pH sinh trưởng tốt nhất. Vi sinh vật ưa axit [axitophile] có pH sính trưởng tốt nhất là pH 0-5,5 ; đối với vi sinh vật ưa trung tính là pH 5,5-8,0 ; đối với vi sinh vật ưa kiềm [alkalophile] là pH 8,5-11,5. Vi sinh vật ưa kiềm cực đoan có mức sinh trưởng tổi liu ở pH 10 hay cao hơn nữa. Nói chung, các nhóm vi sinh vật khác nhau đều có phạm vi sinh trưởng riêng của mình. Phần lớn vi khuẩn và động vật nguyên sinh là ưa trung tính. Phần lớn nấm là ưa hơi axit [pH 4-6]. Cũng có nhiều trường hợp ngoại lệ. Vỉ dụ, tảo Cyanidium caỉdarium và cổ khuẩn Sulfolobus axiíocaỉdarius thường sống trong các suối nước nóng axit, chúng sinh trường tốt ở nhiệt độ cao và pH từ 1 đến 3. Cổ khuẩn Ferroplasma axitannanus và Picrophiỉus oshimae có thể sinh trưởng ở pH=0 hay rẩt gần với 0. Mặc dầu vi sinh vật thường có thể sinh trưởng trong một phạm vi pH khá rộng, và xa với pH tốt nhất cùa chúng, nhưng tính chịu đựng [tolerance] của chúng cũng có giới hạn nhất định. Khi pH trong tế bào chất có sự biến hóa đột ngột sẽ làm phá vỡ màng sinh chất hoặc làm ức chế hoạt tính của enzym hay proteinaz chuyển màng, do đó làm tổn thương đến vi sinh vật. Vi sinh vật nhân nguyên thủy bị chết khi pH nội bảo giảm xuống thấp hơn 5,0-5,5. Sự biến đổi pH của môi trường sẽ làm thay đổi trạng thái điện ly của phân tử các chất đinh dưỡng, làm hạ thấp khả năng sử dụng chúng của vi sinh vật. Khi pH trong m ô i trường có sự biến hóa tương đổi lớ n thỉ pH nội bào của phần lớn vi sinh vật vân gân trung tính. Nguyên nhân có thể là do tính thẩm của H+ qua màng sinh châl là tương đôi thâp. Vi sinh vật ưa trung tính thông qua hệ thống vận chuyển đã sử dụng K thay cho H . Vi sinh vật ưa kiềm cực đoan như Bacillus aỉcalophilus dùng Na+ nội bào thay thê cho H của môi trường bên ngoài, giữ cho pH nội bào gần với trung tính. Ngoài ra hệ thông chât đệm nội bào [intering buffering] cũng cỏ vai trò quan trọng trong việc duy trì pH ổn định.

Bảngl4.5: T h a n g p H pH

[H +] nồng đệ p h in từ

101[1 JŨ]

]25

Cyanidium caldarium

30-34

45-50

NĐ tốt nhắt

ND cao nhất

4-15

1-3

2Ỉ-23

45-50

50-58

NĐ thấp nhất

Vi sinh vật

Nấm Candida scottii Saccharomyces cerevisiae Mucor pusỉỉlus

Động vật nguyên sinh Amoeba proteus

4-6

Naegỉeriơ fowteri

20-25

32-39

28-30

Trichomonas vaginalis Paramecium caudatum Tetrahymena pyriformis

6-7

20-25

Cyclidiutn citrullus

Nhiều vi sinh vật sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 20-30°c, nhiệt độ cao nhất là cao hơn 35°c, nhưng chúng vẫn có thể sinh trưởng trong điều kiện 0-7°C.Chúng thuộc về nhóm ưa lạnh không bắt buộc {Psychrotrophs hay Facultative psychrophiles]. Những vi khuẩn và nấm thuộc nhóm này lả nguyên nhân chính làm hư hỏng thực phẩm giữ lạnh. Vi sinh vật ưa ẩm [Mesophile]: Đó là các vi sinh vật sinh trường tốt nhất ở 20-45°C, nhiệt độ sinh trưởng thấp nhất là 15-20°c. Nhiệt độ sinh trưởng cao nhất là khoảng 45 °c hoặc thấp hơn. Phần lổm vi sinh vật là thuộc về nhóm này. Hầu như mọi vi khuẩn gây bệnh cho người đểu là vi sinh vật ưa ấm, bởi vì thân nhiệt của người là 37 °c.

vsv u» siêu HÓttg vsv 1*4ruing Ị Ị VSVuaim vsv tra lạnh í ^ khốngbít buộcỊ VSViji "i «■

í Ị

Ị

/ / Ị

-- 1--- 1 A 1-l_i_L_J—«— 1— Li— 1— 1— ị—Ầ 1 120

Nhiệt độ [°CJ Hình ì 4. ỉ 4: Phạm vi nhiệt độ sinh trưởng cùa vi sinh vật [Theo sách của Prescott, Harley và Klein].

Vỉ sinh vật ưa nhiệt [Thermophile]: Đó ỉà các vi sinh vật sinh trưởng được ở nhiệt độ 55°c hay cao hơn nữa. Nhiệt độ sinh trường tốt nhất đổi với chúng là 33-65°C. Thành phần chủ yếu của nhỏm này là vi khuẩn [chù yếu là xạ khuẩn], một ít tảo và nấm [bàng ỉ 4.6]. Chúng phát triển trong đống phân chuồng ù, dưới đáy các cột rơm rạ hay cỏ khô, trong dường dẫn nước nóng, trong các suối nước nóng...Vi sinh vật ưa nóng khác với vi sinh vật ưa ấm ờ chỗ chúng có hệ thong tổng hợp enzym và protein bền nhiệt [heat-stable] và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao. Màng sinh học của chúng có lipit bão hòa ờ mức cao, có điểm sôi cao hơn và vì vậy vẫn giữ được nguyên vẹn ở nhiệt độ cao. Có một số ít các vi sinh vật ưa nhiệt có thể sinh trưởng ờ nhiệt độ 90° c hay cao hơn. Nhiệt độ sinh trưởng cao nhất là 100 °c. Người ta xếp các vi sinh vật có nhiệt độ sinh trưởng tổt nhất ở 80-113°c vào nhóm VI sinh vật ưa siêu nóng [Hyperthermophiles]. Chúng thường không thể sinh trường bình thường ở nhiệt độ thấp hom 55°c. Vi khuẩn Pyrococcus abyssỉ và Pyrodiciium occuỉtum là ví dụ về những vi sinh vật ưa siêu nhiệt được tìm thấy ở những đáy biển nóng. 14.4.4. Nồng độ oxy Các vi sinh vật sinh trưởng trong điều kiện có oxy được gọi là vi sinh vật hiếu khỉ [aerobe], còn các vi sinh vật sinh trưởng ừong điều kiện không có oxy được họi là các vi sinh vật kỵ khí [anaerobe]. Hầu hết các cơ thể đa bào đều phải cần sinh trưởng trong điều kiện có oxy, chúng ]ả các sinh vật hiếu khí bắt buộc [obligate aerobes]. Oxy là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi vận chuyển điện tử khi hô hấp hiếu khí. Ngoài ra, các vi sinh vật nhân thật [eucaryotes] hiếu khí còn dùng oxy để tổng hợp sterol và các axit béo không bão hòa.

□S

□

ỊS Ị

Hiếu khí bắt buộc

Kỵ khí tuỳnghi

Kỵ khí chịu đưoc hiếu khí

♦ SOD ♦ Catalase

♦ SOD -Caialaso

Ky khí bat buộc

Vi hiếu khí

Thành phần enãm ♦ SOD ♦ Cat al a se

-soo ‘Câtalaae

Hình 14.15: Oxy và sự sinh trường cùa vi khuẩn. Chủ thích: Các nhóm vi sinh vật xem trong bài

♦ SOĐ «/- Câtalase

Mỗi chàm biêu hiện khuẩn lạc cùa vi khuân trong hay trên bề mặt môi trường. SOD và catakiz là biếu thị vì khuẩn có tồn tại enzym superoxit dismutaz và catalaz hay không? [ Theo sách cùa Prescott, Harley

và

Klein].

Các vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc [facultative anaerobes] không cần oxy để sinh trường nhưng khi có oxy thì sinh trưởng tốt hơn. Khi có oxy chúng sử dụng phương thức hô hấp hiếu khí. Các vi sinh vật kỵ khí chịu oxy [aerotolerant anaerobes] như vi khuẩn Enterococcus faecalis có thể sinh trưởng như nhau trong điều kiện có oxy cũng như không có oxy. Ngược khuẩn Bacíeroides, Fusobacterium, Clostridỉun pasteurianum, Meíanococcus.... sẽ bị chết khi có oxy. Vi sinh vật kỵ khí chịu oxy và vi sinh vật kỵ khí bắt buộc không sinh năng lượng thông qua quá trình hô hấp, chúng thu được năng lượng thông qua quá trình lên men hay hô hấp kỵ khí [anaerobic respiration]. Sau cùng, phải kể đến nhóm vi sinh vật vi hiểu khí [microaerophiles], chúng không sinh trưởng được trong điều kiện không khí bình thường [20% O 2] và cần sinh trưởng trong điều kiện nồng độ O 2 khoảng 2-10% Quan hệ giữa vi sinh vật vả oxy có thể xác định bàng một thí nghiệm đơn giàn như sau: nuôi cấy vi sinh vật trong ống nghiệm chứa môi trường đặc hoặc môi trường đặc biệt như môi trường chứa thioglycolat [là chất khử làm giảm nồng độ oxy trong môi trường]. Cùng một nhóm vi sinh vật có thể có nhiều loại quail hệ khác nhau với 0 2. Cà 5 loại hình đều có thể thấy ờ vi sinh vật nhân nguyên thủy [prpcaryotes] và động vật nguyên sinh. Nấm thường là hiếu khí, chỉ trừ một số loài đặc biệt, nhất là nấm men, thuộc loại kỵ khí không bắt buộc. Tảo hầu như đều thuộc loại hiếu khí bắt buộc. Đáng chú ý là năng lực có thể sinh trưởng cả trong môi trường hiếu khí lẫn môi trường kỵ khí làm cho vi sinh vật có tính linh hoạt cao và đó chinh là một loại ưu thế sinh thái học. Mặc dầu O2 có thể làm chểt các vi sinh vật kỵ khí bắt buộc, nhưng trong môi trường hiếu khí vẫn có thể phân lập đuợc chúng. Đó là do chúng thường sống chung với loại kỵ khí không băt buộc và họ này tiêu thụ hết O2 , tạo nên môi trường kỵ khí cục bộ giúp cho vi sinh vật kỵ khỉ băt buộc có thê sinh trường được. Ví dụ trong khoang miệng vi khuẩn kỵ khí băt buộc Bacteroides gỉngivaỉis có thể sinh trưởng được trong các khe kỵ khí quanh răng. Sự khác biệt trong quan hệ của vi sinh vật với O2 do nhiều nguyên nhân khác nhau, bao gôm việc bât hoạt của protein và tác dụng độc hại của O 2 trong điều kiện hiếu khí. Các enzym có thể bị bất hoạt khí các nhóm mẫn cảm như sulfuahydrit bị oxy hóa. Chẳng hạn như enzym cố định đạm nitoaz là loại rẩt mẫn cảm với O2 Vì hai điện từ bên ngoải cùa oxy không thành cặp do đó rất dề tiếp nhận điện tử và bị khử. Flavoprotein, một số thành phần té bào khác và sự bức xạ đểu có thể thúc đẩy việc

khử oxy, tạo thành các sản phẩm khư như gốc tự do superoxit, hydro peroxit, gốc hydroxyl. O 2 + e' -» O 2' [gốc tự do superoxit] O2 + e' + 2H+ -* H 2O2 [hydro peroxit] O2 + e' + H+ -* H2O + OH' [gốc hydroxyl] Các sản phẩm khử oxy này là cực kỳ có hại vì chúng là các chất oxy hóa mạnh và phá hủy nhanh chóng các thành phần tế bào. Vi sinh vật nào phải có năng lực tự chống lại được các sản phẩm khử này mới tránh khỏi bị tiêu diệt. Bạch cầu trung tính [neutrophils] và đại thực bào [macrophage] đâ lợi dụng các sản phẩm độc hại này để tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh xâm nhập cơ thể. Nhiều vi sinh vật sinh ra các enzym để chổng lại các sản phẩm khử độc hại này. Vi khuẩn hiếu khí bắt buộc và vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc thường chứa các enzym như superoxit dismutaz [SOD] vả catalaz, chủng phân biệt xúc tác việc phá hủy gốc superoxit và hydro peroxit. Peroxitaz cũng cỏ thể dùng để phá hủy hydro peroxit: 2 0 2 ' + 2H+ ^

superoxit dismutaz

2 H 2O 2 -> -» eatalaz

0 2 + JJ2Q

-* 2H20 + 0 2

H2O 2+ NADH + H+ - - pcroxitaz -* -* 2H20 + NAD+ Vi sinh vật kỵ khỉ chịu oxy có thể thiếu catalaz nhưng hầu hết luôn có superoxit dismutaz. Vi khuẩn kỵ khí chịu oxy Lactobacillus pỉantarum dùng ion Mn2+ thay thể SOD để phân giải gốc tự do của superoxit. Tất cả các vi sinh vật kỵ khỉ bắt buộc đều không có hai loại enzym nói trên hoặc có với nồng độ rất thấp và do đó không có năng lực chổng, chịu được với oxy. Vì vi sinh vật hiếu khí cần O2, trong khi vi sinh vật kỵ khí lại bị chết vì O2, cho nên việc nuôi cấy hai nhóm này phải bằng các phương pháp hoàn toàn khác nhau. Lúc nuôi cấy khối lượng lớn vi sinh vật hiếu khí phải nuối cấy trên máy lấc hay phải thổi không khí vô khuẩn vào bình [hay nồi] nuôi cấy. Còn khi nuôi cấy vi khuẩn kỵ khí thì phải loại bỏ hết O 2. Có thể dùng các phương pháp sau đây: - Sử dụng môi trường kỵ khí đặc biệt, có chứa các chất khử như thioglycolat hay cystein. Khi chế tạo môi trường cần đun lên để làm tan các thành phần vả cũng đồng thời loại trừ hết O2 hòa tan trong môi trường. Khi đó vi sinh vật kỵ khí có thể mọc được lên trên bề mặt môi trường. - Nuôi cấy trong các tủ nuôi cấy kỵ khí [anaerobic work chamber] đã hút chân không và bổ sung băng khí nitơ. Thường còn cần bổ sung cả khí CO2 bời vì nhiều vi khuẩn kỵ khi sinh trưởng tốt khi có tồn tại một lượng nhỏ khí CO2. 77

Một phương pháp rất phổ biến khi nuôi cây một lượng nhò vi sinh vật kỵ khí là dùng bình kỵ khí [Gas Pak jar]. Trong hệ thống này lợi dụng Hz và chât xúc tác palladium để làm cho 0 2kết hợp với H 2 tạo thành nước để không có 02 trong môi trường. Các chất

khử đưa vào môi trường thạch cũng có thể giúp loại bỏ Ơ 2.

Hình ỉ 4. Ị 7/ Nuôi cạy vỉ sinh vật kỵ khí trong các bình kỵ khí. [Theo sách cùa Prescott,Harley và Klein'].

Chỗ chứa chắt xúc tác p&Uadium

Túi Gas Pak [khi cho HUÓCbào sẽ giải phóng ĩa H -2V ÌC 02]

Bịt miếng đệm cao su

CHất chi thị màu [khi líliôĩig còn 0 2 thi Methylene 'blue sẽ mất màu]

Có thể đùng túi nhựa để tạo ra các môi trường kỵ khí khi nuôi cấy một lượng nhỏ các vi sinh vật kỵ khí. Trong túi nhựa chứa CaC03 và chất xúc tác để tạo ra điệu kiện kỵ khí giàu CO2. Một dung dịch đặc biệt được đưa vào túi nhựa sau đỏ đưa hộp lồng [hộp Petri] hay các dụng cụ nuôi cấy khác vào và hàn kín túi nhựa lại. Tùy từng trường hợp cụ thê mà sử dụng các phương pháp nuôi cẩy kỵ khí khác nhau.

14.4.5 Áp suất [Pressure] Phần lớn vi sinh vật có thể sống trên lục địa hay trên bề mặt nước, là những nơi có áp suất không khí là 1 atm [atmosphere] và không chịu ảnh hưởng rõ rệt gì của áp suất này .Nhưng đáy biển [nơi có độ sâu 1000m trở lên] lại chiếm đến 75% thế tích đại dương. Ờ những nơi đỏ áp suất cao đến 600-1000atm, nhiệt độ lạnh tới 2-3°C. Trong môi trường cục đoan [extreme] như vậy vẫn có một số vi sinh vật thích ứng để tồn tại, Phần lớn thuộc về nhóm chịu áp [barotolerant]. Tuy áp suất tãng lên cao sẽ có ảnh hưởng đến chúng, nhưng ảnh hưởng bất lợi này nhỏ hơn nhiều khi so với các vi sinh vật không chịu áp [nontolerant]. Một số vi khuẩn sống ừong đường tiêu hóa cùa những động vật không xương sống ở dưới biển sâu [như am phi pods và holothurians] là những vi khuẩn ưa áp [barophilic]. Chúng sinh trường càng nhanh trong điều kiện áp suất cao. Chúng có vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn các chất dinh dưỡng dưới đáy biển. Tại khe biển Mariana gần Philippine [sâu khoảng 10.500m] người ta đã phân lập được những vi khuẩn ưa áp có thể sinh trưởng trong điều liện 2°c với áp suất khoảng 400-500 atm. Nhừng vi khuẩn này hiện đã biết là thuộc về các chi Photobacterhim, Shewanella, Coiwellia..Mội số thuộc về Cổ khuẩn vừa ưa áp vừa ưa nhiệt [thermobarophiles], chẳng hạn như Pyrococcus spp., Metanococcus jannasschi... 14.4.6. Bức xạ [Radiation] Thế giới mà chúng ta đang sống đầy các loại bức xạ điện từ trường [electromagnetic radiation]. Các bức xạ này hình thành như sóng trên mặt nước và lan truyền trong không khí. Cự ly giữa hai đỉnh sóng hay cuối sóng được gọi là độ dài sóng [wavelength]. Khi độ dài sóng giảm đi thì thì năng lượng bức xạ tăng lên. Tia gamma hay tia X có năng lượng cao hơn bức xạ của ánh sáng nhìn thấy [ánh sáng khả kiến] hay tia hồng ngoại. Bức xạ điện từ trường còn giong như một dòng năng lượng hợp bởi các photon [quang từ]. Mỗi photon đều cỏ năng lượng nhất định, năng lượng cao hay thấp quyết định bởi độ dài sóng của bức xạ. Ảnh sáng mặt trời là nguồn búc xạ chủ yểu trên trái đất, bao gồm ánh sảng khà kiến [visible light], tia tử ngoại [ultraviolet], tia hồng ngoại [infraded rays] và sóng radio [vô tuyến điện]. Ánh sáng khả kiến là loại thường thấy và quan trọng nhất trong môi truờng chung quanh chúng ta: mọi sự sống đều phụ thuộc vào các cơ thể có khả năng quang hợp dựa vào năng lượng của mặt trời. Bức xạ mặt trời có 60% nàm ờ vùng tia hồng ngoại chứ không phải ở vùng ánh sáng khả kiến. Tia hồng ngoại là nguồn nhiệt lượng chủ yểu của trái đất. Ở tầm mặt biển chi thấy có rất ít bức xạ tử ngoại 290-300nm [nanometre]. Tia tử ngoại có bước sóng thấp hơn 287nm hấp thụ bời oxy trong không khí và tạo ra tầng ozon [O3] ở độ cao cách mặt đẩt khoảng 25-50km. Tầng ozon hấp thụ các tia từ ngoại bước sóng tương đổi dài và giải phóng ra O2. Bởi vì tia tử ngoại rất cỏ hại cho sinh vật nên việc tầng 79

ozon tiêu trừ bớt tia tử ngoại là có tác dụng rất quan trọng đối với sự sông trên trái đât. Vỉ các loại bước sóng trong ánh sáng mặt trời phân bố đồng đều trong phạm vi ánh sáng khả kiến cho nền ta thấy ánh sáng mặt trời cơ bản có màu “trắng”. Nhiều bức xạ điện từ trường là rất có hại đối với vi sinh vật, nhất là các bức xạ có bước sóng ngắn, cao năng lượng là các bức xạ ion hóa [ionizing radiation], chúng làm nguyên tử mất đi điện tử [electron] hoặc ion hóa [ionize]. Có hai loại bức xạ ion hóa. Một là, tia X tạo ra bởi con người, hai là,tia gamma [ tia y] sinh ra trong quá trình tan rã các đồng vị phóng xạ [radioisotope]. Bức xạ ion hóa mức thấp sẽ làm sản sinh các đột biến [mutations] và gián tiếp làm chết vi sinh vật. Bức xạ ion hóa cao sẽ trực tiếp giết chết vi sinh vật. Mặc dầu vi sinh vật cỏ tính đề kháng cao hơn về các bức xạ ion hóa so với các sinh vật khác, nhưng với liều lượng đủ cao chúng sẽ giết hết vi sinh vật. Chính vì vậy có thể đùng bức xạ ion hỏa để diệt khuẩn. Tuy vậy, một số sinh vật nhân nguyên thủy [như vi khuẩn Deìnococcus radiodurans và các vi khuẩn sinh vật sinh bào tử] có thể vẫn tồn tại được ngay cả ở các mức bức xạ ion hóa khá cao. Bức xạ ion hóa gây cho tế bào rất nhiều biến hóa, có thể phá võ liên kết hudrogen, oxy hóa liên kết đôi, phá hủy cấu trúc vòng, cao phân tử hóa một sổ phân tử.Oxy có thể làm tăng các hiệu ứng này, có thể là do việc sản sinh gốc tự do hydroxyl [OH-]... Mặc dầu có rất nhiều thành phần tế bào chịu ảnh hưởng, nhung nguyên nhân quan trọng nhất gây chết là sự phá hủy ADN. Vì bước sóng ngắn [10-400nm] có năng lượng cao cho nên bức xạ từ ngoại [Ultraviolet radiation] có thể tiêu diệt các loại vi sinh vật. Bức xạ tử ngoại [UV] mạnh nhất ở bước sóng 260nm. Chủng dễ bị ADN hấp thụ, làm cho trên 1 sợi đơn ADN hình thành những song phân tử [dimers] thymine, chúng làm ức chế quá trình tái tạo [replication] và công năng của ADN. Thiệt hại này có thể được sửa chữa qua một số con đường. Theo con đường quang hoạt hóa một loại enzym quang hoạt hỏa sử dụng ánh sáng xanh lam để tách song phân tử thymine. Trong hoạt hóa tối một đoạn ngắn ADN có chứa các song phân tử thymine có thể bị cắt rời và đổi chỗ để thành một đoạn ADN bình thường. Thiệt hại này cũng có thê sửa chữa nhờ các protein recA trong quá trình tái tổ hợp [recombination] hoặc quả trình SOS. Thiệt hại không có thể được khác phục nếu như liều lượng u v quá lớn, tạo nên những tổn thất quá nặng. Mặc dau bức xạ ƯV quá nhỏ [thap hơn 290 và 300nrn] khó cỏ thể lọt xuống bề mặt trai đat, bưc xạ u v nhưng bước sóng 325-400nm cũng có thể gây hại cho vi sinh vật. Chúng phân cắt tryptophan thành những quang sản phẩm [photoproducts] độc hại. Những sản phẩm này tác đụng đồng thời với các bức xạ gần từ ngoại làm phá vỡ sợi ADN. Cơ chế cụ thể của tác đụng này không giống với cơ chế tác dụng của ƯV với bước sóng 260nm.

Tù gama 152- — ---► Tia 7X ^ ......

, Sóng—vô tuyên điên ■< . — .....

■— » ■

Tia tữ ngoại

TU hồng ngoại

0.01

1.0

Buóc sóng [nm]

200

310

.100 101yio* /

400

500

-*- 7+■ '

Anil sing nhìn thẵy

To-‘

! I

10*

600

700

800

900

Buớc sóng [rnn]

Hĩnh 14. ỉ 8: Phạm vi birớc sóng cùa các bức xạ điện từ trường- Phần ánh sáng khá kiến được trình bây phía dưêrị.Theo sách cùa Prescott,Harley và Klein]. Ánh sáng khả kiến là nguồn năng lượng chủ yếu của quá trình quang họp [photosynthesis] vì vậy rất cần cho các sinh vật. Nhưng nếu ánh sáng khả kiến quá mạnh sẽ có thể gây hại hay làm chết vi sinh vật. Tham gia vào quá trình này có một loại sắc tố gọi là chất quang mẫn [photoznsitizers] và oxy. Các sắc tố ở vi sinh vật như chlorophyl, bacteriochlorophyl, cytocroms,và flavin có thể hấp thụ ánh sáng mặt trời và bị kích hoạt tạo ra các chất quang mẫn. Các chất quang mẫn [P] khi bị kích hoạt có thể chuyển năng lượng cho Ơ 2 để làm ra oxy đơn - singlet oxy [ O 2]. Ánh sáng -

P—— — — —-* p [hoạt tính] p hoạt tỉnh + 0 2 — * p + 102 Oxy đơn là chất có hoạt tính rất mạnh, là chất oxy hóa mạnh có thể phá hủy nhanh chỏng tế bào, chúng cũng là nhân tố chủ yếu được các đại thực bào [phagocytes] dùng để diệt khuẩn. Nhiều vi sinh vật ừong không khí hoặc sống ưên bề mặt các vật tiếp súc với không khí sử dụng sắc tổ carotenoit để bảo vệ chống lại với quang oxy hóa [photooxitation]. Carotenoit có thể làm phá hủy các oxy đơn, hấp thu năng lượng của oxy đơn và biến thành

trạng thái phi hoạt tinh. Cả các vi sinh vật quang hợp lẫn vi sinh vật không quang hợp đêu sử dụng sắc tố vào mực đích này. 14.5. S ự SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẶT TRONG MÔI TRƯỜNG T ự NHIÊN 14.5.1. Các nhân tố của môi trường làm hạn chế sự sinh trưởng Môi trường sinh sống của vi sinh vật là phức tạp và thường xuyên biển đổi.Vi sinh vật đặc trưng cho mỗi môi trường cụ thể bị bao bọc bởi sự biến đổi của các chất dinh dưỡng và các nhân tố môi trường khác. Đúng là vi sinh vật đã sinh trường trong một màng sinh học [biofilm], v i sinh vật sinh trưởng trong một “vi môi trường” [microenvironments] cho đến khi môi trường hay các nhân tố dinh dưỡng đạt tới sự sinh trưởng giới hạn. Nguyên tắc lượng tối thiểu của Liebig xác định ràng: tồng sinh khối của một cơ thể quyết định bời sự có mặt của chất dinh dưỡng với nồng độ thấp nhất theo nhu cầu của cơ thể. Nguyên tắc này có thể phù hợp cho điều kiện phòng thí nghiệm cũng như trong môi trường đất và nước. Sự tăng lẽn của một nhân tổ dinh dưỡng cần thiểt [chẳng hạn như photphat] sẽ làm tăng lên quần thể vi sinh vật cho đển khi một sổ nhân tổ dinh dường khác trở thành nhân tổ giới hạn. Nếu một chat dinh dưỡng nào đó là giới hạn thì tăng các nhân tổ dinh dưởng khác không có ích lợi gỉ. Tình hình thực tế còn phức tạp hơn thể nữa. Nhiều nhân tổ giới hạn cỏ thể ảnh hưởng thường xuyên lên quần thể vi sinh vật, chẳng hạn như nhiệt độ, pH, ánh sảng, nồng độ muối... Định luật chổng chịu của Shelford [Shelford’s law of tolerance] xác định: vi sinh vật có một yêu cầu nhất định đối với các nhân tố môi trường, Thấp hay cao hơn yêu cầu này thỉ vi sinh vật không thể tồn tại và sinh trưởng mặc dầu vẫn có đầy đủ các chất dinh dưỡng. Chẳng hạn mỗi vi sinh vật có một phạm vi nhiệt độ sinh trưởng nhất định. Cũng tương tự như vậy đối với pH, nồng độ oxy, nồng độ muối... Sự sinh Ưưởng của vi sinh vật phụ thuộc vào cả sự cung cấp chất dinh dưỡng lẫn khả năng chổng chịu với các điều kiện của môi trường. Khi vi sinh vật có đủ điều kiện dinh dưỡng để sinh trưởng mạnh mẽ thỉ cũng đồng thời sinh ra các chất thải có hại và làm hạn chế sự sinh trưởng của chúng. Đáp ứng với mức dinh dường thấp [môi trường nghèo - oligotrophic environments] và cỏ sụ cạnh tranh, nhiều vi sinh vật đã chiếm đoạt thức ăn và khai thác chúng để làm nguồn cạnh tranh. Vi sinh vật thường biến đổi hinh thái để làm tăng bề mặt và năng lực hấp thu chất đinh dưỡng. Các vi sinh vật nhân nguyên thủy hỉnh que biến thành dạng ‘mini hay “ultramini” [siêu nhỏ] hoặc mọc ra các cải cuổng [prosthecate] để đáp ứng với tinh trạng thiêu thức ãn. Sự thieu hụt chât dinh dưỡng sẽ dẫn đến nhiều biến đổi ở vi sinh vạt, chăng hạn chúng có thê từng bước khép lại hoạt động của các gen liên quan đến trao đôi chất, trừ việc duy trì “gen quản gia” [housekeeping gen].

Nhiều nhân tố có thể làm cải biến mức dinh dưỡng trong môi trường nghèo. Chảng hạn vi sinh vật có thể tách các chất dinh dưỡng hạn chế ra [như là sắt] khiến không còn sắt để cạnh tranh nữa. Không khí cũng có thê cung cấp chất dinh dường giúp cho sự sinh trưởng của vi sinh vật. Điều này có the thấy được trong phòng thí nghiệm cũng như ngoài thiên nhiên. Đã phát hiện thấy chất hữu cơ trong không khí có thể xúc tiển sụ sinh trưởng của ví sinh vật trên môi trường pha loãng [dilute media]. Môi trường sinh trưởng được làm giàu bằng chất hữu cơ trong không khí cũng có thể làm tăng rõ rệt sự phát triển của quần thể vi sinh vật. Ngay trong nước cat- thường chứa dấu vết chất hữu cơ, cũng có thể hấp thu những hợp chất 1 cacbon từ không khí để giúp cho sự sinh trưởng vùa vi sinh vật. Sự tồn tại các chất dinh dường trong không khí và tình trạng sinh trường của vi sinh vật, nếu không xem xét đến sẽ có thể ảnh hưởng đến các thực nghiệm về sinh hóa học hay sinh học phân tử, cũng như các nghiên cứu về sự sinh trưởng của vi sinh vật trong các môi trường dinh dường nghèo [oligotrophic]. Các chất tự nhiên [natural substances] cũng có thể ức chế trực tiếp tới sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật trong các môi trường đinh dưỡng thấp. Các chất đó bao gồm phenol, tannin, amoni, etyỉen, và các hợp chat sulfua bay hơi. Đây cỏ thể là một phương thức giúp vi sinh vật tránh tận dụng các năng lượng giới hạn trước khi được cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết. Các hóa chất này là rất quan trọng trong bệnh lý học thực vật và có thể giúp khống chế các bệnh vi sinh vật trong đất. 14.5.2. Kiểm tra số lượng vi sinh vật nhân nguyên thủy tuy sổng nhưng không nuôỉ cấy được Khi nghiên cứu sự sinh trưởng của quần thể vi sinh vật nhân nguyên thủy [procariotic] trong thiên nhiên bên ngoài phòng thí nghiệm cần phài xác định số lượng vi sinh vật sống. Trong lịch sử vi sinh vật học thuờng người ta định nghĩa vi sinh vật sống là có thể sinh trưởng, có thể hình thành khuẩn lạc [colony] hoặc tạo ra độ đục rõ rệt trên môi trường dịch thể. John R.Postgate ở Đại học Sussex [nước Anh] ỉà một trong những học giả đầu tiên xác định vi sinh vật chịu ức chế [stressed] khi sống trong môi trường thiên nhiên, hoặc trong nhiều môi trường phòng thí nghiệm đặc biệt, là đặc biệt mẫn cảm với các ức chế thứ sinh [secondary stresses]. Các ức chế này làm cho vi sinh vật tuy sống nhưng không có thể tạo thành khuẩn lạc trên các môi trường đặc bình thường vẫn dùng để nuôi cấy chúng. Đe xác định được sự sinh trưởng của các vi sinh vật này Postgate đưa ra một phương pháp thực nghiệm gọi là thí nghiệm vi hoạt tính Postgate [Postgate Microviability Assay]. Trong thí nghiệm này đem vi sinh vật nuôi cấy trên lóp mặt thạch mỏng dưới lá kính [coverslip], làm cho chúng không qua được giai đoạn sinh trưcmg đơn bào mà chì biến đổi hình thái tế bào, coi đó là biểu hiện tín hiệu sống [life signe]. 83

Từ đó, nhiều nhà nghiên cứu phát triển các phương pháp hiển vi mẫn cảm và phương pháp chất đồng vị để xác định sự tồn tại và ý nghĩa của dạng vi khuân sông nhưng không nuôi cấy được. Chảng hạn dùng kháng thể huỳnh quang và thuốc nhuộm acridin orange để đánh giá mức độ số lượng; hoặc là dùng phương pháp sô lượng khả năng tôi đa [MPN-most probable number]...Việc sử đụng chỉ sổ giải phóng hoạt tính phóng xạ của vật chất tế bào cũng được dùng để xác định ảnh hưởng của hiệu ứng ức chế đối vói vi sinh vật. Các phương pháp do Postgate đề ra là rất quan trọng. Nhiều nghiên cứu cho thấy cỏ khi một số vi khuẩn như Escherichia coli, Vibrio cholerae, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogens, Enterococcus faecalis mất năng lực sinh trưởng trên các môi trường phòng thí nghiệm theo các kỹ thuật nuôi cấy tiêu chuẩn, nhưng chủng vẫn giữ vai trò gây bệnh truyền nhiễm. Tình trạng một quần thể hỗn hợp ừong môi trường thiên nhiên là rất phức tạp. Thông thường chỉ có khoảng 1-10% các tế bào là có thể hình thành khuẩn lạc. Trong tương lai cỏ thể phải tìm ra các môi trường nuôi cấy thích hợp hơn đối với các vi sinh vật còn chưa được biết đến. Hiện nay người ta đã sử dụng kỹ thuật PCR và phàn tích ARN cùa tiểu thể riboxom để đánh giá tính đa dạng của quần thể các vi sinh vật chưa nuôi cấy được. 14.5.3. Cảm ứng m ật độ và các quần thề vì sinh vật Từ nhiều thập kỷ nay, các nhà vi sinh vật học vẫn nghĩ ràng quần thể vi sinh vật là tập hợp của các cá thể riêng biệt, sinh trưởng và hoạt động độc lập với nhau. Tuy nhiên gần đây người ta đã phát hiện thấy nhiều vi khuẩn có khà năng giao tiếp và hoạt động hợp tác với nhau. Một trong những cách cơ bản để vi sinh vật hợp tác được với nhau đó là cảm ứng mật độ hay còn lại là sự tự cảm ứng. Đó là hiện tượng trong đó vi sinh vật tự điều chỉnh mật độ thông qua quá trình cảm nhận hàm lượng các phân tử tín hiệu, đôi khi gọi là các chất tự cảm ứng [autoinducer] bởi vì chúng có thể kích thích tế bào tiết ra chúng. Nồng độ các phân tử tín hiệu tăng lên cùng với sự tăng lên của sổ lượng vi khuẩn trong quần thể cho đên khi đạt đên ngưỡng đặc trưng [đôi với quần thể đó] và ra tín hiệu cho vi khuẩn rằng mật độ quần thể đã đến mức tới hạn hay còn gọi là ’’quorum”. Vi khuẩn lúc đó sẽ bắt đầu biểu hiện các gen phụ thuộc mật độ tế bào tới hạn nhằm điều chỉnh mật độ tế bào. Câm ứng mật độ đã được phát hiện ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương. Cam ứng mật độ cỏ ý nghĩa quan trọng với vi sinh vật. Có thể lấy ví dụ về sự sinh tông hợp và giải phóng các enzym ngoại bào. Nêu các enzym này chỉ được giải phóng nhờ một số ít vi khuẩn, chúng sẽ bị khuếch tán và không phát huy được tác dụng do bị pha loãng. Với cách điều khiển bàng cảm ứng mật độ, vi khuẩn sẽ đạt đến mật độ quần thể lớn trước khi chúng giải phóng enzym và kết quà là hàm lượng enzym đủ lớn để phát huy tác dụng. Đo chính là lợi thê của vi sinh vật trong cơ thể vật chủ cũng như trong các môi trường đât, nước. Nếu vi sính vật gây bệnh có thể đạt được đển nồng độ đủ lớn tại một

điểm nào đó trên cơ thể vật chủ trước khi sản sinh các nhân tố độc lực và xâm nhập được vào các mô vật chủ, chúng sẽ có cơ hội lớn hơn trong việc làm mất tác dụng khả năng tự vệ của vật chủ và do đó có thể lan ra toàn bộ cơ thể vật chủ. Điều này giải thích một kiểu khác của cám ửng mật độ. Dường như cảm ứng mật độ rất quan trọng đoi với nhiều vi sinh vật trong việc thiết lập mối quan hệ cộng sinh hay ký sinh đối với vật chủ.

H Chuỗi Acyl

Homosefin«

tactone fa] «i m

•

ỉ »

•

* ■ * HSLS

KSLS

ỉ

•

Ỵ

Acyl HSL

Ị

synthase

ả - v\

•

Các pioiíin phạ thuộc mật độ lá bào lới hạn

\\ / /

1 DNA-................ — flj]

mRNA

—_

Hình 14. ỉ 9; Cam ìmg mật độ ờ vi khuẩn Gram âm. ịTheo sách của Prescott,Harley vờ Klein], [a] Cẩu trúc chung cùa acyl homozrinee ỉacton, chất đuực biết đến như là tín hiệu cùm ứng một độ [điều chinh mật độ tế bào] hay còn gợi là chất tự càm ứttg. [b] Lược đồ mink họa cách hoợl động của cám ứng mật độ ờ nhiều vi khuấn gram âm. Các protein thụ thế hoại động với vai trò chất cảm ímg [inducer] được ký hiệu bằng chữ R. Đường kè gãy nét biêu thị acyl HSL synthaz không phái lúc nào cũng được tạo ra tương ímg với các chai tự cảm ứng. Cảm ứng mật độ được phát hiện đầu tiên và tìm hiểu rõ nhất ở vi khuẩn Gram âm. Các tín hiệu thường gặp nhất ở vi khuẩn Gram âm là acyl homozrinee lactons [HSLs]. Đó là các phân tử nhỏ được cẩu tạo bởi chuỗi acyl từ 4 đến 14 c liên kết với homozrinee lacton [hình Ỉ4.Ỉ9]. Chuỗi acyl này có thể có nhóm keto hay nhóm ở vị trí c thứ 3. Các

phân tử Acyl HSLs khuếch tán vào các tế bào đích {target cell] {hình ỉ 4.19]. Khi đạt đôn hàm lượng đù lớn, các phàn từ Acyl HSLs sẽ bám vào các protein thụ thể đặc biệt [R] và gây ra sự thay đổi cấu trúc protein. Thông thường khi phức hệ HSLs-protein được hoạt hóa, chúng có tác dụng như chất cảm ứng, chúng bám vào các điểm đích trên ADN và kích thích sự phiên mà của các gen nhạy cảm với nồng độ tê bào tới hạn. Các gen cân thiêt đê tổng hợp HSL cũng được tạo ra thường xuyên, đo đó nhiều chất tự càm ứng được tổng hợp và giải phóng, Ỏ vi khuẩn Gram âm, rất nhiều quá trinh nhạy cảm với các tín hiệu acyl HSL và cảm ứng mật độ. Một số ví dụ đã được nghỉên cứu kỹ đó là [1] sự sản sinh chất phát quang sinh học [bioluminescence] bởi Vibrio fischeri, [2] Pseudomonas aeruginosa tổng hợp và giải phóng các yếu tố gây bệnh, [3] Sự chuyển các yếu tố di truyền nhờ quá trình tiếp hợp ở Agrobacterium tumefaciens, và [4] Sự sản xuất kháng sinh ở Erwinia carotovora và Pseudomonas aureofaciens. Vi khuẩn Gram dương cũng điều hòa hoạt động bằng cảm ứng mật độ, thông thường bằng tín hiệu là cảc oligopeptít. Các ví dụ điển hình đó là sự tiếp họp ờ Enterococcus faecalis, kích thích khả năng tải nạp ADN [competence induction] ở Streptococcus pneumoniae, sự kích thích tạo bào tử ở Bacillus snbtỉỉỉs, và sự sản sinh rất nhiều độc tố và các yếu tố gây bệnh ở Staphylococcus aureus. Cảm ứng mật độ thậm chí kích thích sự phát triển khuẩn ty khí sinh và tạo streptomycin ở Streptomyces griseus. Đối với trường họp của Streptomyces griseus thì có lẽ tín hiệu là y-butyrolaton chứ không phải là oligopeptit. Chức năng quan trọng nữa đáng quan tâm của cảm ứng mật độ đó là sự đẩy mạnh việc tạo màng sinh học [biofiim] bởi vi khuẩn gây bệnh Pseudomonas aeruginosa, và có thể nó đóng vai trò quan ừọng ừong bệnh xơ hóa u nang [crystic fibrosis]. Sự tạo màng sinh học rất có ý nghĩa đối với vi sinh vật gây bệnh vì nó bảo vệ vi khuẩn khỏi sự tấn công của kháng sinh và các chất tẩy rửa. Sự điều chỉnh mật độ tể bào có thể rất hiệu quả bên trong màng sinh học do hàm lượng acyl HSL ít bị pha loãng và có thể tăng lên nhanh chỏng. Trong điều kiện này, hai loại vi khuẩn khác nhau có thể kích thích nhau bàng cách sàn xuất ra các tín hiệu tương tự nhau, đó là trường hợp màng sinh học có chứa các vi khuẩn gây bệnh p. aeruginosa và Burkhoderia cepacia. Cảm ứng mật độ là một ví dụ về sự hoạt động đa tế bào trong đó các cá thể giao tiếp và hợp tác hoạt động như là một đom vị thổng nhất. Các ví dụ khác về hoạt động phức hợp như ưên đó là sự hình thành các dạng khuẩn lạc và sự hình thành thể quả ở Niêm vi khuẩn {Myxobacteria].

Chương 15

ứ c CHÉ VI SINH VẬT BẰNG CÁC TÁC NHÂN VẬT LÝ VÀ HÓA HỌC

Mặc dầu đa số vi sinh vật là có ích và cần thiết cho nhân loại, nhưng hoạt động của vi sinh vật cũng có thể gây nên nhiều tác hại cho con người. Chẳng hạn như việc gây nên các bệnh tật cho người, gia súc, gia cầm, việc làm hư hỏng thực phẩm, nguyên vật liệu... Vì vậy chúng ta phải nắm vững các phương pháp để tiêu diệt hoặc ức chế các vi sinh vật có hại, làm giảm bớt các thiệt hại do chúng gây nên. Chủ yếu lả : [1] - Tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh và càn trở sự lan truyền của chúng. [2] - Giảm bớt hoặc hạn chế các vi sinh vật gây ô nhiễm nguồn nước, thực phẩm và phá hủy các nguyên vật liệu khác. Trong một thời kỳ rất dài, từ khi chưa biết đến sự tồn tại của vi sình vật thỉ tổ tiên chúng ta đã biết không ít các biện pháp để tiêu độc và diệt khuẩn. Người cổ Ai Cập đã biết dùng lửa để diệt khuẩn, dùng các chất tiêu độc để xử lý các vật thối rữa. Người c ổ Hy Lạp đã biết cách xông sulfiia để bảo quản các vật liệu kiến trúc. Người Hê-Brơ [Hebrews] đà có luật thiêu hủy toàn bộ quần áo của những người bị bệnh hủi. Hiện nay, việc nắm vững các kỹ thuật tiêu diệt vi sinh vật vẫn hết sức quan trọng, chẳng hạn như việc sử dụng kỹ thuật vô khuẩn trong nghiên cứu vi sinh vật, việc bảo quản lương thực, thực phẩm, việc phòng chống các bệnh truyền nhiễm... 15.1. ĐỊNH NGHĨA THUẬT NGỮ - Diệt khuẩn hay Khử trùng [sterilization]: Từ gốc La Tinh sterilis là tuyệt dục, vô sinh. Cỏ nghĩa là tiêu điệí tất cả vi sinh vật, bào tử, virut, viroid. Để diệt khuẩn cỏ thể dùng các chất diệt khuẩn [sterilant] hoặc dùng các nhân tố vật lý khác. - Tiêu độc hay Khử độc [disinfection] là tiêu diệt, ức chế hoặc loại trừ các vi sinh vật gây bệnh... Mục tiêu chủ yếu là tiêu diệt mầm bệnh nhưng trên thực tể cũng là làm giảm số lượng chung của vi sinh vật. Để tiêu độc cần dùng các chất tiêu độc [disinfectant]. Đỏ thường là các hóa chất và thường dùng để tiêu độc các vật liệu không phải là cơ thể người

và động thực vật. Các chất tiêu độc không diệt được bào tử và một sô vi sinh vật, vì vậy không thể dùng để diệt khuẩn. -Tiêu độc vệ sinh [sanitization] có liên quan mật thiết với tiêu độc. Trong quá trình tiêu độc vệ sinh số lượng vi sinh vật giảm xuông tới từ mức an toàn trở xuông đôi VỚI sức khỏe công cộng, tức là đạt đến tiêu chuẩn vệ sinh. Các chất tiêu độc vệ sinh [sanitizer] thường được dùng để làm sạch môi trường và các vật dụng không phải cơ thê người và động thực vật. - Phòng thối [antisepsis] là dùng hóa chất để khổng chế vi sinh vật sự sinh trưởng của vi sinh vật trên các tổ chức sinh vật [các mô]. Gổc Hy Lạp , anti là đối kháng, sepsis là nhiễm trùng máu. Chất phòng thối [antiseptic] nhiều người gọi là chất sát trùng là chưa chính xác, đễ nhầm với chất diệt khuẩn [sterilant]. Sử dụng chất phòng thối để phòng nhiễm khuẩn, mưng mủ nhờ tiêu diệt hay ức chế vi sinh vật gây bệnh, ngăn ngừa sự sinh trưởng cùa vi sinh vật trên các mô của sinh vật, giảm thiểu tổng số vi sinh vật. Độc tính của chất phòng thối thấp hơn chất tiêu độc là vì cần tránh việc làm chết quá nhiều tế bào của các mô. - Chất kháng vi sinh vật [antimicrobial agent] được chia thành nhiều loại. Chất diệt khuẩn [germicit], gốc La Tinh cide là giết chết, là chất có thể tiêu diệt các vi sinh vật gây bệnh [pathogens]. Như vậy tiếng Việt có hai chừ Chất diệt khuẩn để chỉ cả germicit lẫn sterilant. Thực chất các chất nảy cũng gần giống nhau, sterilant có phạm vi diệt khuẩn rộng hơn germicit. Các chẩt diệt nấm [fungicide], chẩí diệt tảo [algicide], chất diệt virut [viricide] để chi các chất tiêu diệt từng đối tuợng riêng biệt. Có nhừng hóa chất không làm chết được vi sinh vật nhưng có thể ức chế sự sinh trưởng của chúng. Có thể thường gặp các chất úc chế vi khuẩn [bacteriostatic], chất ức chế nẩm [fungistatic], theo gốc Hy Lạp thì statikos là đình chỉ. Tất cả cảc chất nói trên thường định nghĩa dựa trên ảnh hường đối với các vi sinh vật gây hại. Có loại giết chết, có loại ức chế, nhung trong hầu hết các trường hợp đều làm giảm tổng sô vi sinh vật nói chung [không chỉ riêng đối với các vi sinh vật gây bệnh]. 15.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP TIÊU DIỆT VI SINH VẬT Dưới tác dụng của một số nhân tổ gây chết quần thể vi sinh vật không chết ngay toàn bộ. Giông như sự sinh trưởng của quần thể , sự chết của quần thể vi sinh vật thường xảy ra theo phương thức chỉ số [exponential] hay phương thức logarit [logarithmic]. Có nghĩa là quân thê vi sinh vật sẽ giảm xuông tương ứng với khoảng cách thời gian. Lay thời gian gây chết là trục hoành ta có đuợc đường biểu thị là một đường thẳng. Sau khi giảm đa số vi sinh vật sống thì tốc độ chết của vi sinh vật cũng giảm. Đó là vì tính đê kháng khá cao của các vi sinh vật sống sót. 88

Báng 15.1: Thí nghiệm giết vì sinh vật bằng nhiệt theo lý thuyết [Theo sách của Prescott, Harley và Klein] Phút

Số lurợng vi sinh vật theo số p h ú t

s ố lư y n g vi sinh v ậ t bị chết tro n g 1 p h ú t

L o g I0 c ủ a sổ lư ọìig vi sinh v ậ t sổng

106

105

10*

104

9 X 103

103

102

ỉ

10’

0,9

-1

Để nghiên cứu hiệu lực của nhân tố gây chết phải xác định khi nào thì vi sinh vật chết. Đó là chuyện rất khó, vi khó xác định được đối với từng tế bào.Sau khi đưa vi khuẩn vào môi trường nuôi cay trong điều kiện có thể sinh trưởng bình thường mà thấy chúng không sinh trưởng được thì chứng tỏ ỉà chúng đã chết. Với virut nếu không cảm nhiễm được nữa vào vật chủ binh thường thì cũng chửng tỏ là đã chết.

Thòi giw xừ lý[múi]

Hình 1S.Ỉ: Phương thức chểt cùa vi sinh vật. [Theo sách cùa Prescott, Harley và Klein]. Xừ lý ờ 12ỉ°c, trong vi dụ D 12 ỉ là trong 1 phút.

15.3. CÁC ĐIỀU KIỆN ẢNH HƯỞNG ĐÉN HIỆU QUẢ CỦA CÁC NHÂN TỚ KHÁNG VI SINH VẶT Làm chết và ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật không đơn giản, bời vi nhân tô kháng vi sinh vật [nhân tố làm chết hoặc ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật] là chịu ảnh hưởng của ít ra là 6 yếu tố sau đây: 1. Số lượng quàn thể vi sinh vật: Vì trong mỗi khoảng cách thời gian số lượng vi sinh vật chết theo một cấp số bằng nhau, cho nên thời gian làm chết một lượng lớn vi sinh vật sẽ đài hem so với một lượng nhò vi sinh vật. Có thể tham khảo sổ liệu ở bảng 15.1 và hình 15.1. Cùng nguyên lý như vậy đỗi với các nhân tố hóa học kháng vi sinh vật. 2. Thành phàn quần thể vi sinh vật: các vi sinh vật khác nhau có tính mẫn cảm khác nhau với một nhân tố gây chết: Vì vậy cùng một nhân tổ gây chểt trong các tình huống khác nhau, với các loài vi sinh vật khác nhau thì hiệu quả tác dụng cũng rẩt khác nhau. Ví dụ, bào tử của vi sinh vật có tính đề kháng cao hơn rõ rệt so với các tế bào dinh dưỡng và các tế bào non. Một số loài vi sinh vật có tính chống chịu cao hơn so với các ảnh hưởng bất lợi của các loài khác. Ví dụ vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis gây bệnh lao có tính chống chịu với các nhân tố kháng vi sinh vật cao hơn so với các vi khuẩn khác. 3. Nồng độ và cường độ của một nhân tố kháng vi sinh vật: Thông thường [không phải mọi trường hợp] nồng độ càng cao của một nhân tố hóa học hay cường độ càng cao của một nhân to vật lý làm cho tốc độ vi sinh vật chết càng nhanh. Nhưng hiệu suất của các nhân tố không phụ thuộc trực tiếp vào nồng độ và cường độ. Trong một phạm vi tương đối nhò thì một sự tăng nhỏ về nồng độ và cường độ cỏ thể làm tăng hiệu ứng gây chết cùa nhân tổ kháng vi sinh vật. Vượt qua khoảng xa hon thì tiếp tục nâng cao nồng độ và cường độ không làm tăng tổc độ gây chết vi sinh vật. Có lúc, ở nồng độ thấp hơn lại có hiệu quả cao hem, ví dụ cồn 70% cỏ hiệu quả diệt khuẩn cao hơn cồn 95%, bởi vì hoạt tính của chúng được nâng cao khi có mặt của nước. Có tài liệu cho ràng với nồng độ cồn cao phần protein bên ngoài tế bào vi khuẩn sẽ ngưng tụ lại làm thành một vỏ bọc che chở cho vi khuẩn. 4. Thời gian tác đụng: Thời gian tác đụng của nhân tố kháng vi sinh vật càng dài thì sô lượng vi sinh vật chêt càng nhiêu {hình J5.1]. Đẻ đạt đến mục đích diệt khuẩn thì thời gian tác dụng phải đủ để cho tỷ lệ sổng sót chỉ còn 10'6 hoặc thấp hơn nữa. 5. Nhiệt độ: Tăng nhiệt cỏ thể làm tăng hiệu quả hoạt tính của hóa chất. Thông thường với một nông độ thâp của chât tiêu độc [disinfectant] hay nhân tố diệt khuẩn cần xử lý ờ nhiệt độ cao hcm. 6. Môi trường bên ngoài vi sinh vật: Việc khống chế quần thể vi sinh vật không tách rơi ma găn von cac nhân tô môi trường, hoặc lam tăng hay làm giảm tác động gây chết. Ví đụ trong đieu kiện axit, nhiệt độ cỏ hiệu quả diệt khuân cao hơn, do đó đối với các đồ uống 90

có tính axit như nước quả, nước cà chua thì dễ diệt khuẩn theo kiểu Pasteur [pasteurise] hơn so với các thực phẩm có pH cao hơn như là sữa chẳng hạn. Nhân tố môi trường quan trọng thứ hai là một số chất hữu cơ có thể bảo vệ vi sinh vật đề kháng với tác dụng cùa nhiệt độ hay của các chất tiêu độc hóa học. Màng sinh học [biofilm] là một vi dụ rất rõ. Các chất hữu cơ trên bề mặt của màng sinh học sẽ bảo vệ các vi sinh vật tạo thành màng sinh học, cho nên màng sinh học và các vi sinh vật trong đó rất khỏ trừ khử. Vì vậy trước khi diệt khuẩn hay tiêu độc một sổ vật phẩm trước hết cần rửa sạch. Đối vói ống tiêm và các dụng cụ y khoa hay nha khoa trước khi diệt khuẩn cần phải rửa sạch để tránh sự có mặt quá nhiều chất hữu cơ giúp bảo vệ cho mầm bệnh và làm tăng nguy cơ nhiễm khuẩn. Khi chế tạo nước uống cũng cần chú ý là nguồn nước thành phố vẫn còn chứa khá nhiều chất hữu cơ cho nên cần dùng nhiều cỉorit mới đủ sức tiêu độc. 15.4. SỬ DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP VẬT LÝ ĐẺ KHỐNG CHÉ VI SINH VẬT Tăng nhiệt vả việc đùng các phương pháp vật lý khác thường được dùng để diệt khuẩn. Các phòng thí nghiệm vi sinh vật đều dùng các nồi hấp áp suất cao [autoclave] để diệt khuẩn. Tăng nhiệt, qua lọc, chiếu tia tử ngoại, dùng bức xạ điện ly là 4 phương pháp vật lý thường được sử dụng. 15.4.1. Tăng nhiệt Người Cổ Hy Lạp đã biết dùng lửa hay đun nước sôi để diệt khuẩn hay tiêu độc. Tăng nhiệt đến nay vẫn là phương pháp thường dùng nhất để diệt khuẩn. Chù yếu có phương pháp dùng sức nóng ẩm và sức nóng khô. Sức nóng ẩm dễ dàng gây chết virut, vi khuẩn và nấm [bảng 15.2]. Trong nước sôi sau 10 phút có thể làm chết các tế bào dinh dưỡng và bào tử của các vi sinh vật cỏ nhân thực. Nhưng nhiệt độ sôi [100°C] không đủ sức làm chết nội bào tử của vi khuẩn. Bào tử vi khuẩn có thể tồn tại vài giờ trong nước sôi. Do đó cách đun sôi chỉ đùng để đun nước uống hoặc đề tiêu độc các vật phẩm không bị phá hủy trong nước sôi, không thể đùng để diệt khuẩn. Vì tẫng nhiệt là biện pháp rất quan trọng để khống chế vi sinh vật cho nên cần có một tiêu chuẩn chính xác đổi với hiệu suất diệt khuẩn bàng sức nóng [heat-killing efficiency]. Trước đây đùng điểm gây chết đo nhiệt [thermal death point, TDP]. Đó là nhiệt độ thấp nhất đủ để diệt hết vi sinh vật trong dịch huyền phù [suspention] sau 10 phút. Nhưng vì vi sinh vật chết theo phương thức logarit, cho nên trên lý thuyết không có thể tiêu diệt hoàn toàn vi sinh vật ừong một mẫu vật, tức là phải kéo dài thời gian tăng nhiệt. Vì vậy có một phương thức biểu thị chính xác hơn và đã được tiếp nhận rộng rãi, đó là Thời gian giảm thiểu thập phân [decimal reduction time, D] hoặc gọi là Trị số D [D value]. Trị so D là thời gian cần thiết để diệt hết 90% vi sinh vật hoặc bào tử trong một mẫu vật ờ một nhiệt độ 91

nhất định. Trên một đồ thị bán logarit [semilogarithmic plot] thấy rõ sô lượng vi sinh vật biến đổi theo thời gian tăng nhiệt {hình Ị5.2]. Bảng 15.2: Điều kiện ước chừng để diệt khuẩn bằng sức nóng ẩm Vi sinh vật Nấm men Nấm sợi Vi khuẩn

Te bào đinh dưỡng 5 min., 50-60°C 30 min., 62°c 10min.,60-70°c

Virut

30 min., 60°c

Bào tử 5 min., 70-80°C 30 min., 80°c 2-trên 800 min., 100°c 0,5-12 min, 12ĩ°c

[Theo sách của Prescott,Harley và Klein] Trị số D là thời gian cần thiết để số lượng vi sinh vật giảm 10 lần. Trị số D liên quan đến tính đề kháng của vi sinh vật đối với các nhiệt độ khác nhau. Từ trị số D mà tính ra trị sổ z [Z value]. Trị số z là nhiệt độ tăng lên đủ để làm giảm 1/10 trị số D. Một cách biểu thị khác là trị số F [F value] đó là thời gian cần thiết [tính bằng min.] đủ để diệt hết một quần thể tế bào hoặc bào tử ở một nhiệt độ nhất định [thường là 121°C].

Nhiệt độ [X} Hình 15.2: Tinh toán trị số z. 92

Trị số D và trị số z được ứng dụng rộng rãi trông công nghiệp chế biến thực phẩm. Khi sản xuất đồ hộp cần xử lý nhiệt sau khi đưa thực phẩm vào hộp và hàn hộp lại. cần xử lý nhiệt để đủ mức diệt được vi khuẩn gây ngộ độc thịt Clostridium botulinum. Vi khuẩn nảy gây ra độc tố botulism rất nguy hiểm. Xử lý nhiệt độ đủ dài để làm cho số lượng bào từ của vi khuẩn này nếu có từ 1012 giảm xuống chi còn 1 bào tử [10°]. Trị số D đối với bào tử vi khuẩn này ờ 121°c là 0,204 min., vì vậy để tiêu diệt 1012 bào từ xuống còn 1 bào từ cần 12D hay 2,5 phút. Trị số z đối với Clostridium botuỉinum là 10°c - tức là tăng 10°c thì giảm được 10 lần trị số D. Nếu diệt khuẩn ở 11 l° c thì trị số D phải tăng 10 lần, tức là 2,04 phút và trị sổ 12D tăng lên đến 24,5 phút. Bảng ỉ 5.3 nêu lên trị so D và trị số z của một số vi khuẩn thường gặp trong thực phẩm. Cán cứ vào trị số D ở các nhiệt độ khác nhau để tính ra trị so z. Trị so z có thể dùng để tính toán mối quan hệ giữa nhiệt độ và thời gian sống sót của vi sinh vật. Trị số z là số nhiệt độ tăng đủ để làm giảm 10% trị số D. Trong đồ thị này trị sổ z là 10,5°c. Trị sổ D biểu thị bằng thang logarit. [Theo sách của Prescott, Harley và Klein]. Bảng 15.3: Trị sổ D và trị sổ z của một sế vi khuẩn gây bệnh gặp trong thực phẩm Vi sinh vât

Ctf chất

D[°C],phút

Z[°C]

Clostridium boiuỉinum

Đệm photphat

D12l=0,204

Cl.perfringens [chủng kháng nhiệt]

MT nuôi cấy

Dọo=3-5

6-8

Salmonella

Sản phẩm gà

D6o=0,39-0,40

4,9-5,1

Sản phẩm gà SP gà tây Dung dịch NaCl 0,5%

0*0=5,17-5,37

5,2-5,8 6,8 5,6

Staphylococcus aureus

D«=15,4 060=2,0-2,5

[Theo sách cùa Prescoít.Harỉey và Kĩein] Có 3 số liệu đối vói tụ cầu vàng [S. aureus], cho thấy tốc độ làm chết vi khuẩn này thay đổi phụ thuộc vào môi trường vả hiệu quả bảo vệ của chất hữu cơ. Với sức nóng ẩm phải cần nhiệt độ cao hơn 100°c thì mới có thể diệt được nội bào tử [endospores] của vi khuẩn, và cần có áp suất cao trong điều kiện bão hòa hơi nước. Thiểt bị diệt khuẩn thường dùng được gọi là autoclave [hình ỉ 5.3] Hình ỉ 5.3: Hai loại autoclave nhỏ và lớn. 93

v ề cơ bản autoclave cùng tương tự như nồi hầm chịu áp lực vẫn thường dùng trong gia đỉnh. Tùy yêu cầu mà có cái dùng lửa, có cái dùng điện, có cái dùng hơi nước chuyên vào có cái nhỏ, cỏ cái vừa, cỏ cái lớn hoặc rât lớn. Autoclave do nhà khoa học Chamberlanđ phát minh ra vảo năm 1884 và phát minh nảy đã thúc đây sự phát triên của Vi sinh vật học. Autoclave phải có van để đầy hêt không khí ra và trong nôi chỉ còn có hơi nước bão hòa. Có thể đóng van ngay tù đầu đợi áp lực nâng lên một ít rồi mới mở van để loại hết không khí ra. Cũng có thể mờ van ngay từ đầu, khi thấy hơi nước bay ra nhiều mới đóng van lại. Thường diệt khuẩn ở 121°c [áp suất 15 pounds] trong 15 phút. Có thể diệt hết mọi tế bào vi sinh vật và bào từ. Diệt khuẩn bằng sức nóng ẩm thông qua việc phá hủy axit nucleic, làm biến tính enzym và các protein khác, đồng thời còn có thể phá vỡ màng tế bào mà làm chết vi sinh vật. Diệt khuẩn bằng sức nóng ẩm phải tiến hành triệt để mới có hiệu quả. Khi chưa loại bò hết không khí thì ở áp suất 15 pound nhiệt độ không thể đạt đến 121 °c. Các vật cần xử lý không nên xếp chật quá cân trở việc tiếp xúc với hơi nước nóng. Lúc diệt khuẩn một bình cỏ thể tích lớn thì phải giữ thòi gian dài hơn, để làm cho toàn bộ dịch thể phải đạt tới

121°c. Chẳng hạn khi diệt khuẩn ở bình 5 lít thì phải xử lý trong 70 phút. Để khắc phục các nhân tổ nói trên người ta thưởng xếp kèm với sinh vật chí thị khi diệt khuẩn các vật phẩm. Khi đó dùng ống [ampule] chứa môi trường dinh dường vô khuẩn có thêm mành giấy cỏ tẩm bào từ vi khuẩn Bacillus stearothermophilus hay Clostridium, sp PA3679. Diệt khuẩn xong phá vờ ống trong điều kiện vô khuẩn và nuôi cấy vài ngày. Nấu sinh vật chỉ thị không sinh trưởng thì là việc diệt khuẩn đă thành công. Người ta thường xử lý nhiệt ở độ sôi đối với sừa và nhiều chất khác. Phương pháp này gọi là phương pháp khử trùng Pasteur [Pasteurization] để kỳ niệm phát minh này của ông. Vào thập kỷ 60 của thế kỷ 19 do rượu vang bị nhiễm khuẩn, gây khó khăn cho việc bảo quàn và vận chuyên, gây khó khăn cho việc sản xuất rượu vang ở Pháp. Pasteur đã đùng kính hiển vi quan sát thấy các trong rượu bị ô nhiễm có mặt các vi khuẩn lên men lactic và axetic. Ong thây xử lý ở nhiệt độ 55-60°C có thể làm chết các vi sinh vật này và có thể bảo quản tương đối lâu dài rượu vang. Năm 1886 hai nhà hóa học Đức là V.H.Soxhlet và F.Soxhlet sử dụng kỹ thuật này đê bảo quản sữa và làm giảm việc sừa lây truyên mâm bệnh. Năm 1889 phương pháp tiêu độc Pasteur vói sữa được nhập vào Hoa Kỳ và người ta đã dùng phương pháp này đê xử lý sữa, bia, và nhiều loại đồ uổng khác. Phương pháp tiêu độc Pasteur không đạt tới mục đích diệt khuẩn nhưng đủ làm chết các vi khuãn gay bẹnh, giàm mạnh các vi khuân không gây bệnh nhưng ỉàm hư hỏng thực phẩm và lam chậm rõ rệt tôc độ biến chất của thực phẩm

Có thể có hai phương pháp khử trùng sữa. Phưcmg pháp tương đối cổ là xử lý ở 63 °c trong 30 phút. Còn phương pháp hiện thường được sử dụng là phương pháp khử trùng ngắn [flash Pasteurization], còn gọi là phương pháp khử trùng ngắn ở nhiệt độ cao [hightemperature short-term, HTST], tức là xử lý ờ 72°c chỉ trong 15 giây, sau đó nhanh chóng làm lạnh. Trong công nghiệp thực phẩm có lúc cũng còn dùng phương pháp khừ trùng siêu nhiệt [ultrrahigh temperature, UHT], tức là xừ lý sữa và các sàn phẩm sữa ở nhiệt độ 140150°c chi trong 1-3 giây. Sữa xử lý siêu nhiệt không cần bảo quản lạnh, có thể bảo quản hai tháng an toàn ở nhiệt độ phòng. Các gói cà phê kem [coffee creamer] cung cấp ở khách sạn thường được diệt khuẩn theo phương pháp này.

Hình ĩ 5.4: Tủ sấy nhiệt độ khô. Nhiều vật phẩm cỏ thể diệt khuẩn bằng sức nóng khô ídry heat sterilization]. Đưa các vật phẩm này vào tủ sấy và giữ nhiệt độ 160-170°c trong 2-3 giờ. Vi sinh vật bị chết do bị oxy hóa các thành phần tế bào, và lảm biển tính protein. Mặc dầu diệt khuẩn băng sức nóng khô không có hiệu quả cao như bằng sửc nóng ẩm. Bào tử của vi khuẩn Clostridium botuỉinum bị chết ở 121°c sau 5 phút khi dùng sức nóng ẩm nhưng chỉ bị chết như vậy ở 160°c sau 2 giờ. Diệt khuẩn bằng sức nóng khô cỏ những ưu thế riêng vì không làm ăn mòn các vật liệu thủy tinh và kim loại như sức nóng ẩm, có thể dùng để xử lý các dạng bột, dầu và các chất tương tự. Hầu hết các phòng thí nghiệm xử lý hộp Petri và các pipét bằng sức nóng khô. Không thích hợp sử dụng phương pháp này để xử lý các vật phẩm bàng chất dẻo và cao su. 15.4.2. Nhiệt độ thấp Nhiệt độ thấp được sử dụng để ức chế sự sinh trường và phát triển cùa vi sinh vật. Đây là phương pháp quan trọng ngành vi sinh vật học thực phẩm. Ở nhiệt độ '20 c hay thấp hơn vật phẩm bị đông lạnh, vi sinh vật bị đình chỉ sinh trưởng. Một sổ vi sinh vật bị 95

chết vì các tinh thể băng là phá vờ màng tế bào, nhưng lạnh sâu không làm chêt phân lớn các vi sinh vật nhiễm trên vật phẩm. Trên thực tế nhiều phòng thí nghiệm dùng các tủ lạnh sâu -30°c hay -70°c để bảo quản vi sinh vật. Vì thực phẩm đông lạnh có thể chứa nhiều vi sinh vật, cho nên khi làm tan băng phải xử lý ngay để tiêu thụ, tránh để tổn hại và đê cho các vi sinh vật gây bệnh phát triển. Bảo quản lanh giúp làm chậm sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, nhưng không đủ làm ngừng hẳn sự sinh ừưởng. Đáng mừng là phần lớn các vi sinh vật gây bệnh là thuộc loại ưa ấm [mesophilic] và không sinh trưởng được ở nhiệt độ 4°c. Các vật giữ lạnh bị hư hỏng bời các vi khuẩn ưa lạnh [psychrophilic] và chịu lạnh [psychrotrophic] nhất là khi có tồn tại nước, các tủ lạnh chỉ dùng để bảo quản ngắn hạn thực phẩm và các vật phẩm khác. 15.4.3. Qua lọc Phương pháp qua ỉọc là phương pháp rất tốt để giảm thấp quàn thể vi sinh vật đối với các vật liệu mẫn cảm với nhiệt độ và nhiều khi có thể dùng để diệt khuẩn các đung dịch. Qua lọc chi đơn giản là loại vi sinh vật khỏi đung dịch chứ không phải là diệt khuẩn. Có hai loại lọc vi sinh vật. Thiết bị qua lọc tầng sâu [depth filter]: đó là loại thiết bị cấu tạo bởi sợi hay các vật chất dạng hạt, tạo thành một bản lọc khá đầy với những lỗ rất nhỏ. Dưới sửc hút chân không dung dịch sẽ được lọc qua còn vi sinh vật bị giữ lại hay bị hấp phụ [adsorption] trên bề mặt bản lọc. Nguyên liệu để làm ra bản lọc này thường là đất Tảo silic [dímatomaceous earth] - đó là thiết bị lọc Berkeíìeld. Còn có thể đùng một loại sứ [unglazed porcelain] - đó là thiết bị lọc Chamberlain. Hoặc còn có thể dùng thạch miên [asbestos] hay các nguyên liệu khác. Gần đây người ta dùng thiết bị màng lọc [membrane filters] thay thể cho thiết bị qua lọc tầng sâu. Màng lọc hình tròn, dày khoảng 0,1 mm và được chế tạo bởi axetat xenluloz, nitrat xenluloz, polycacbonat, fluorit polyvinyliden hay các chất tổng hợp khác. Các màng lọc có lỗ với đường kính khoảng 0,2^m là cỏ thể đùng để lọc bò phần lớn các tế bào dinh dưỡng của vi sinh vật, trừ virut. Dịch lọc thường chỉ từ lml đến vài lít. Màng lọc được lấp cố định trên một giá đặc biệt {hình 15.5]

Hình 15.5: Thiết bị màng ỉọc: ỉ- Bình Erlenmeyer đựng dịch cần lọc. 2- Dịch lọc được đẩy sang thiết bị màng lọc nhờ mảy bơm. 3- Thiết bị màng lọc [với các loại hình các kích cờ khác nhau].

Dưới áp lực của máy hút chân không dịch lọc được chuyển sang một bình vô khuấn. Loại thiết bị màng lọc này được dùng trong ngành dược, lọc thuốc đau mắt, chuẩn bị các môi trường nuôi cấy, các loại dầu, chất kháng sính và nhiều vật chẩt kém chịu nhiệt khác. Phương pháp diệt khuẩn nhờ lọc còn dùng để lọc không khí. Hai ví dụ thường gặp là khẩu trang dùng trong ngoại khoa và nút bông dùng cho các ổng nghiệm hay các bình nuôi cấy vi sinh vật. Không khí đi qua được nhưng vi sinh vật thì bị giữ lại bên ngoài. Phòng cấy Laminar thoáng khí nhưng an toàn sinh học [Laminar flow biological safety cabinet] đã sử đụng màng lọc không khí bằng các hạt hiệu lục cao HEPA [high-effĩciency particulate filter]. Nó có thể lọc được đến 99,97% các hạt có kích thước 0,3jUm và được coi là một hệ thống lọc rất quan trọng. Người nuôi cấy vi sinh vật có thể thao tác thoải mái trong một phòng cấy mở một phần cửa nhưng rất an toàn nhờ luôn có một luồng không khí vô khuẩn được thổi từ phía trong và lại thoát ra qua màng lọc HEPA đặt ở phía trên. Khi thao tác với các vi sinh vật nguy hiểm như vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis, virut gây ung thư, các ÀDN tái tổ hợp... nhất thiết cần sử dụng phòng cấy này. Thiết bị này được dùng trong các phòng thí nghiệm, trong công nghiệp, như là công nghiệp dược phẩm, để chuẩn bị môi trường, thao tác thí nghiêm, nuôi cấy m ô...

Hình ỉ 5.6: Phòng cấy Laminar.

15.4.4. Bức xạ [radiation] Bức xạ tử ngoại [Ultraviolet radiation-UV] với bước sóng 260nm có hiệu ứng diệt khuẩn rất mạnh, tuy nhiên không cỏ khả năng xuyên qua thủy tinh, các màng bẩn, nước và một số cơ chất khác. Vì vậy u v chì dùng để diệt khuẩn trong một số trường hợp, ví dụ diệt 97

khuẩn không khí trong tủ cấy, phòng nuôi cấy hoặc bền ngoài một số vật thê. u v có hại đối với da và mắt cho nên phải tắt đèn u v trước khi vào làm việc nơi có đèn này. u v cũng có thể dùng để diệt khuẩn nước, phải là một tầng nước mỏng đi qua đèn u v đê đủ sức diệt mầm bệnh và các vi sinh vật khác.. Bức xạ ion hóa [ionizing radiation] hay bức xạ điện ly có sức xuyên rẩt mạnh và được dùng rất tốt để diệt khuẩn. Nó cỏ thể diệt cả tế bào dinh dưỡng lẫn bào tử vi khuẩn, cả vi sinh vật nhân nguyên thủy [procaryotic] lẫn các vi sinh vật có nhân thật [eucaryotic]. Tia gamma từ nguồn cobalt 60 được dùng để diệt khuẩn nguội đổi với chất kháng sinh, kích tố [hormones], chỉ khâu vết thương, các vật liệu y học bàng chất dẻo [plastic] như ống tiêm... Tia gamma còn được diệt khuẩn và tiêu độc [pasteurize] đổi với thịt và các thực phẩm khác. Bức xạ ion hóa có thể diệt các vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm như Escherichia coli 0157:H7, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni... Cả cơ quan quản lý thực phẩm và thuốc Hoa Kỳ [FDA] lẫn tổ chức Y tể thế giới [WHO] đều xác định tính an toàn của việc chiếu xạ này đối với thực phẩm. Đã có một nhà máy chiếu xạ thương phẩm ở gần Tampa [bang Florida]. Tiếc ràng phương pháp này chưa được ứng dụng rộng rãi tại Hoa Kỳ, nguyên nhân là đo giá còn cao và nhiều người còn lo ngại các ảnh hưởng bất lợi của việc chiếu xạ lên thực phẩm. Gần đây, Chính phủ Mỹ đã phê chuẩn việc chiếu xạ lên thịt gia cầm, thịt bò, thịt lợn, thịt bê, thịt cừu non, hoa quà, rau củ và các chất điều vị. Việc chiếu xạ trong tương lai sẽ ngày càng được ứng dụng rộng rãi. 15.5. SỬ DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC ĐẺ KHÓNG CHẾ VI SINH VẬT Mặc dầu người ta vẫn thường dùng các phương pháp vật lý để tiêu độc nhưng các tác nhân hóa học cũng thường được dùng để tiêu độc [disinfection] và phòng thối [antisepsis]. Cỏ nhiều nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả tiêu độc và phòng thối bàng phương pháp hóa học. Chẳng hạn như loài vi sinh vật, nồng độ và bản chất của các chất tiêu độc và phòng thối, thời gian xử lý,... Trước khi sử dụng các chất tiêu độc hay phòng thối thì bề mặt vật thể phải được làm sạch, cần đàm bảo sự an toàn khi dùng hóa chất trong các phòng thí nghiệm hay trong bệnh viện. Hóa chất cũng được đùng để phòng chổng sự sinh trường của vi sinh vật trong thực phẩm. Có nhiều loại hóa chất được dùng làm chất tiêu độc, mỗi loại đêu có những ưu đi êm và nhược điểm riêng. Trước khi chọn sử dụng hỏa chất nào phải hìêu rõ đặc tính của chât đó. Trong trường hợp pha rất loãng và có mặt chất hữu cơ thì chất đó van có thê tác dụng có hiệu quả lên các nhân tổ truyền nhiễm [vi khuẩn Gram đương, Gram âm, vi khuân kháng axit, nội bào tử của vi khuẩn, các loại nẩm và virut...], mặt khác lại phài không cô hại đoi với cơ thể ngựờì, không làm ăn mòn các vật phẩm nói chung. Trong thực tiễn, rẩt khó đạt đến tiêu chuẩn vừa có hiệu lực vừa ít độc đổi vổri cơ thể. Một sổ hóa chẩt tuy hiệu lực thấp nhưng vì khá vô hại nên vẫn được sử đụng. Chẩt tiêu độc phải ôn định khi bảo quàn, không có mùi vị khó chịu, tan trong nước và trong dầu để đễ xâm 98

nhập vào vi sinh vật và phải có sức căng bề mặt thẩp để xâm nhập được vào các khe trên bề mặt. Nếu giá không cao càng tốt. Một vấn đề nghiêm trọng là việc sử dụng quá mức Triclosan và các chất diệt khuẩn [germícits] khác. Chất kháng khuẩn [antibacterial] này hiện thấy có mặt trong các sản phẩm như chất khử mùi [deodorant], nước súc miệng, xà phòng, thớt cắt rau, đồ chơi trẻ em... Triclosan hầu như đang có mặt khắp nơi, hậu quả là đã xuất hiện các vi khuẩn kháng Triclosan. Ví dụ trực khuẩn mủ xanh Pseudomonas aeruginosa đã có thể bài xuất chất này ra khỏi tế bào. Tương tự như trường hợp vi khuẩn phản ứng với việc dùng quá độ thuốc khảng sinh, vi khuẩn cũng sẽ có sự đáp ứng như vậy khi dùng quá mức các chất phòng thối. Hiện đã cỏ bằng chứng cho thấy việc sử dụng rộng rãi Trìclosan đã làm tăng tần sổ xuất hiện các vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh. Vì vậy việc dùng quá mức các chất phòng thối [antiseptic] cỏ khả năng sinh ra những hậu quà khó ỉường. Băng 15.4: Nồng độ sử dụng và mức độ hoạt tinh của các chất diệt khuẩn thông đụng Nồng độ sử dụng

Mức độ hoạt tính*

450-500mg/L

Cao

Tương đối cao

8 + 70%

Cao

H20 2 ổn định

6-30%

Tương đối cao

Formaldehit dịch thể

6-8%

Tương đối cao

lodophors

750-5000mg/L

Tương đối cao

Iodophors

75-159mg/L

Tương đối thấp

lot + cồn

0,5 + 70%

Trung bình

Hợp chất của clo

0,1 -0,5%

Trung binh

0,5-3%

Tương đối thấp

Trung bình

70%

Trung bình

0,1-0,2% trong nước

Thấp

0,75-4%

Thấp

1-3%

Thấp

0,1-0,2%

Thấp

Hóa chất Dạng khí: Etylen oxít Dọng lòng; Glutaraldehit dịch thể Formaldehit + cồn

Họp chất của phenol, dịch thể lot, dịch thể Cồn [etyl,isopropyl] Hợp chất amoni bậc 4 Chlorohexidin Hexachlorophen Hợp chất thủy ngân

♦Hoạt tính cao-có thể làm chết vi khuẩn kể cà vi khuẩn lao, bào tử, nâm, virut; Hoạt tính trung bình' làm chết mọi vi khuẩn, trừ bào từ; Hoạt tính thấp- làm chết tế bào dinh dirỡng của vi khuân, trừ VK. lao, làm chết nấm, virut có lượng lipit mức trung bình. Theo Symour s. Block, 1983.

P rt*nol

Hsxa «

Ak:oihots OH I

C H ,—CH, ~O H Brianol

teopropanot

//° H.c cf

Akìetiyđea Ọ !! H C— H

H,c

Fof.-mktehyoe

Ọ JI

Ọ lĩ H

CHa CH,

C h,

Oularaktenyoe

ttolasMie

QuHl«ni.ftry a^n'n

C H ,„ W

° " M'

CHa

CH,

Gelylpyrkanfejm cMortđe

B« ilia Boữrtki m cM«fc*e

GaSèí. c H. “ c H,

CH ~CH

I I o— c

EUiytone OítO à Betac-roc+olaclùíie

ỉãnh 15.7: Câu trúc của một sổ chất tiêu độc và chất phòng thối thông dụng.

* Loại Phenol Phenol là chất phòng thối và tiêu độc được sử dụng rộng rãi đầu tiên. Năm 1867 Jozph Lister đã dùng phenol đê lam giam nguy hiêm cùa việc nhiễm vi sinh vật trong quá trình phẫu thuật. Hiện nay phenol và các dẫn xuất như các loại cresol, các loại xylenol và 100

orthophenylphenol đã được dùng để làm chất tiêu độc trong các phòng thí nghiệm và bệnh viện. Chất tiêu độc thương mại Lysol là một hợp chất loại phenol. Các chất loại phenol có thể làm biến tính protein và phá hủy màng tế bào. Chúng cỏ ưu điểm là có thể diệt vi khuẩn lao khi có mặt các chất hữu cơ. Sau khi sừ dụng có thể duy trì tác dụng khá lâu trên bề mặt vật thể. Nhưng chúng có mùi khó chịu và có thể làm kích thích da. Hexachlorophen là một chất phòng thối thường dùng vì có thể làm giảm số lượng vi khuẩn trên da và duy trì được khá lâu, nhưng nó lại có thể làm tổn thuơng não cho nên hiện chi dùng trong bệnh viện khi có sự bộc phát của tụ cầu khuẩn Staphylococcus.

*cồn Cồn là một trong những loại thuốc tiêu độc và thuốc phòng thối thường đùng, cồn có thể làm chết cả vi khuẩn và nấm nhưng không làm chết được bào tử. Một số virút chứa lipit cũng bị cồn làm chết. Etanol và Isopropanol là hai loại cồn thường dùng để diệt khuẩn, nồng độ thường dùng là 70-80%, nồng độ này làm biến tính protein, còn có thể làm hòa tan màng lipit. Để diệt khuẩn nhiệt kế và các dụng cụ nhỏ cần xử lý bằng cồn trong 10-15 phút.

* Các Haỉogen Halogen là một trong 5 nguyên tố thuôc nhóm VIIA của bàng tuần hoàn [Fluorin-F, Clorit-Cl, Bromine-Br, Iot-I và Astatine-]. Ở trạng thái tự do các phân tử tồn tại dưới dạng 2 nguyên tử liên kết với nhau. Cũng có thể tạo thành muối với natri [Na] hay các kim loại khác. I và C1 là hai loại kháng vi sinh vật quan trọng. I thường được dùng làm thuốc phòng ' thối [antiseptic] ngoài da. Nó làm chết vi sinh vật do oxy hóa các thành phần tế bào, iod hóa [iodinating] các protein. Với nồng độ cao có thể làm chết bào tử, nói chung là sừ dụng tinture d’iode [tinture of iot] - tức là IK với nồng độ 2 % hay cao hơn iot trong đung dịch nước-etanol. Mặc dầu I là chất phòng thối có hiệu quà nhưng cũng có thể làm tổn thương đa, có thể làm biến màu da, còn có thể gây dị ứng [allergíe]. Gần đây người ta sử dụng iodophore - hợp chất của I với một chất hữu cơ. Iodophor tan trong nước, không làm bẩn màu da, có thể giải phóng dần lot nên giảm tổn hại và giảm kích thích da. Loại tiêu độc da và dùng trong phòng thí nghiệm phổ biến là loại có nhàn hiệu là Wescodyne, còn loại tiêu độc vết thương thường dùng loại có nhãn hiệu là Betadin. lot thường được đùng để tiêu độc nước tiêu dùng tại thành thị và các bể bơi. Cũng được dùng trong công nghiệp sữa, công nghiệp thực phẩm. Có thể dùng khí clorit, natri hypoclorit hoặc canxi hypoclorit. Khi sử dụng chúng biến thành HCIO rồi giải phóng

101

nguyên tử ôxy: Sẽ xảy ra sự ôxy hóa các tê bào đinh dưỡng của VI khuân, nâm nhưng không có tác dụng với bào tử: CỈ2 +

H2O-* HC 1+ HCIO

Ca[OCl]2 + 2 H 2O -* Ca [OH]2 + 2 HCIO HC10-> HCl + O Dưới tác dụng của chúng hầu như tất cả vi sinh vật sẽ bị giết chết trong vòng 30 phút. Vì phản ứng của chất hữu cơ với tác động của Cỉ và các dẫn xuất của C1 nên đã can thiệp vào tác dụng diệt khuẩn của C1 cho nên người ta thường sử dụng quá lượng C1 để bảo đảm hiệu quả diệt khuẩn. Có một khả năng là C1 phản ứng với chất hữu cơ hình thành nên những hợp chất gây ung thư trihalometan, cho nên Ưong nước uống cần phải kiểm tra sự tồn tại của chất nảy. Tại Châu Ầu và Canada đôi khi người ta sử dụng thành công ozon để thay thế cho việc clorit hóa [chlorination]. Cl là một chất tiêu độc tốt, khồng đẳt, lại đễ dàng sử đụng nên rất hay được sử dụng. Với một lượng nước uống nhỏ có thể tiêu độc bằng những viên halozon. Halozon [axit parasulfone dichloramidobenzoic] sau khi đưa vào nước sẽ từ từ giải phóng ra clorit, sau khoảng nửa giờ có thể đạt tới mục đích tiêu độc. Chất này thường được sừ dụng trong trường hợp thiếu nước sạch để uống. Dung dịch C1 là chất tiêu độc có hiệu quả trong gia đình và trong các phòng thí nghiệm. Cỏ thể dừng nồng độ pha loãng 100 lần dịch tẩy tráng gia dụng [household bleach] phối hợp với chất tẩy không ion hóa [non ionic detergent] sao cho nồng độ chất tẩy vào khoảng 0,8%. Hỗn hợp này vừa làm sạch vừa loại bỏ vi khuẩn

* Các Kim loọi nặng Trong nhiều năm các ion kim loại nặng như Hg, Ag, As, Zn và Cu thường được dùng để làm chất diệt khuẩn [germicits]. Nhiều kim loại nặng có tác dụng ức chế vi sinh vật [bacteriostatic] hom là diệt khuẩn. Hiện các chẩt này đã được thay thể bàng các chất khác vì có độc tỉnh thâp hơn và có hiệu quả hơn. Nhưng cũng cỏ thường hợp ngoại lệ, ví dụ đung dịch 1% AgNOj thường được dùng làm thuốc nhỏ mắt để phòng bệnh lậu ở mắt [trong nhiều bệnh viện người ta đùng Erythromycin để thay thế hitrat bạc vì chất kháng sinh này có hiệu quả chống cả Chlamydia lẫn Neisseria]. Bạc sulfadiazine thường được đùng trong điều trị bỏng. C11SO4 thường được dùng để diệt tào có hiệu quà trong ao hồ vả các bể bơi. Kim loại nặng kết hợp với protein , làm bất hoạt protein và cũng cỏ thể làm kết tủa protein cùa tế bào.

102

* Các muối amoni bậc bốn [QuateARNiy Amoniium Compounds] Các chất tẩy [Detergents - từ gốc La Tinh detergerecó nghĩa là loại trừ] là những phân tử hữu cơ được dùng làm các chất giữ ẩm [wetting agents] và nhũ hóa [emulsifiers] vì chúng vừa có cực thân nước [polar hydrophilic] vừa có những gốc phi cực kỵ nước [nonpolar hydrophobic ends]. Chúng có thể làm tan các chất khỏ hòa tan bời các phương pháp khác, vì vậy dùng làm chất tẩy rửa, giặt giù rất có hiệu quả, nhưng cơ chế khác với các chất béo có trong xà phòng. Mặc dầu các chất tẩy dạng ion có chức năng kháng vi sinh vật nhất định nhưng chỉ có các chất tẩy rửa cationic [ion dương] mới cỏ tác dụng tiêu độc. Thường dùng nhất là các muối amoni bậc bốn, chúng làm phả vỡ mảng tế bào, cũng có thể làm biến tính protein. Các chất tẩy cationic như Benzalkonium clorit và Cetylpyridinium clorit có thể giết chết phần lớn vi khuẩn nhưng không giết được vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis và các nội bào tử. Chúng có ưu điểm là ổn định, không độc và không gây kích thích... nhưng lại bị mất tác dụng trong nước cứng [hard water] và nước xà phòng. Các chất tẩy cationic thường được dùng để làm chất tiêu độc đối với bát đĩa, các thiết bị nhỏ và để xử lý ngoài da. Zephiran có chứa benzalkonium clorit và Ceepryn cỏ chúa cetylpyridinium, clorit là các mặt hàng thường gặp trên thị trường.

* Các Aldehit Hai loại aldehit thường được sử dụng là Formaldehit và Glutaraldehií. Chúng cỏ phàn ứng rất mạnh, có thể kết hợp với axit nucleic và protein và làm bất hoạt chúng, còn có thể lảm bất hoạt thông qua việc liên kết chéo [crosslinking] và alkyl hóa [alkylating]. Chúng có thề làm chết bào tử, có thể dùng làm chất diệt khuẩn hóa học. Formaldehit thuờng được dùng dưới dạng hòa tan trong nước hay trong cồn. Dung dịch đệm 2% glutaraldehit là một loại chất tiêu độc có hiệu quả và thường đuợc dùng để tiêu độc các phòng thí nghiệm và bệnh viện. Glutaraldehit trong 10 phút đã đủ để tiêu độc nhưng để giết chết bào tử cần tới 12 giờ.

* Các khi diệt khuẩn Có nhiều vật phẩm không chịu được nhiệt độ cao như các đĩa Petri bang chất dèo, các ống tiêm nhựa, các bộ phận của máy tim-phổi nhân tạo, các ổng dẫn, ống nói... cần diệt khuẩn bằng khí etylen oxìt [EtO]. EtO có thể kết hợp với protein, có thể làm chết cả vi sinh vật lẫn bào tử. EtO nhanh chóng xuyên qua được các bao bì bằng chất dẻo nên là một loại chẩt tiêu độc đặc biệt hiệu quả.

103

Tiêu độc bàng EtO rất giông với tiêu độc trong nôi cao áp. Cân không chê nông độ Eto, nhiệt độ và độ ẩm. Với EtO thuần khiết thường dùng nồng độ 10-20% phối hợp với CƠ 2 hay dichlorodifiuorrometan. Với các vật dụng sạch cân xử lý ở 3&°c trong 5-8 giờ, nếu ở 54°c cần xử lý trong 3-4 giờ. Nồng độ EtO là là 700mg/lít.Vì EtO cỏ độc tính lcm cho nên sau khi tiêu độc cần thổi khí mạnh để loại trừ hết EíO đi. Betapropiolacton [BPL] củng là loại khí dùng để tiêu độc. Trong ừạng thái lỏng BPL dùng để tiêu độc vãcxin và huyết thanh. BPL sẽ bị phá hùy thành dạng vô hoạt tính sau vài giờ chứ không khó loại trừ như EtO. Năng lực diệt khuẩn tuy cao hem E to nhưng khả năng xuyên thấu qua vật liệu lại kém hơn so với EtO. Hơn nữa chất này cỏ thể gây ung thư cho nên không được ứng dụng rộng rãi như EtO. Gần đây hydro peroxit đạng bay hơi cũng được dùng để tiêu độc các phòng thao tác an toàn sinh học.

15.6. ĐẢNH GIÁ HIỆU L ự c CỦA CÁC TÁC NHÂN KHÁNG VI SINH VẬT Tại Hoa Kỳ việc đánh giá các tác nhân kháng vi sinh vật được thực hiện bời hai cơ quan khác nhau: Cơ quan quản lý các chất tiêu độc bảo vệ môi trường và Cơ quan quản lý Thực phẩm và dược phẩm, cần đánh giá các tác nhân này có hiệu quả kháng vi sinh vật hay không, có hiệu lực từ nồng độ nào. Sau đó tiến hành trên từng ứng dụng thực tiễn. Phổ biến nhất là thí nghiệm hệ số phenol [phenol coefficient test], tức là so sánh hiệu lực cùa một số chất tiêu độc với phenol. Đầu tiên pha loãng với các mức độ khác nhau, sau đó cấy vào các độ pha loãng này vi khuẩn thương hàn Salmonella typhi và tụ cầu vàng Staphylococcus aureus, để ở 20°c hay 37°c. Sau 5 phút lại cấy sang môi trường mới và nuôi cấy tiếp 2 ngày hay lâu hơn. Độ pha loãng cao nhất trong 10 phút có thể diệt hết vi khuẩn được dùng để tính toán Hệ sổ phenol. Lấy bội số pha loãng của chất thừ nghiệm chia cho bội số pha loãng phenol đạt hiệu quả như nhau thì thu được Hệ số phenol. Ví dụ bội số pha loãng của phenol là 90 mà bội số pha loãng của chất tiêu độc thử nghiệm là 450 thì Hệ sô phenol là 5. Hệ sô phenol càng cao thì biểu thị chất thử nghiêm có năng lực tiêu độc trong cùng điều kiện thí nghiệm càng cao. Hệ số phenol càng cao hơn 1 thi biểu thị năng lực tiêu độc càng cao hơn phenol [bảng ỉ 5.5]. Hệ sô phenol là có ích để sơ bộ lựa chọn chất tiêu độc, nhưng trong quá trình ứng dụng thực tể không thể dùng để biểu thị hiệu lực cao thấp của chất tiêu độc. Bời vì hệ số phenol là sô liệu thu được ừong những điêu kiện thỉ nghiệm nhất định, với các vi sinh vật thuần chủng, còn ừong thực tế với một quần thể vi sinh vật phức tạp, có tồn tại các chất hữu cơ, chât vô cơ, với các pH, nhiệt độ khác nhau..., hiệu lực của chất tiêu độc chịu ảnh hưởng rất nhiều vào các nhân tố môi trường khi sử đụng.

104

Bảng 15.5: Hệ sô phenol của một sô chat tiêu độc Chất tiêu độc Phenol Cetylpyridinium clorit O-phenylphenol p-cresol Hexachlorophen Merthiolat Mercurocrom Lysol Isopropyl alcohol Etanol Dung dich 2%I2 trong cồn

Với s.typỉn* ì 228 5,6 [20°C] 2,0-2,3 5-15 600 2,7 1,9 0,6 0,04 4,1-5,2

Vói S.aureus* 1 337 4,0 2,3 15-40 62,5 5,3 3,5 0,5 0,04 4,1-5,2

*Nhĩmg chỗ không chú thích là xừ lý ở 37°c. Muốn đánh giá thực tế hơn hiệu lực của các chất tiêu độc có thể tiến hành các phương pháp thử nghiệm khác. Trên thực tế so sảnh các chất hóa học khác nhau để kiếm tra tốc độ diệt khuẩn. Có thể dùng Thử nghiệm pha loãng thực dụng [use dilution test] để tiến hành xác định. Tìm nồng độ nào của chất tiêu độc cỏ thể diệt được 95% vi sinh vật theo mức độ tin cậy. Còn có thể dùng phương pháp Thí nghiệm thực đụng [in-use test] trong các điều kiện thực tế cụ thể để xác định nồng độ bắt đầu có tác dụng của từng chất tiêu độc.

105

Chương 16

KHÁI NIỆM CHUNG VẺ TRAO ĐỎI CHẤT Ở VI SINH VẬT

16.1. NĂNG LƯỢNG 16.1.1. N ăng lượng và công Có thể định nghĩa một cách đơn giản nhất năng lượng là khả năng tạo nên công hoặc gây nên những biến đổi đặc biệt. Do đó, tất cả các quá trình lý, hoá là kết quả của việc sử dụng hoặc vận động của năng lượng, Tế bào sống thực hiện ba loại công chủ yếu, tất cả đều cần thiết cho các quá trình sống. Công hoá học, bao gồm việc tổng hợp các phân tử sinh học phức tạp từ các tiền chất đơn giản hơn. Năng lượng ở đây được dùng để nâng cao tính phức tạp phân từ của tế bào. Công vận chuyển, cần năng lượng để hấp thu các chất dinh duỡng, loại bỏ các chất thải và duy trì các cân bằng ion. Như ta biết, nhiều phân tử chất dinh dưỡng bên ngoài môi trường phải đi vào tế bào mặc dù nồng độ nội bào của các chất này thường cao hơn ngoại bào nghĩa là ngược với gradien điện hoá. Với các chất thải và các chất độc hại cần phải được loại bỏ khỏi tế bào, tình hình cũng diễn ra tương tự. Công cơ học, có lẽ là loại công quen thuộc nhất trong ba loại công. Năng lượng ở đây cần cho việc thay đổi vị trí vật lý của các cơ thể, các tế bào và các cấu trúc bên trong tế bào. Hầu hết năng lượng sinh học bát nguồn từ ánh sáng mặt trời khả kiến chiếu lên bề mặí trái đât. Quang năng được hấp thu bởi các sinh vật quang dường trong quá trình quang hợp nhờ chât điệp lục và các săc tô khác sau đó chuyển ỉhành hoá năng. Trái với sinh vật quang dưỡng, nhiêu vi khuân hoá tự dưỡng vô cơ [chemolithoautotrophs] lại thu được năng ỉượng nhờ oxy hoả các chât vô cơ. Hoá năng từ quang hợp và hoá dưỡng vô cơ sau đó có thể được các sinh vật quang tự dưỡng vô cơ và hoá tự dưỡng vô cơ sử dụng để chuyển CO 2 thành các phân tử sinh học như glucoz [Hình 16.1]. 106

Quang năng

Hóa năng

Hĩnh 16. ỉ: Dòng cacbon và năng lượng trong một hệ sinh thái. [Theo: Prescott vò cs, 2005]. Các phân tử phức tạp do các cơ thể tự dưỡng tổng hợp [cả thực vật và vi sinh vật] được dùng làm nguồn cacbon cho các sinh vật hoá dị đưỡng và các sinh vật tiêu thụ khác vốn sử dụng các phân tử hữu cơ phức tạp làm nguồn vật chất và năng lượng để xây dựng nên các cấu trúc tế bào của riêng mình [trên thực tế các sinh vật tự dường cũng sừ đụng các phân tử hữu cơ phức tạp]. Các sinh vật hoá dị dưỡng thường sử dụng Ơ2 làm chất nhận electron khi oxy hoá glucoz và các phân từ hữu cơ khác thành CO2. Trong quá trình này được gọi là hô hấp hiếu khí - O2 đóng vai trò là chất nhận electron cuối cùng và bị khử’ thành nước. Quả trình trên giải phóng ra nhiều năng lượng. Do đó trong hệ sinh thái năng lượng được hấp thu bời các cơ thể quang tự dưỡng và hoá tự dưỡng vô cơ. Sau đỏ, một phần năng lượng này được chuyền cho các cơ thể hoá dị dưỡng khi chúng sử dụng các chất dinh dưỡng bắt nguồn từ bọn tự dưỡng [Hình 16.1]. CO 2 tạo thành ừong hô hấp hiếu khí có thể lại được lắp vào các phân tử hữu cơ phức tạp trong quang hợp và hoá tự dường vô cơ. Rõ ràng, dòng cacbon và năng lượng trong hệ sinh thái có liên quan mật thiết với nhau. Các tế bào phải vận chuyển năng lượng một cách có hiệu quả từ bộ máy sản xuất năng lượng tới các hệ thống thực hiện công. Nghĩa là, chúng cần có một đồng tiền chung về năng lượng để tiêu dùng, đó là adenosin 5’- triphotphat tức ATP [hình ỉ 6.2]. Khi ATP phân giải thành adenosin diphotphat [ADP] và ortophotphat [Pi] năng lượng giải phóng ra sẽ được dùng để thực hiện công hữu ích. Sau đỏ, năng lượng từ quang

107

hợp, hô hẩp hiếu khí, hô hấp kỵ khí và lên men lại được dùng để tái tổng hợp ATP từ ADP và Pi trong chu trình năng lượng của tế bào {Hình 16.3].

— p - o

■ p

I 0"

• p .

I 0' OH

Adenosine

Adenosine diphosphate [ADP]

Adênosine triphosphate [ATP]

[b]

Hình ỉ 6.2: Adenosin triphoiphaí và adenosin diphotphat. [Theo Prescott, Harley và Klein, 2005]. ADP + Pi Hô hấp hiếu khí Hô hấp kị khỉ Lẽn men Quang hợp

Công hóa học Công vận chuyển Công cơ học

ATP Hình ỉ 6.3: Chu trình nãng ỉượng cùa tế bào. 108

ATP được tạo thành từ năng lượng cung cẩp bởi hô hấp hiếu khí, hô hấp kị khí, lên men và quang hợp. Sự phân giải của ATP thành ADP và Photphat [Pj] giúp cho việc sản ra công hóa học, công vận chuyển và cổng cơ học. 16.1.2. C ác định luật về nhiệt động học Đe hiểu được năng lượng tạo thành ra sao và ATP hoạt động như thế nào với vai trò là đồng tiền năng lượng ta cần nẳm được một số nguyên lý cơ bản của nhiệt động học. Nhiệt động học phân tích những thay đổi về năng lượng trong một tổ họp vật thể [ví dụ: một tế bào hay một cây] được gọi là một hệ thống. Mọi vật thể khác trong tự nhiên được gọi là môi trường xung quanh. Nhiệt động học tập trung vào sự sai khác năng lượng giữa trạng thái ban đầu và trạng thái cuối cùng của một hệ thống mà không quan tâm đến tốc độ của quá trình. Chẳng hạn, nếu một xoong nước được đun đến sôi thì, về nhiệt động học, chỉ điều kiện nước lúc ban đầu và khi sôi là quan trọng, còn việc nước được đun nhanh chậm ra sao và được đun trên loại bếp lò nào thì không cần chú ý. Trong nhiệt động học không thể không đề cập đến hai định luật quan trọng sau đây. Theo định luật thứ nhất, năng lượng không thể được tạo ra hoặc mất đi. Tổng năng lượng trong tự nhiên là hằng số mặc đù có thể được phân bố lại. Chẳng hạn, trong các phản ứng hoá học, thường diễn ra sự trao đổi năng lượng [Ví dụ, nhiệt được thoát ra ở các phản ứng ngoại nhiệt và được hấp thu ừong các phản ứng nội nhiệt] nhưng những sự trao đổi nhiệt này không trái với định luật trên. Để xác định lượng nhiệt được sử đụng trong hoặc thoát ra từ một phản ứng nào đó người ta đùng hai loại đơn vị năng lượng: một calo [cal] là lượng nhiệt năng cần để tăng nhiệt độ của một gam nước từ 14,5 đến 15,5°c. Lượng nhiệt cũng có thể được biểu hiện, bằng jun [joule, J] là đơn vị của công. 1 cal của nhiệt tương đương với 4,1840 J của công. 1000 cal hay 1 kilocalo [kcaJ] là lượng nhiệt đủ đun sôi khoảng l,9ml nước. 1 kilojun [kj] là lượng nhiệt đủ đun sôi khoảng 0,44 ml nước hoặc giúp cho một người nặng 70 kg leo lên được 35 bậc. Jun thường được các nhà hoả học và vật lý học sử dụng, còn các nhà sinh học lại quen sử dụng calo khi nói về năng lượng. Vì vậy, calo cũng được sử dụng ở đây khi những sự thay đổi năng lượng được đề cập. Mặc đù năng lượng được bảo tồn trong tự nhiên nhưng định luật thứ nhất của nhiệt động học không giải thích được nhiều quá trình vật lý và hoá học. Hãy lấy một ví dụ đơn giản để làm sáng tỏ điều nói ưên. Giả dụ, ta nối một xylanh đầy khí với một xylanh rỗng khí bàng một ống chửa 1 van [hình 16.4]. Nếu ta mờ van khỉ sẽ từ xylanh đầy tràn sang xylanh rồng cho đến khi khí áp cân bằng ở 2 xylanh. Năng lượng không chỉ được phân bố lại, nhưng cũng được bảo tồn. Sự bành trướng của khí được giải thích bằng định luật thứ hai của nhiệt động học vả một trạng thái vật chất được gọi là entropi. Có thể xem entropi là đại lượng đo tính hồn độn 109

hoặc mất trật tự của một hệ thốnp. Tính hỗn độn của một hệ thông càng lớn thì entropi của hệ thống củng càng lớn. Định luật thứ hai nói rằng các quá trình vật lý và hoá học dien ra theo cách sao cho tính hỗn độn hoặc mất trật tự của cả hệ thông và môi trường xung quanh tăng tới cực đại có thể. Khí bao giờ cũng sẽ bành trướng sang xylanh trông.

Final state [equilibrium]

Hình 16.4: Sự bành trưởng cùa khi từxyỉanh chứa đầy khỉ sang xylanh rỗng khí. [Theo Prescott, Harley và Klein, 2005]. 16.1.3. Năng lượng tự do và các phản ứng Các định luật thử nhất và thứ hai có thể kết hợp trong một phương trình chung liên kết nhừng thay đổi trong năng lượng có thể diễn ra trong các phản ứng hoá học và các quá trinh khác: AG = AH - T.ồS AG là sụ thay đổi trong năng ỉượng tự do, AH là sự thay đổi trong entalpi [enthalpi]. T là nhiệt độ Kenvin [°c + 273] và AS là sự thay đổi trong entropi [entropy] diễn ra trong phản ứng. Sự thay đổi trong entalpi là sự thay đổi trong nhiệt lượng. Các phân ứng trong tế bào diễn ra ở điều kiện áp suất và thể tích không thay đổi. Do đó sự thay đổi trong entalpi sẽ tương tự như sự thay đổi trong năng lượng tổng cộng trong phản ứng. Sự thay đổi năng lượng tự do là nhiệt lượng trong một hệ thống có khả năng sinh công ở nhiệt độ và áp suất không thay đổi. Vì vậy, sự thay đổi trong entropi là đại lượng đo tỉ lệ của sự thay đổi năng lượng tổng cộng mà hệ thống không thể sử dụng để thực hiện công. Sự thay đổi của năng lượng tự do và của entropi không phụ thuộc vào việc hệ thống diễn ra như thế nào từ lúc băt đâu tới khi kêt thúc, ơ nhiệt độ và áp suẩt không đổi một phản ứng sẽ xảy ra ngầu nhiên nếu năng lượng tự do của hệ thống giảm đi trong phản ứng, hay nói theo cách khác, nêu AG là âm. Từ phương trình trên suy ra là một phản ứng với sự thay đổi lớn, dương tính 110

trong entropi sẽ thường có xu hướng có giá trị AG âm và vì vậy xảy ra ngẫu nhiên. Một sự giảm trong entropi sẽ có xu hướng làm cho AG dương tính hơn và phản ứng ít thuận lợi. Các phản ứng ngoại năng A+B ^ C+D

Các phản ứng nội năng A + B■- ^ C + D K

[A][B]

[C ][D ]< 1 0 ' [A][B] AG° là đương

AG° lả âm

Hỉnh 16.5: AG° và cân bằng. Quan hệ của AG° với sự cân bằng cùa các phàn ứng.

[Theo Prescott, Harỉey và Klein, 2005]. Sự thay đổi ừong năng lượng tự đo có quan hệ xác định, cụ thể đối với hướng của các phản ứng hoá học. Ta hãy xét phản ứng đơn giản sau đây: A+B

C+ D

Nếu được hỗn hợp các phân tử A và B sẽ kết hợp với nhau tạo thành các sản phẩm c và D. Cuối cùng c và D sẽ ừờ nên đậm đặc đủ để kết hợp với nhau và tạo thành A và B với cùng tốc độ như khi chúng được tạo thành từ A và B. Phản ứng bây giờ ở trạng thái cân bằng: tốc độ theo hai hướng là như nhau và không có sự thay đổi rõ rệt nào diễn ra trong nồng độ của các chất phản ứng và các sản phẩm. Tình hình trên được mô tả là hằng số cân bằng [Keq] liên kết nồng độ cân bằng của các sản phẩm và cơ chất với nhau: K “*

[A][B]

Nấu hằng số cân bằng lớn hom 1 các sản phẩm sẽ có nồng độ lớn hơn các chất phản ứng và phản ứng có xu hướng điễn ra đến cùng [hình ỉ 6.5]. Hằng số cân bàng của một phản ứng Hên quan trực tiếp với sự thay đổi trong năng lượng tự do của phản ứng. Khi được xác định ở các điều kiện tiêu chuẩn quy định chặt chẽ về nồng độ, áp suất, pH và nhiệt độ thi sự thay đổi năng lượng tự do cho một quá trình được gọi là sự thay đổi năng lượng tự do tiêu chuẩn [AG°]. Nếu giữ ở pH 7,0 [gần với pH cùa tể bào sống] sự thay đổi năng lượng tự do tiêu chuẩn sẽ được chỉ bởi ký hiệu AG° . Sự thay đồi trong năng lượng tự do tiêu chuẩn có thể được xem là lượng năng lượng cực đại mà hệ thống có thể thực hiện công hữu ích ờ các điều kiện tiêu chuẩn. Việc sử dụng các giá trị AG° cho phép ta so sánh các phản ứng mà không cần quan tâm tới những thay đổi trong AG, do những sai khác trong các điều kiện môi trường. Quan hệ giữa AG° và Keq được thể hiện qua quá trình sau: AG° = -2,3037?71gẲTeq. Ill

R là hàng số khí [1,9872 cal/mol hoặc 8,3145 J/mol] và T là nhiệt độ tuyệt đối. Từ phương trình trên rút ra khi AG° âm hằng số cân bằng sẽ lớn hơn 1, phản ứng sẽ diên ra đến cùng và được gọi là phản ứng thoát nhiệt [hình 16.5]. Trong một phản ứng thu nhiệt AG° là dưcmg và hàng số cân bàng nhò han 1. Điều đó có nghĩa là phàn ứng không thuận lợi và ít sản phẩm được tạo thành ở các điêu kiện tiêu chuân. Cân nhớ răng giá trị AG° chi cho ta biết phản ứng nằm ở đâu khi cân bàng chứ không nói lên phản ứng đạt được cân bàng nhanh chậm ra sao. 16.1.4. Vai trò của ATP trong trao đổi chất Nhiều phản ứng trong tế bào là thu nhiệt, khỏ diễn ra hoàn toàn nếu không có sự giúp đỡ từ bên ngoài. Một trong các vai trò cùa ATP là hướng các phản ứng nói trên xảy ra được triệt để hơn. ATP là một phân tử cao năng nghĩa là Ĩ1Ó có thể bị thuỷ phân hầu như hoàn toàn thành ADP và Pi với một AG° khoảng -7,3kcal/mol. ATP + H20

ADP + Pi

Với ATP thuật ngữ phân tử cao nàng không có nghĩa là một lượng lớn nàng lượng được dự trữ bên trong một liên kết đặc biệt của ATP mà chì đơn giản chì ra rằng việc loại bỏ nhánh Photphat tận cùng diễn ra với sự thay đổi năng lượng tự do chuẩn là âm, lớn hoặc phản ứng là thoát nhiệt mạnh. Nói cách khác ATP có thế mạnh chuyền nhóm Photphat và dễ đàng chuyền Photphat cho nước. Thế chuyền nhóm Photphat được quy định là âm của AG° đối với việc loại bỏ thuỷ phân Photphat. Một phân từ có thế chuyền nhóm cao hơn sẽ chuyển Photphat cho phân tử có thê thấp hơn, Như vậy ATP thích hợp khá lý tưởng đối với vai trò là đồng tiền năng lượng. ATP được tạo thành trong các quá trình hấp thu và sản sinh năng lượng như quang hợp, lên men và hô hấp hiếu khí. Đứng về kinh tế của tể bào sự phân giải ATP thải nhiệt liên kết với các phản ứng thu nhiệt khác nhau giúp cho các phản ứng này được hoàn thành [hình 16.6]. Nói cách khác ATP liên kết các phản ứng sinh năng lượng vói các phản ứng sử dụng năng lượng. 16.1.5. Các phản ứng oxy hoá - khử và các chất mang electron Sự thay đổi năng lượng tự do không chỉ liên quan tới cân bàng của các phản ứng hoá học thông thường mà còn tới cân bằng của các phản ứng oxy hoá-khử. Việc giài phóng năng ỉượng thường bao gồm các phản ứng oxy hoá-khử là các phản ứng trong đó các electron được chuyển từ chất cho [hoặc chất khử] tới chất nhận elecừon [hoặc chất oxy hoá]. Theo quy ước một phản ứng như vậy sẽ được viết với chất cho nẳm ở phía bên phải của chất nhận cùng với số [n] electron [e'] được chuyển: Cặp chẩt nhận và chất cho được gọi là cặp redox [bảng 16.1]. Khi một chất nhận nhạn các electron nó sẽ trở thanh chât cho của cặp. Hăng số cân bằng đối với phản ứng được gọi là thế khử chuẩn [Eo] và là đại lượng đo xu hướng mất electron của chất khử. Tiêu chuẩn tham khảo dùng cho các thế khử là hệ thống hydro với E ’ [thế khử ở pH 7 0] là -0,42V hoặc -420mV. 112

2H+ + 2e __ ^

Trong phản ứng này mỗi nguyên tử hydro cung cấp một proton [H+] và một electron [e‘]. Chất nhận + ne" — Chất cho Phản ứng nội năng đơn độc A + B ~--- - c + D

Phản ứng nội năng liên kết với sự phân giải ATP ATP

A + B -

ADP + p

s c +D

Hình 16.6. ATP như một tác nhân liền kết. Việc sử dụng ATP để tạo thành các phản ứng nội năng ỉà thuận lợi hơn. ATP được tạo thành bởi các phản ứng ngoại năng, sau đó được dùng để hướng dan các phản ứng nội năng. [Theo Prescott, Harley và Klein, 2005]. Bảng 16.1: Các cặp oxy hóa - k h ử chọn lọc quan trọng về sinh học [Theo: Prescott và cs, 2005] Cặp ôxi hóa khử 2H++ 2e'- > H2 Ferredoxin[Fe5 ] + e- — > Ferredoxin [Fe2*] NAD[P]+ + H++ 2e' -> NADP[H] s + 2H++ 2e - > H2S Acetaldehit + 2H+ + 2e" - > etanol ■> Laetal Pyruvat + 2H + 2e -> FADH, FAD + 2Hf + 2ê Oxaloaxetat2' + 2H++ 2ẽ - > maiat Fumarat2’ + 2H++ 2e' - > xuccinat2' Cytocrom b [Fe3+] + e' -> Cytocrom b [Fe2‘] Ubiquinone + 2H + 2e -> Ubiquinone H2 Cytocrom c [Fe ] + e ■■- > Cytociom c [Fe ] N 02' + HiO N 03"+ 2H+ + 2e' -N 02 + 8H+ + 6e' ■> NH4++ 2H20 Fe ++ e ^ Fe2 0 2+4Ht + 4e‘ --- > 2HịO a/

E’o [Von]a -0,42 -0,42 -0,32 - 0,274 -0,197 -0,185 0,18b -0,166 0,031 0,075 0,10 0,254 0,421 0,44 0,771 0,815 -

là thể khứ chuẩn ở pH 7,0. 113

b/ Giá trị đối với FAD/FADH2 ứng dụng cho cofactor [ự do vì nó có íhể thay đối đáng kể khi liên kết với I apoenzym. cỉ Giả trị đối với Fe tự do không phải Fe gắn với protein [vỉ dụ các Cytocrom]. Thế khử có ý nghĩa cụ thể. Các cặp redox với thế khử âm hem sẽ chuyền electron cho các cặp với thế khử dương hơn và ái lực lớn hơn đối với các elecừon. Do đó các electron sẽ có xu hướng di chuyển từ các chất khừ ở chóp của bảng 16.1 đến các chất oxy hoá ở đáy vì chúng cỏ thế dương hơn. Bằng mắt thường, điều này có thể được thể hiện ở dạng cùa một tháp elecừon ừong đó các thế khử âm nhất là ở chóp [hình 16.7]. Các electron đi chuyển từ các chất cho tới các chất nhận xuôi theo gradien điện thế hoặc rơi xuống tháp đến các điện thế đương hơn. Ta hãy xem trường hợp của chất mang electron NAD+ [nicotinamit adenin - đinucleotit]. Cặp NAD+/NADH có E rất âm, và vì vậy có thể cho electron tới nhiều chất nhận kể cả Ơ2-

Chất cho electron tốt han

fó [Volts] -0.5 -» 2HVHS[-0.42]

_0 4 _

NAD7MADH [-0.32] FAD/FADHj [-0.18]

ữJÌ -

0.2

2e-

- 0.1 -

Fumarate/succinate [0.031]

CoO/CoQHj [0.10]

+0.1 -

Cyt c [Fe3>ycyt c [Fe2*] [0.2543

+0.2-

NADH

— ► HjO + NAD*

+03N037N02~[p.421]

Fe3+/Ffl*+ FD.7711 VjO /H jO 0.815]

Chất nhận electron tốt hơn

Hình / 6.7. Sự di chuyển của electron và các thể khử. 114

v,0 2 2 1.14V]

Tháp electron thẳng đứng có các thế khử âm nhất ở đinh. Các electron chuyển dịch ngẫu nhiên từ các chất cho cao hơn trên tháp [các thế hiệu âm hơn] tới các chất nhận thấp hơn trên tháp [các thế hiệu dương hơn]. Nghĩa là, chất cho trên tháp bao giờ cũng cao hơn chất nhận. Chẳng hạn NADH sẽ chuyền các electron tới oxy và tạo thành nước trong quá trình. Một số chất cho và chất nhận điển hình được ghi ở bên trái và thế oxy hóa khử của chúng được cho trong ngoặc đơn. [Theo Prescott, Harley và Klein, 2005]. NAD+ + 2H+ + 2e' -O

NADH + H+

+ 2H+ + 2e"

H20

E 0 = -0,32V

E'ữ = +0,82V

Vì NAD+/NADH âm hơn —O 2/H 2O các electron sẽ di chưyển từ NADH [chất khử] tới O2 [chất oxy hoá] như ở hình 16,7. NADH + H+ + ì o 2 -> H20 + NAD+ 2 Khi các electron di chuyển từ một chất khử tới một chất nhận với một thế oxy hoá khử dương hơn năng lượng tự do sẽ được giâí phóng. AG° của phản ứng liên quan trực tiếp tới mức độ sai khác giữa thế khử của hai cặp [AE o]. AE o càng lớn thì năng lượng tự do thoát ra cũng càng lớn như chỉ ra bởi phương trình sau: AG 0= -nFAE 0. Ở đây n là sổ electron được chuyển và F là hằng sổ Faraday [23,062 cal/mol-von hoặc 96,494 J/mol-von]. Với mỗi thay đổi 0,1V trong AE^ sẽ có sự thay đổi 4,6 kcal tương ứng trong A G 0 và K«q trong các phản ừng hoá học khác nghĩa là hàng số cân bằng càng lớn thì AG^ cũng càng lớn. Sự khác nhau trong thế khử giữa NAD+/NADH và —O 2/H2O là 1,14V, một giả trị A E 0lớn. Trong hô hấp hiểu khí khí các elecừon di chuyển 2 từ NADH tới O 2 một lượng lớn năng lượng tự do được dùng để tổng hop ATP [hình ỉ 6,8] \

NADH + H++ - ơ 2 2

NAD+ + H20

AE' = 52,6 kcal.moĩ1 0

Khi các electron di chuyển từ các thế khử âm đến cảc thế khử dương năng lượng sẽ được giải phóng; trái lại, khi các electron di chuyển từ các điện thế dương hơn đến các điện thế âm hơn năng lượng sẽ cần để đẩy các electron theo hướng ngược lại như diễn ra trong quang hợp [hình 16.8], ờ đây quang năng được thu nhận và được dùng để đẩy các electron từ nước tới chất mang electron nicotinamit dinucleotit Photphat [NADP+]. Như hình 16.7 đã chỉ đẫn các sinh vật quang hợp thu nhận và sử dụng quang năng để vận chuyển các electron từ nước [và các chất cho electron khác như H 2S] đến các chất nhận elecưon như NADP+ có các thế khử âm hơn. Sau đó các elecưon này cỏ thể di chuyển ưở lại tới các chất nhận dương hơn và cung cấp năng lượng để tạo thành ATP trong quang 115

hợp. Các cơ thể quang tự đưỡng sử dụng ATP và NADPH để tổng họp các phân tử phức tạp từ C 0 2. Các sinh vật hóa dị dưỡng cũng sử dụng năng lượng giải phóng ra trong sự vận chuyển cùa các electron nhờ sự oxy hoá các chất dinh dưỡng phức tạp trong hô hấp để tạo thành NADH. Sau đó NADH chuyền các electron cho O2 và năng lượng thoát ra trong sự vận chuyển electron được giữ lại ở dạng ATP. Năng lượng từ ánh sáng mặt trời được sử dụng bời tất cả các sinh vật chính vì mổi quan hệ này giữa đòng electron và năng lượng.

E 0 âm hơn NADH

NADP*

Năng lượng

Eodưvng I hơn

^ ■

ATP

anh sảng

Hình ỉ 6.8: Dòng năng luợng trong trao đổi chất. hấpđòng hiếu electron khí Quang oxytrao đổi chất. Những ví dụ của mối quanị hệHÔ giữa và năng hợp luợngthải trong Oxy và NADP+ được dùng I/Tlàm và nước. [Theo o . nchẩt i ____nhận » I electron J .. _ lần , lượt từl íNADH . Prescott, Harley và Klein, 2005].

H 0 I ìí Cơ chất Ftedu' ead ^»ửrI*

aubatran

híAD'

Oxidized

I Ft NAŨH

[a] Cấu trúc của NAD và NADP. NADP khác với NẢD ờ chỗ có thêm ì Photphat trên một trong các đitừng riboza; [b] NAD có thể nhận các electron và ỉ hydro tie cơ chất khừ [Stìý. Các electron và hydro này được mang trên vòng nicotinamỉt. [Theo Prescott, Harley và Klein, 2005].

Sự vận chuyển electron có ỷ nghĩa quan trọng trong hô hấp hiếu khí, hô hấp kỵ khí, hoá dường vô cơ và quang hạp. Sự vận chuyển electron trong tế bào cần sự tham gia của các chất mang như NAD+ và NADP+, cả hai chất này đều có thể vận chuyển electron giữa các vị trí khác nhau. Vòng nicotinamit của NAD+ và NADP+ [hình Ỉ6.9] tiếp nhận hai electron này và một proton từ một chất cho, còn proton thứ hai đuợc tách ra.

Vòng izoalloxazine

Isoalloxazine ring

Ribose H— c — QH

H~c —OH I

0 II

CH, —0 — p — o ~ p — 0 —CH.^o~v

I 0'

ỹ OH

Ribose

Hình 16.10: cấu trúc và chức năng cùa FAD. Vitamin riboflavin bao gồm vòng izoalloxazin và đường riboza gắn vào. FMN là riboflavin Photphat. Phần cùa vòng trirc tiếp tham gia vào các phàn ứng oxy hóa khừ là phần có màu. [Theo Prescott, Harỉey và Klein, 2005].

Một số chất mang electron khác có vai ưò trong trao đổi chat cùa vi sinh vật cũng được nêu ưong bảng 16.1; các chất này mang electron theo các cách khác nhau. Flavin-

1i 7

adenin đinucleotit [NAD] và flavin-mononucleotit [FMN] mang 2 elecừon và 2 proton trên hệ thống vòng phức tạp {hình 16.10]. Các protein chứa FAD và FMN thường được gọi là flavoprotein. Coenzym Q [CoQ] hoặc Ubiquinone là một quinon vận chuyển các elecừon và các H+ trong nhiều chuỗi vận chuyển electron hô hấp [hình Ì6.ỈĨ]. Cảc cytocrom và một số chất mang khác sử dụng các nguyên tử sắt để vận chuyển electron qua các phản ứng oxy hoá - khử thuận nghịch: Fe3+ [sắt ferric]

—

Fe2+ [sắt ferrous]

Trong cytocrom các nguyên tử sẳt này là một phần của nhóm hem [hình ỉ 6.12] hoặc của các vòng sắt - porphyrin tương tự khác. oQ

ÒQ / V

Hình Ỉ6.ĨỈ. Cent trúc và chức năng của Coenzym Q hoặc Ubiquinone. Chiều dài của chuôi bên thay đổi tùy theo cơ thể với n ~ 6 đến n = 10. [Theo Prescott và cs, 2005]. Các chuỗi vận chuyển electron hô hấp thường chứa cytocrom bao gồm một protein và một vòng sất - porphyrin. Một số protein mang electron chứa sát thiếu nhỏm hem và được gọi ỉà các protein sắt không - hem. Ferredoxin [Fd] là một protein sắt không-hem hoạt động trong việc vận chuyển electron quang họp và một số quá trình vận chuyển electron khác. Mặc dù nguyên tử sắt ở chúng không gắn với nhóm hem nhưng chúng vẫn thực hiện được các phản ứng oxy hoá. cần chú ý răng trong số các phân tử tham gia vào

118

chuỗi vận chuyển electron nói trên, ở mỗi thời điểm, một số mang hai electron [như NAD, FAD và CoQ], số khác [như các cytocrom và các protein sẳt không-hem] chỉ mang một electron. Sự khác nhau trong số lượng electron được vận chuyển có ý nghĩa rất quan trọng trong hoạt động của các chuỗi vận chuyển elecừon.

CH, p CH

^ CH,

H—C - O H

/ Á CHj

CH. I CH [CHj]3

[CHJj

CH3

Á I

o o

\>c — CH — CHj

— c ỉ N

ỉ

CH,

\ - H

CH. CH. 1 COOH

CHj

c A I

C— N

H C - /

CH, I CH

CH, I COOH

Hình 16.12; cẩu trúc cùa Hem. Hem bao gồm 1 vòng porphyrin gán với 1 nguyên tử sắt. Đây là thành phần khôngprotein của nhiều Cytocrom. Nguyên tử sát luân phiên tiếp nhận và giải phóng 1 electron. [Theo Prescott, Harley và Klein, 2005]. 16.2. ENZYM Như đã nói ở trên một phản ứng íhoát nhiệt là một phản ứng có AG° âm và hằng sổ cân bằng lớn hơn 1 và có thể diễn ra triệt để nghĩa là về phía bên phải của phương trinh. Tuy nhiên, người ta thường có thể hỗn hợp các chất phản ứng của một phản ứng thoát nhiệt mà không thấy kết quả rõ ràng mặc dù cảc sản phẩm có thể được tạo thành. Chính enzym đóng vai trò trong các phản ứng này.

119

16.2.1. Cấu trúc và phân loại các enzym Enzym là các chất xúc tác có bản chất protein, cỏ tính đậc hiệu cao đối với phản ứng xúc tác và với các phân từ chịu xúc tác. Chât xúc tác là một chât làm tăng tôc độ của một phản ứng hoá học mà bản thân không bị thay đổi. Do đó enzym thúc đẩy các phàn ứng của tế bào. Các phân tử phản ứng được gọi là cơ chất và các chất tạo thành được gọi là sàn phẩm. Nhiều enzym là các protein thuần khiết, nhưng cũng không ít enzym gồm hai thành phàn: thành phần protein [gọi là apoenzym] và phần không - protein [gọi là cofactor]; cả hai cần cho hoạt tính xúc tác và enzym gồm cả hai thành phần trên được gọi là holoenzym. Cofactor được gọi là nhóm thêm [prosthetic group] riếu gẳn chặt vào apoenzym. Nhưng thường thì cofactor gắn lỏng lẻo với apoenzym, thậm chí có íhể phân li khỏi protein enzym sau khi các sản phẩm đã được tạo thành và mang một trong các sản phẩm này đến một enzym khác. Cofactor gắn lỏng lẻo nói ưên được gọi là coenzym. Chẳng hạn, NAD+ là một coenzym mang các elecừon bên trong tể bào. Nhiều vitamin mà con người cần đóng vai trò là các coenzym hoặc là tiền chất [precursor] của các coenzym. Niaxin được lắp vào NAD+ và riboflavin được lắp vào FAD. Các ỉon kim loại cũng có thể liên kểt với các apoenzym và tác dụng nhu các cofactor. Bảng 16.2. Phân loại enzytn [Theo Prescott, Harley và Klein, 2005] Loại enzym

Phản ứng do enzym xúc tác

Oxydoreductaz

Các phản ứng oxy hóa khử

Lactat dehitrogenaz: Pyruvat + NADH + H Lactat + NAD+

Transferaz

Các phàn ứng chuyển nhóm giữa các phân tử

Aspatat e Carbamoyltransferaz: Aspatat e + CarbamoylPhotphat Carbamoylaspatat e + Photphat

Hydrolaz

Thủy phân các phân tử.

Lyaz

Loại bò các nhóm để tạo thành các nối đôi hoặc bổ sung các nhóm vào nối đôi.

Fumarat hydrataz: L-malat Fumarat + H20

Ixomraz

Các phản ứng xúc tác đồng phân hóa.

Alanin raxemaz: L-Alanin ĨI* D-Alanin

Ligaz

Nối 2 phân tử nhờ năng luợng cùa ATP [hay cùa các nucleozit triphotphat khác]

Glutamin syntetaz: Glutamat + N H 3 + ATP ATP + Pi

Ví dụ phản ứng

Glucoz-6-Photphataz: Glucoz-6-Photphat + H2O -* Glucoz + Pi

Glutamin +

Mặc dù tê bào chứa một sô lượng lớn và rất đa dạng các enzym nhưng chúng có thể được xêp vào một trong 6 nhóm [bảng 16.2]. Tên của các enzym thường được đặt theo tên 120

cơ chất mà chúng tác dụng lên và loại phản ứng được xúc tác. Ví dụ, Lactat dehitrogertaz [LDH] loại bò hydro khỏi Lactat: Lactat + NAD+

Pyruvat + NADH + H+

Lactat dehitrogenaz cũng có thể được đặt tên đầy đủ và chi tiết hon là L-Lactat: NAD oxydoreductaz. Tên này mô tả các cơ chất và loại phản ứng chính xác hơn. 16.2.2. C ơ chế của các p hản ứng enzym Cần nhớ ràng các enzym tăng cường tốc độ phản ứng nhưng không làm thay đổi hằng số cân bằng. Nếu một phản ứng lả thu nhiệt enzym sẽ không chuyển dịch cân bằng và nhiều sản phẩm hơn sẽ được tạo thành. Các enzym chỉ nâng cao tốc độ mà ờ đỏ phản ứng diễn ra theo hướng cân bằng cuối cùng. Để hiểu được enzym xúc tác các phản ứng như thế nào ta hãy xem xét diễn biến của một phản ứng hoá học thải nhiệt bỉnh thường sau đây: A+B

C+D

Khi các phân tử A và B tiếp cận nhau để phản ửng chúng sẽ tạo thành một phức hợp ờ trạng thải quá độ cho cả cơ chất và sản phẩm [hình Ỉ6.Ỉ3] E,

■1 Hình ỉ 6. ỉ 3: Coenzym như các chất mang. Chức năng của 1 coenzym trong vai trò mang các chất đi khắp tế bào. Coenzym c cùng với enzym El tham gia chuyển hóa A thành sản phẩm B. Tròng quá trình phản ứng coenzym c nhận X từ cơ chất A và có thể chuyển X sang cơ chất p trong phản ứng 2. Kết quả là coenzym lại trờ về dạng ban đầu đề sẵn sàng tiếp nhận IX khác. Coenzym không chi tham gia vào 2 phàn ứng mà còn vận chuyển X đí khắp tể bào. [Theo Prescott, Harley và Klein, 2005]. Năng lượng hoạt hoả là cần nhàm mang các phân tử phản ứng tiểp xúc với nhau theo một cách chính xác để đạt được trạng thái quả độ [hay chuyển tiếp]. Phức hợp ở trạng thái 121

quá độ có thể phân ly để tạo thành các sản phẩm c và D. Sự khác nhau trong mức độ năng lượng tự do giữa các chất phản ứng và các sàn phẩm là AG° . Vì vậy, trong ví dụ nêu trên cân bàng sẽ nằm về phía các sản phẩm vì AG° là âm [nghĩa là các sản phẩm ờ mức năng lượng thấp hơn cơ chất]. Trong hỉnh 16.13 rõ ràng A và B không thể chuyển hoá thành c và D nếu chúng không được cung cấp một lượng năng lượng tương đương với năng lượng hoạt hoá. Enzym thúc đẩy các phàn ứng bằng cách hạ thấp năng lượng hoạt hoá. Do đỏ nhiều phân tử cơ chất hơn sẽ có năng lượng đẩy đủ để tiếp cận nhau và tạo thành sản phẩm. Mặc dù hàng số cân bàng [hoặc AGỸ ] không thay đổi nhưng cân bằng sẽ đạt được nhanh hơn khi có mặt enzym do năng lượng hoạt hoá giảm.

Hình 16.14: Enzym hạ thấp năng ỉuợng hoạt hóa. Trong tiến trình của 1 phản ứng hóa học nêu trên A và B được chuyển thành c và D. Phức hợp chuyển tiếp được biểu thị bởi AB* và năng luợng hoạt hỏa cần để đạt được trạng thái này bởi Ea. Đường đỏ biểu thị tiển trình của phản ứng trong sự có mặt của 1 enzym. Cần chú ỷ, năng luợng hoạt hóa trong phản ứng có enzym xúc tác thấp hcm rất nhiều. [Theo Prescott, Harley và Klein, 2005]. Sở dĩ enzym có khả năng hạ thấp năng lượng hoạt hoả của các phản ứng vì chủng mang các cơ chât lại gân nhau tại một điểm đặc biệt gọi là vị trí hoạt động hoặc vị trí xúc tác để tạo thành phức hợp enzym - cơ chất [hình 16.15 và 16.16]. Sự tương tác giữa cơ chất và enzym có thể diễn ra theo hai con đường: 1. Enzym có hình dạng cô định, khớp với hình dạng của cơ chất giúp cho cơ chất liên kết chính xác vả thuận lợi cho phản ứng diễn ra.

2. Enzym thay đổi hình dạng khi gắn với cơ chất tạo điều kiện cho vị trí xúc tác bao quanh và khớp chính xác với cơ chất. Cơ chể diễn ra theo con đường thứ nhẩt được gọi là mô hình “ổ khoả và chìa khoá” [lock - and - key model]. Theo con đường thử hai cơ chế được gọi lả mô hình “khớp cảm ứng” [induced fit]. Mô hình này được ứng dụng cho hexokinaz và nhiều enzym khác [hình 16.16]. C ơ chất

Vị trí hoạt động

]

Enzym

Phức hợp cơ chẩt-enzym Sản phẩm

Hình ỉ 6. Ị 5. Chức năng cùa enzym. Sự tạo thành phức hợp enzym-cơ chất và chuyến hóa phức hợp thành 1 sản phẩm. [Theo Prescott, Harley và Klein, 2005].

Hình 16.16. Một ví dụ về sự tạo [hành phức hợp enzym~cơ chất. a] Mô hình đầy đù cùa hexokinaz nấm men và cơ chầí Glucoz [màu tỉa]. Vị trí hoại động trong khe tạo thành bởi thùy nhỏ cùa ertzym [màu lục] và thùy lớn Ịmàu xám], [b] Khỉ GỈUC02 ỉiên kết đế tạo 123

thành phức hợp enzym-cơ chất hexokinaz thay đổi hình dạng và bao quanh cơ chất. [Theo Prescott, Harley và Klein, 2005].

Việc tạo thành pbủc hợp enzym - cơ chất có thể hạ thấp nãng lượng hoạt hoá theo một số cách. Chẳng hạn, bằng cách mang các cơ chất lại gần nhau tại vị trí xúc tác, trên thực tế, enzym đã làm tăng nồng độ của chúng và thúc đẩy phản ứng. Tuy nhiên, một enzym không chỉ đơn giản làm đậm đặc nồng độ các cơ chất của chúng mà còn liên kết các cơ chất sao cho các cơ chất này hướng chính xác với nhau để tạo thành phức họp ờ trạng thái quá độ. Một sự định hướng như vậy sẽ hạ thấp lượng năng lượng mà các cơ chất cần để đạt được trạng thái quá độ. Các hoạt tính này và các hoạt tính khác của vị trí xúc tác đã tăng cường phản ứng hàng trăm nghìn lần bất kể vi sinh vật sinh trưởng giữa 20 °c và khoảng 113°c. Những nhiệt độ nảy không đủ cao để giúp cho hầu hết các phản ứng hữu cơ trong sự vắng mặt của enzym, hơn nữa các tể bảo không thể sống sót ờ những nhiệt độ cao dùng bởi một nhà hoá học hữu cơ trong các quá trình tổng hợp hữu cơ thường ngày. Enzym giúp cho sự sống tồn tại bằng cách thúc đẩy các phàn ứng đặc biệt ở nhiệt độ thấp. 16.2.3. Tác động của môi trường lên hoạt tính enzym Hoạt tính enzym thay đổi rõ rệt với sự thay đổi của các yếu tố môi trường mà một trong các yếu tố quan trọng nhất là nồng độ cơ chất. Như ta đã biết, nồng độ các cơ chất bên ừong tế bào thường thấp. Ở nồng độ cơ chất rất thấp enzym chậm tạo thành sản phẩm do ít khi được tiếp xúc với phân từ cơ chất. Nếu có mặt nhiều phân tử cơ chất hơn enzym sẽ liên kết cơ chất thường xuyên hơn và tổc độ phản ứng [thường được thể hiện như tốc độ tạo thành sản phẩm] cũng lớn hom ở nồng độ cơ chất thấp hơn. Do đó tốc độ của một phản ứng do enzym xúc tác tăng lên theo nồng độ cơ chất {hình 16.17]. Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng cững không tăng nữa vì các phân tử enzym đã bão hoà cơ chất và đang chuyển hốá cơ chất thành sản phẩm với tốc độ cực đại [ vmnx]. Đường cong cùa nồng độ cơ chất bây giờ sẽ là dường hyperbon [hỉnh 16.17]. Đẻ biết được nồng độ cơ chất mà một enzym cần để hoạt động thích hợp người ta thường dùng hàng sổ Michaelis [Km]. Đây là nồng độ cơ chất enzym cần để thực hiện được một nủa tốc độ cực đại và được dùng như một đại luợng đo ái lực thực sự của một enzym đổi với cơ chất. Giá trị Km càng thấp có ý nghĩa là nồng độ cơ chất mà enzym xúc tác phản ứng cũng càng thấp.Hoạt tỉnh enzym cũng thay đồi theo sự thay đổi cỏa pH và nhiệt độ {hình ỉ 6. ỉ 8].

124

Hình ỉ 6. ỉ 7. Động học Mỉchaelis-Menten. Sự phụ thuộc của hoại tính enzym vào nồng độ cơ chẫt. Đường cong cơ chất ờ đây khớp với phương trình Michaeỉis-Menten cho trong hình; phtrơng trình này liên kết tốc độ phản ứng [Vj với nồng độ cơ chất [S] khi sừ dụng tốc độ cực đại và hằng số Michaeỉis [Km]. Km - nồng độ cơ chất enzym cần đế hoạt động ở nửa tốc độ cục đại. Vmax = tốc độ tạo thành sàn phẩm khi enzym được bão hòa cơ chất và hoạt động nhanh toi đa. [Theo Prescott, Harley và Klein, 2005]. Mỗi enzym hoạt độn^ mạnh nhất ờ một pH thích hợp nhất. Khi pH chệch xa khỏi giá trị tối thích hoạt tính của enzym sẽ giảm đi và enzym có thể bị hư hại. Với nhiệt độ enzym cũng có giá trị tối thích cho hoạt tính cực đại. Nếu nhiệt độ tăng quá cao so với giá trị tối thích cấu trúc của enzym sẽ bị huỷ hoại và enzym mất hoạt tính. Hiện tượng biến tính [đenaturation] này của enzym có thể là hậu quả của các giá trị quá độ [tột cùng] của pH và nhiệt độ hoặc các yếu tố khác. Các giá trị tối thích cùa pH và nhiệt độ của các enzym vi sinh vật thường phản ánh pH và nhiệt độ nơi sống của chúng. Dó đó, ta dễ hiểu, các vi khuẩn sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ cao thường có các enzym với nhiệt độ tối thích cao và độ bền nhiệt độ lớn.

125

30 50 Nhiệt độ [°C]:]

Hỉnh 16.18: pH, nhiệt độ vò hoạt tính enzym. Sự thay đổi hoạt tỉnh enzym cùng với những thay đổi trong pH và nhiệt độ. Phạm vi pH và nhiệt độ ờ đây chi là tượng trưng. Các enzym khác nhau về vị trí của điềm tối thích và hình dạng của các đuờng cong pHvà nhiệt độ. [Theo Prescott, Harỉey và Klein, 2005]. 16.2.4. Sự kìm hãm enzym Nhiều hoá chất là độc đổi vi sinh vật và những chất độc mạnh nhất chính là những chất kìm hăm enzym. Một chất kìm hăm cạnh tranh trực tiếp cạnh tranh với cơ chất ở vị trí xúc tác của một enzym và ngăn cản enzym tạo thành sản phẩm. Chẳng hạn, xuccinat dehitrogenaz là enzym xúc tác sự oxy hoá xuccinat thành fumarat trong chu trinh Krebs. Axit malonic có cẩu trúc tương tự xuccinat đo đó là chất kìm hãm cạnh tranh của enzym nói trên. Sau khi liên kết vào enzym malonat không bị oxy hoá và việc tạo thành fumarat không diễn ra. Các chất kìm hãm cạnh ừanh thường chỉ vói các cơ chất bình thường nhưng không thể bị chuyển hoá thành các sản phẩm. CQOH I

CHj I

ỌOOH ĩ CH. I

H' COOH Succinic acid

COOH Melonic acid

Hình ỉ ó. Ị 9: Kìm hãm cạnh tranh của xuccinat-dehitrogenaz. Axit malomc cỏ cau trúc tương tự ax.it succinic do đó là chất kìtn hãm cạnh tranh cùa enzytn nổi trên. [Theo Prescott, Harley và Klein, 2005]. Các chât kìm hãm cạnh tranh được sừ dụng để điều trị nhiều bệnh đo vi sinh vật. Chảng hạn các thuôc sulfa như sulfanilamit chi với /?-aminobenzoat là một phân từ đùng

trong việc tạo thành coenzym axit folic. Các thuốc cạnh tranh với /?-aminobenzoat đối với vị trí xúc tác của một enzym tham gia tổng hợp axit folic do đó ngăn cản sự tạo thành axit folic và kỉm hãm sinh trưởng của vi khuẩn. Cơ thể người không chịu tác dụng của thuốc đo không có khả năng tổng hợp axit folic và phải thu nhận axit này từ thức ăn. 16.3. TÍNH CHÁT VÀ Ý NGHĨA CỦA VIỆC ĐIÈƯ CHỈNH TRAO ĐỎI CHÁT Bộ máy điều chỉnh có vai trỏ cực kỳ phức tạp và khó khăn. Các con đường cần phải điều chình và phối hợp có hiệu quả sao cho tất cà các thành phần cùa tế bào đều có mật với số lượng thích hợp, chính xác. Hơn nữa tế bào vi sinh vật phải có khà năng đáp ứng rất kịp thời với những thay đổi của môi trường bằng cách sử dụng các chất dinh dưỡng hiện có và bằng cách bật mở các con đường dị hoá mới khi có mặt các chất dinh dưõng khác. Vì tất cả các thành phần hoá học của một tể bào thường không tồn tại ưong môi trường, do đó vi sinh vật cũng phải tổng hợp chúng và phải thay đổì hoạt tính sinh tồng hợp đáp ứng với những thay đổi trong việc sử dụng chất dinh dưỡng. Thành phần hoá học của môi trường bao quanh tế bào thường xuyên thay đổi, đo đó các quá trinh điều chỉnh này cũng phải năng động và phải liên tục đáp ứng với các điều kiện thay đồi. Việc điều chỉnh là cần thiết cho tế bào vi sính vật duy trì được năng lượng, vật chất và cân bằng trao đổi chất. Nếu một nguồn năng lượng đặc biệt không có mặt, các enzym cần cho việc sử dụng nguồn nãng ỉượng này là không cần thiết vả việc tổng hợp chúng tiếp tục sẽ là một sự tiêu phí c , N và năng lượng. Cũng tương tự như vậy, sẽ là rất vô ích đối với vi sinh vật náu chúng tồng hợp các enzym cần cho việc tạo thành một sản phẩm cuối cùng nào đó khi sản phẩm này đã có mặt với số lượng đầy đủ. Như vậy, cả dị hoá và đồng hoá đều được điều chỉnh theo cách sao cho hiệu quả của hoạt động đạt được tối đa. Cỏ thể thấy rõ xu hướng duy trì cân bằng và bảo tồn năng lượng của vật chất trong sự đáp ứng điều chỉnh ờ vi khuẩn E. coli... Khi sinh trưởng ừong một môi trường rất đơn giản chỉ chứa glucoz là nguồn c và nguồn năng lượng vi khuẩn sẽ tổng hợp các thành phần mà tế bào cần với số lượng cân bằng [chẳng hạn axit amin tryptophan]. Việc bổ sung một sản phẩm sinh tổng hợp cuối cùng vào môi trường sẽ đẫn đến kim hãm ngay lập tức con đường tồng hợp sản phẩm cuối cùng nói trên. Việc tổng hợp các enzym cùa con đường cũng sỗ bị ngừng hoặc chậm lại. Nếu chuyển E. coli sang môi trường chỉ chứa lactoz, vi khuẩn sẽ tổng hợp các enzym cần cho sự chuyển hoá đường này. Trái lại, khi sinh trưởng trong môi trường chửa cả glucoz và lactoz E. coỉi sẽ sử dụng glucoz đầu tiên vì đây là loại đường đơn giúp cho sinh trưởng của vi khuẩn diễn ra nhanh nhất chỉ sau khi glucoz đã cạn kiệt, lactoz mới được sử dụng. Dòng cacbon chuyển hoá qua con đường có thể được điều chỉnh theo ba cách chủ yếu:

127

1. Tập trung các chất trao đổi và các enzym trong nhừng phân khác nhau của tê bào, từ đó ảnh hưởng đến hoạt tính của con đường, 2. Các enzym quan trọng thường được kích thích hoặc bị kìm hâm trực tiếp nhằm thay đổi nhanh hoạt tính của con đường, 3. Số lượng các phân tử enzym cũng có thể được điều hoà. Các phân tử chất xúc tác cỏ mặt càng nhiều thì hoạt tính của con đường càng lớn. Ở vi khuẩn, việc điều chinh thường chịu tác dụng ở mức độ phiên âm. Việc điều hoà tổng họp mARN chậm hơn việc điều chinh trực tiếp hoạt tính enzym nhưng tiết kiệm được nhiều nàng lượng và nguyên liệu vì các enzym không được tổng hợp khi không cần thiết. Hai cơ chế 1 và 2 sẽ được trinh bày ở đây, đó là: khu trú trao đổi chất và điều hoà hoạt tính enzym. 16.4. KHU TRÚ TRAO ĐỎI CHÁT [Metabolic Channeling] Một trong các cơ chế khu trú trao đổi chất phổ biến nhất là sự chia khoang [compartmentation] nghĩa là sự phân bố biệt hoá các enzym và các chất trao đổi trong các cấu trúc tế bào tách biệt hoặc các bào quan có màng bao bọc. Chẳng hạn, sự oxy hoá axit béo gặp bên trong ty thể nhưng tổng hợp axit béo lại diễn ra trong tế bào chất. Chu chất ờ vi khuẩn cũng có thể được xem là một ví dụ của sự chia khoang. Sự chia khoang tạo điều kiện cho việc hoạt động và điều chỉnh đồng thời nhưng iách biệt của các con đường cỏ thể được phối hợp nhờ sự điều chỉnh việc vận chuyển các chất trao đổi và các coenzym giữa các khoang của tế bào. Giả dụ, có hai con đường tồn tại ừong các khoang tể bào khác nhau nhưng đều cần NAD+ cho hoạt động. Sự phân bố NAD+ giữa hai khoang sẽ quyết định hoạt tính tương đối của các con đường cạnh tranh này và con đường nào chiếm dư thừa NAD+ sẽ có lợi thế hom. Sự chia khoang cũng gặp bên trong các khoang như nền tế bào chất. Nên [matrix] là vật thể đông đặc, có cấu trúc gồm nhiều khoang nhô. Ở sinh vật nhân thật nền cũng được chia nhỏ bởi lưới nội chất [endoplasmic reticulum] và bộ khung tế bào [cytoskeleton]. Trong một môi trường như vậy các chất trao đổi và các coenzym không khuếch tán nhanh và các gradien chất trao đổi sẽ được thiểt lập gần các enzym hoặc cảc hệ thống enzym cục bộ. Điều này điễn ra vì các enzym ở một vị trí đặc biệt chuyển hoá các chất thành sản phẩm dẫn đến giảm nồng độ cùa một hoặc nhiều chất trao đổi này và tăng nồng độ của một hoặc nhiều chất trao đổi khác. Chẳng hạn, nồng độ sản phẩm sẽ cao ở gần enzym và thấp dàn theo khoảng cách tăng lên tính từ enzym.

Sự khu trú cỏ thể tạo ra những thay đổi rõ rệt trong nồng độ chất trao đổi và vì vậy ảnh hưởng trực tiêp đên hoạt tính enzym. Nồng độ cơ chất, nói chung, thường ờ vào 128

khoảng 10 "3 - 10'6M/1, thậm chí thấp hơn, nghĩa là có thể ở trong cùng phạm vi như nồng độ enzym và bằng hoặc nhỏ hơn hằng số Michaelis ịKm] của nhiều enzym. Dưới các điều kiện như vậy nồng độ cơ chất của một enzym có thể điều hoà hoạt tính của chất xúc tác vì nồng độ cơ chất là ở trong phần tăng lên của đường cong hyperbon cùa sự bão hoà cơ chất {hình ỉ 6.20].

Hình ỉ 6.20: Điểu hòa hoạt tính enzym bời nồng độ cơ chất. Trong hình là đtròng cong bão hòa enzytti'Cơ chai với hằng số Mỉchaeỉis [Km] và tốc độ tuưng đương với ‘Á tốc độ cực đợi [Vmax]- Tốc độ ban đầu cùa phàn ímg [v] được dimg đồ thị đối với tìồng độ cơ chất. Tốc độ cực đại ĩà tốc độ ỉởìì nhất đạt được với một sổ lượng enzym cố định dưới những

điều kiện xác định. Khi nồng độ cơ chai bằng hoặc nhỏ hơn Km hoạt tính enzym sẽ thay đôi hầu như tuyển tính với nồng độ cơ chất. Giả dụ, nong độ cơ chất tăng từ mức độ A tới mí[c độ B. Vì ììhĩmg nồng độ này đều ở trong phạm vi cùa Km nên hoạt tính enzym tăng íên rõ rệt. Sự giàm nong độ iừ B đến A sẽ hạ thẩp tốc độ lạo thành sàn phẩm, ịTheo Prescott, Harley và Klein, 2005].

Khi nồng độ cơ chất tăng, cơ chất sẽ được chuyển thành sản phẩm nhanh hơn; nồng độ cơ chất giảm đương nhiên dẫn đến hoạt tính enzym thấp hơn. Nếu 2 enzym ở hai con dường khác nhau cùng sử dụng một chất trao đổi chúng cỏ thể trực tiếp cạnh tranh chất này, con đường thấng trong cuộc cạnh tranh này, nghĩa là con đường với enzym có giá trị Km thấp nhất đổi với chất trao đổi, sẽ hoạt động gần như hoàn toàn thống trị. Do đỏ sự khu trú bên trong một khoang tế bào có thể điều chỉnh và phối hợp trao đổi chất thông qua những biển đổi trong nồng độ chất trao đổi và nồng độ coenzym.

I?9

16.5. ĐIÈU HÒA HOẠT TÍNH ENZYME

Hoạt động của nhiều con đường trao đổi chất có thể được điều hoà nhờ việc điều chỉnh hoạt tính của các enzyme điều chinh. Mục này mô tà các enzyme nói trên và đê cập vai trò của chúng trong việc điều chỉnh hoạt tính của con đường. 16.5.1. Đỉều chỉnh dị lập thể Các enzyme điều chỉnh thường là các enzyme dị lập thể [allosteric enzymes]. Hoạt tính của một enzyme dị lập thể bị thay đổi bởi một phân tử nhò gọi là effector [effector, chất tác động] hoặc modulator [modulator, chất điều biến]. Effector liên kết thuận nghịch nhờ lực không - cộng hóấ trị vào một vị trí điều chỉnh [regulatory site] tách biệt khỏi vị trí xúc tác [catalytic site] và gây ra sự thay đổi trong hình dạng hoặc hình thể của enzyme [Hỉnh ỉ 6.2ỉ]. Hoạt tính của vị trí xúc tác đo đó bị thay đổi. Một effector dương làm tăng hoạt tính enzyme, một effector âm, trái lại, làm giảm hoạt tính hoặc kìm hãm enzyme. Những thay đối như vậy trong hoạt tính thường bắt nguồn từ những biến đổi trong ái lực biểu kiến của enzyme đối với cơ chất, tuy nhiên những thay đổi trong tốc độ cực đại cũng có thể diễn ra.

Effector và modulator Cơ chất

cấu trúc và chức năng của I enzyme [ỊỊ lập thể. Trong hình bén effector hoặc modulator [chất điều biến] íriỉởc hết gắn vào ỉ vị trí điều hòa tách biệt và làm thítv đôi hình thê enzyme dan đến sự thay đôi hình dạng cùa vị trí hoạt động. Vị tri hoạt độ nơ giờ có thể liên kết cơ chẩt hiệu quả hơn. ơ đáy effector là dương linh vì nó kich thích sự ỉiê/1 két cơ chất và hoạt íinh xúc tác. [Theo Prescott, Harley vù Klein, 2005]. Các enzyme điều chỉnh thường là các enzyme dị lập thể [allosteric enzymes]. Hoạt tính cùa một enzyme đị lập thể bị thay đổi bởi một phân tử nhỏ gọi là effector [effector, chất tác động] hoặc modulator [modulator, chất điều biến]. Effector liên kết tiiuận nghịch nhờ lực không - cộng hoá trị vào một vị trí điều chỉnh [regulatory site] tách biệt khỏi vị trí xúc tác [catalytic site] và gây ra sự thay đổi trong hình dạng hoặc hình thể của enzyme [Hình 16.21]. Hoạt tinh của vị trí xúc tác do đó bị thay đổi. Một effector dương làm tăng hoạt tính enzyme, một effector âm, trái lại, làm giảm hoạt tính hoặc kìm hăm enzyme. Những thay đổi như vậy trong hoạt tính thường bắt nguồn tù những biến đổi trong ái íực biểu kiến cùa enzyme đổi với cơ chất, tuy nhiên nhũng thay đổi trong tốc độ cực đại cũng cỏ ihể diễn ra.

0 Cartar*oyl phosphite synthetase L-Gliitomne * HCO; ♦ 2ATP ■■

----►

I 0 -C

•0

II c

*0 - p ~ 0

H,N

COO'

cr Cartiaroyi pbc»ptia;e

Aspartate

t A1P

f i CTP ■* •*— Lndme ronaph3spha:e iL'f/P

Hình 16.22: Sự điều chỉnh ACTcise. Phản ứng Aspartate, cacbamoyhntnsferase và vai trò cĩtit enzyme này trong việc điêu chinh sinh tỏng hợp pyrimidine. Sủrì phủm cuối cùng CTP kìm hãm hoạt tinh cua ACTcise

ị-] còn ATP Ịại hoại hóa enzyme [+]. Cacbamoyl Phosphate synthetase cũng bị kìm hàm bới cúc sàn phẩm cuối cùng cùa con đường như UMP. [Theo Prescott, Harley và Klein, 2005]. Các đặc tính động học của enzyme không - điều chỉnh chứng minh rằng hằng sổ Michaelis [Km] là nồng độ cơ chất cần cho một enzyme hoạt động ở tốc độ bằng nửa tốc độ cực đại. Hằng số này chỉ ứng dụng cho các đường cong bão hoà cơ chất hyperbon mà không cho các đường cong xích-ma thường gặp với các enzyme dị lập thể [Hình 16.23]. Ị

Nồng độ cơ chất cần cho một nửa tốc độ cực đại với các enzyme dị lập thể có đường cong cơ chất xích-ma được gọi là giá trị [S]o,5 hoặc Ko.s. Một trong các enzyme điều chỉnh đị lập thề được nghiên cứu kỳ nhất đỏ là Aspartatecacbamoyltransferase [ACTase] ở E. coli. Enzyme xúc tác sự ngưng tụ của cacbamoylphosphate với aspartate tạo thành cacbamoylaspartate [Hình 16.22], ACTase xúc tác phản ứng quyết định tốc độ của con đường sinh tổng hợp pyrimidine ở E. coỉi. Đường cong cơ chất bão hoà là xích-ma khi nồng độ của một trong hai cơ chất

\i C ơ chất

Hình Ị 6.23: Động học cùa Aspartate cucbamoyltransferase ờ E. ColL

CTP lả Ị effecior âm làm tăng giả trị K0J, còn ATP ỉà ỉ effector dương, hụ thấp K0ỹ. vmia van là hằngsồ. [Theo Prescott, Harỉev và Klein 2005]. 132

Enzyme có trên một vị trí hoạt động và sự liên kết cùa một phân tử cơ chất vào một vị trí hoạt động sẽ kích thích sự liên kết của cơ chất vào các vị trí khác. Hơn nữa, cytidine triphosphate [CTP], một sản phẩm cuối cùng cùa sinh tổng hợp pyrimidine, kim hãm enzyme, trái lại ATP [purine] lại hoạt hoá enzyme. Cà hai effector thay đổi giá trị Koj của enzyme nhưng không thay đổi tốc độ cực đại của enzyme. GTP kìm hãm bằng cách nâng cao Ko.s hoặc chuyển dịch đường cong bão hoà cơ chất lên các giá trị cao hơn. Điều này cho phép enzyme hoạt động chậm hơn ờ một nồng độ cơ chất đặc biệt khi CTP có mặt. ATP hoạt hoá bằng cách chuyển đuờng cong tới các giá trị nồng độ cơ chất thấp hơn khiến cho enzyme hoạt động cực đại qua một phạm vi nồng độ cơ chất rộng lớn. Do đó, khi con đường hoạt động tới mức nồng độ CTP tăng quá cao hoạt tính ACTase sẽ giảm và tốc độ tạo thành sản phẩm cuối cùng bị chậm lại. Trái lại, khi nồng độ sản phẩm cuối cùng ATP tãng lên so với CTP, ATP sẽ kích thích tổng hợp CTP thông qua tác dụng lên ACTase. Aspartate cacbamoyltransferase ở E. coli cung cấp một ví dụ rõ rệt về các vị trí điều chinh và vị

trí xúc tác riêng rẽ trong các enzyme dị lập the. Enzyme là một protein lớn gồm

2 dưới đơn vị xúc tác vả 3 dưới đơn vị điều chinh [Hình 16.24a]. Các dưới đon vị xúc tác chi chứa các vị trí xúc tác và không chịu ảnh hưởng bởi CTP và ATP. Các dưới đơn vị điều chinh không xúc tác phản ứng nhưng có các vị trí điều chỉnh liên kết CTP và ATP. Khi liên kết vào enzyme hoàn toàn các effector này gây ra những thay đổi về hình thể trong các dưới-đcm vị điều chỉnh, sau đó trong các dưới đơn vị xúc tác và các vị trí xúc tác. Enzyme có thể thay đổi thuận nghịch giữa một dạng T ít hoạt động và một dạng R hoạt động hơn [Hình 16.24 b, c]. Do đó vị trí điều chỉnh ảnh hưởng đến vị trí xúc tác ờ khoảng cách khoảng 6,0 nm.

I«I Hình ì 6.24: cấu trúc và điều chình cùa Aspartate cacbamayhrctnsferase ơ E. coli. [Theo Prescott, Harley và Klein. 2005].

133

16.5.2. Cải biến cộng hoá trị các enzyme Các enzyme cũng có thể được kích thích hoặc bị kìm hãm thông qua sự cải biên cộng hoả trị thuận nghịch. Thông thường điều này diễn ra do việc thêm và loại bỏ một nhóm đặc biệt, nghía là một đạng của enzyme được hoạt động hơn một dạng khác. Chảng hạn, glicogen phosphorylase của mốc bánh mì Neurospora crassa được gọi là phosphorylase a khi ở dạng phosphoryl hoá và phosphorylase b khi ờ dạng bị loại bỏ Phosphate [Hình 16.25]. Phosphorylase b là bất hoạt vì chất hoạt hoá AMP mà nó cần thường không có mặt ở mức độ đủ cao. Dạng phosphoryl hoá của phosphorylase a hoạt động ngay khi không có mặt AMP. Glicogen phosphorylase được kích thích thông qua việc phosphoryl hóa phosphorylase b thành phosphorylase a. Việc gắn nhánh Phosphate làm thay đổi hình thể cùa enzyme chuyển nó thành dạng hoạt động. Phản ứng phosphoryl hoá và loại bỏ Phosphate được xúc tác bởi các enzyme riêng rẽ và các enzyme này cũng được điều chỉnh.

Phospharylase ò [inactive]

Phosphorylasea [active] [Glucose^. + p

IGtucose]., _______________ + Glucỡse-1-[p]

Hình Ị 6.25: Sự củi biến cộng hóa [rị thuận nghịch của gỉicogen phusphoryìase. Phosphoryhtse a là dựng hoạt động được tông hợp bời phosphỏryì hóa và bị bất hoạt khi Phosphate bị loợi bỏ do thuy phân đế tạo thành phosphoryỊase b bất hoạt. [Theo Prescott. Harley và Klein, 2005].

Các enzyme cũng có thể được điều chỉnh nhờ liên kết với các nhỏm khác Phosphate. Một trong các enzyme được nghiên cứu chi tiết nhất đó là Glutamine synthetase ờ E. coỉi. Đây là một enzyme lớn, phức tạp tồn tại ở hai dạng. Khi một nhánh acid adenylic liên kết với một trong 12 dưới-đơn vị cùa enzyme tạo thành một enzyme adenyl hoá, glutamine

synthetase hoạt động yếu. Việc loại bỏ các nhóm AMP tạo ra glutamine synthetase đã mất adenyl hoạt động hơn và glutamine được tổng hợp. Hệ thống glutamine synthetase khác hệ thống phosphorylase ở hai điểm: 1] AMP được đùng như tác nhân cải biến; 2] Dạng cải biến của Glutamine synthetase kém hoạt động. Glutamine synthetase cũng được điều chình dị lập thể. Việc sử đụng cải biến cộng hoả trị để điều chỉnh hoạt tính enzyme có một số ưu điểm. Các enzyme có thể chuyển hoá qua lại thường cũng là các enzyme dị lập thể. Vì mỗi dạng có thể đáp ứng khác nhau với các effector đị lập thể nên các hệ thống enzyme cải biến cộng hoá trị có khả năng đáp ứng với nhiều chất kích thích hon trong các con đường thay đổi và phức tạp. Cũng có thể được điều chỉnh là các enzyme xúc íác những cải biến cộng hoá trị, bổ sung vào hệ thống một mức độ điều chỉnh thứ hai. 16.5.3. Kìm hãm phản hồi hoặc kìm hãm bôi sản phẩm cuối cùng [Feedback inhibition] Như đã nói ở phần trên, tốc độ của nhiều con đường trao đổi chất được điều chinh thông qua sự điều khiển hoạt tính của các enzyme điều chỉnh. Mỗi con đường có ít nhất một enzyme dẫn-tốc độ [pacemaker] xúc tác phản ứng chậm nhất hoặc hạn chế tốc độ trong con đường. Vì các phản ứng khác diễn ra nhanh hơn phản ứng dẫn-tổc độ do đó những thay đổi trong hoạt tính của enzyme này trực tiếp ảnh hường đến tốc độ của con đường. Thông thường, bước thứ nhất trong một con đường là một phản ứng đẫn tốc độ xúc tác bởi một enzyme điều chỉnh. Sản phẩm cuối cùng của con đường thường kìm hãm enzyme điều chỉnh này. Quá trình nói trên được gọi là sự kìm hãm bời sản phẩm cuối cùng. Kiểu kìm hãm này bào đảm cho sự tạo thành cân bàng của sản phẩm cuối cùng của một con đường. Nếu tích luỹ với nồng độ quá cao sản phẩm cuối cùng sẽ kìm hâm enzyme điều chinh và làm giảm tốc độ tổng hợp của chính sản phẩm này. Khi nồng độ cùa sản phẩm cuối cùng giàm, hoạt tỉnh của con đường lạì lăng và nhiều sản phẩm hơn được tạo thành. Sự kìm hăm bởi sản phẩm cuối cùng, nhờ vậy, đâ tự động phối hợp việc cung cấp theo nhu cầu của sản phẩm này. Aspactate cacbamoyltransferase là một ví dụ điển hình của sự kìm hãm bởi sản phẩm một con đirờng sinh tổng hợp thường phân nhánh tạo thành trên một sán phẩm cuối cùng. Trong tinh hinh như vậy việc tổng hợp các sàn phẩm cuối cùng cùa con đường phải được phổi hợp một cách chính xác. Không thể để một sản phẩm cuối cùng này cỏ mặt dư thừa trong khi một sản phẩm cuối cùng khác lại thiếu. Sự phân nhánh các con

đường sinh tổng hợp thường tạo nên sự cân bằng giữa các sản phâm cuôi cùng qua việc sử dụng các enzyme điều chỉnh ở các điểm phân nhánh {Hình 16.26]. Khi có mặt ở nồng độ dư thừa một sản phẩm cuối cùng thường kìm hăm enzyme ờ điểm phân nhánh trên chuỗi dẫn đến tạo thành sản phẩm này, nhờ vậy mà điều chỉnh việc tổng họp của chính sản phẩm đó nhưng không ảnh hướng đến tồng hợp các sàn phẩm khác. Hình ỉ 6.26 cũng cho thấy cả 2 sản phẩm cũng kìm hãm enzyme mở đầu trong con đường. Sự dư thừa của một sàn phẩm làm chậm dòng c đi vào cả con đường trong khi kìm hãm enzyme thích hợp ở điểm phân nhánh. Vì sụ phân nhánh không hoạt động cần ít c do đó sự kìm hãm bởi sản phẩm cuối cùng của enzyme dẫn tốc độ ban đầu giúp cho sự điều hoà giữa cung và cầu ở các con đường phân nhánh. Việc điều chỉnh ở các con đường phân nhánh nhiều thuờng được thực hiện phức tạp hơn đo sự có mặt của các izoenzyme tức là những enzyme khác nhau nhưng xúc tác cùng một phàn ứng. Bước đầu đẫn tốc độ ban đầu có thể do một so izoenzyme xúc tác, mỗi izoenzyme chịu sự điều hoà riêng rẽ và độc lập. Trong tình hình như vậy, sự dư thừa của một sản phẩm cuối cùng sẽ làm giảm hoạt tính của con đường nhưng không hoàn toàn kìm hãm chức năng cùa con đường vì một số izoenzyme vẫn còn hoạt động.

Sản phẩm cuối củng p

Sản phẩm cuối củng Q

Trẽn hình là sự kìm hãm phun hồi [rong ỉ con đường phản nhánh với 2 sun phảtn cuối cùng. Các enzyme ờ điếm phân nhánh xúc tác sự chuyên hóa chât trung gian E thảnh F và G được điều chỉnh bới kìm hãm phàn hỏi. Các sàn phám p và Q cũng kìm hãm phim ứng mở đầu trong con đường. Tín hiệu - chỉ ra rang p hoặc Q kìm hăm enzvme xúc tác bước tiếp theo tín hiệu. [Theo Prescott, tìarỉey và Klein, 2005]. 16.6. SẢN XUẢT MỘT SÓ AXIT AMIN NHỜ VI SINH VẶT 16.6.1. Sinh tổng h ọ p axit glutam ic và sản x u ất mì chính Mì chính là muối mono - natri của axit glutamic - một axit amin trong 20 axit amin cẩu tạo nên protein trong cơ thể sinh vật. Mì chính là một gia vị thực phẩm phổ biến, tồn tại ở dạng bột hay tinh thể trắng, hình kim, óng ánh, hoà tan tốt trong nước, có vị ngọt cùa nước thịt và nấm có khả năng làm cho món ăn ngon hơn. Lịch sử ra đời của bột ngọt đã bắt đầu hơn 100 năm trước đây. Giáo sư Kikunae Ikeda - trường Đại học Hoàng gia Tokyo - Nhật Bản, trong thời gian học tập ở Đức, với khả năng cảm nhận vị tinh tế của mình đã nhận thấy: “Có một vị chung giừa măng tây, cà chua, phomat và thịt; vị này không giống vói vị nào trong 4 vị cơ bàn là ngọt, chua, mặn và đắng”. Ông cũng nhận trong thấy món nước dùng truyền thống Dashi được nau tử tảo biển [Konbu] cũng có vị ngon, vị ngọt đặc trưng như vị mà ông đã từng cảm nhận được khi ở Đức. Từ cảm nhận vị tinh tế đó, giáo sư Ikeda đã nghiên cứu và xác định được thành phần tạo nên vị ngọt tinh té trong tảo biển là axit glutamic hay glutamate. Ông đã đặt tên cho vị của glutamate là vị “umami” mà trong tịếng Nhật có nghĩa là vị ngon. Giáo sư Ikeđa cũng đã tiến hành nghiên cứu đặc tính nhiểu loại muối của glutamate và kết luận natri glutamate là dạng thích hợp nhẩt để làm gia vị với những ưu điểm nối bật về tỉnh tan, khả năng không hút ẩm và độ mạnh của vị umami: Cùng với những khám phá trên cùa giáo sư Ikeda, sản phẩm mì chính đã lần đầu tiên xuẳí hiện trên thị trường vào năm 1909. Vị "umami" - vị đặc trưng của mì chính - tồn tại độc lập và không giống bất kỳ vị nào trong bốn vị cơ bàn [chua, ngọt, mặn, đấng] mà chúng ta đã từng biết đến. Vị umami được mô ta là vị ngọt cùa thịt hay vị ngọt của nước đùng, [ồn tại tự nhiên trong thịt, cá, hái sán,

nấm, cà chua,

V .V ....

và đặc biệt là trong pho mát. Như vậy, umami chỉ là tên gọi mới cùa

một vị có từ rất lâu vốn rất quen thuộc với con người.

Không hút âm

Vị umamí

+ +

Tính tan -4-

-T- +■ -r-

-f + +

ị

+ + +

4- -r

;

-ỉ- -t f

G lu ta m a te Nítr1 glutamate [MSCÍ] ....

k a li

4-4-

g lu ta m a te

Canxi

i +

+ +

g lu ta m a te

ị Hiện nay, mì chính là một gía vị thực phẩm được sử dụng phổ biến trên toàn thế giới và đã được nghiên cứu trong một thời gian rất dài bởi nhiều tồ chức hàng đầu thế giới về thực phẩm và phụ gia thực phẩm như: ủ y ban Chuyên gia hồn hợp FAO/WHO về Phụ gia thực phẩm [JECFA] [WHO: Tổ chức Y tế Thế giới; FAO: Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực Liên Hiệp Quổc], ủ y ban Khoa học về Thực phẩm của Cộng đồng chung Châu Âu [EC/SCF], Cơ quan Quản lý Thuốc và Thực phẩm của Mỹ [US FDA]. Tất cả các tổ chức này đều kểt luận rẳng mì chính an toàn cho sức khỏe khi được sử đụng dưới dạng gía vị và đã đặt mà số quốc tế cho mì chính là 621. Trước năm 1987, JECFA khuyến cáo ràng liều dùng hàng ngày cùa mì chính [Acceptable daily intake - ADI] không nên vượt quá 120mg bột ngọư kg thể trọng/ ngày tương đương với một người có thể trọng 50kg không nên dùng quá 6 g bột ngọt trong một ngày. Tuy nhiên, sau khi tập hợp hơn 200 nghiên cứu trên các lĩnh vực hóa học, sinh học, sinh ỉý học, độc học... các nhà khoa học của Tổ chức này nhận thấy mỉ chính không gây ra bất kì ảnh hường nào tới đổi tượng thí nghiệm. Tại hội nghị lần thứ 31 vào năm 1987, JECFA đã chính thức tuyên bổ không cần qui định liều dùng hàng ngày cho mỉ chính. EC/SCF trong báo cáo vào năm 1991 cùng xểp mì chỉnh vào danh sách các chất phụ gia thực phẩm an toàn với liều lượng sử dụng hàng ngày không xác định. Ngoài ra, tố chức nay cũng kêt luận ‘không có bât cứ băng chứng nào cho thấy mì chính gây độc cho người tiêu dùng”.

Tại Việt Nam, Bộ Y té Việt Nam cũng xếp mì chính vào danh mục các loại phụ gia thực phẩm được phép sừ dụng trong quá trình chế biến thực phâm. Bên cạnh mì chính truyền thống còn có siêu mì chính. Năm 1913, học trò của Giáo sư Ikeda là ông Komada đã phát hiện ra disodium 5'- inosinate [Inosinate Mono-phosphateIMP] - một chất có trong cá khò - có vị umamỉ. Năm 1957, ông Kuninaka và các cộng sự đã khám phá ra một chất có vị umami trong loại nấm Shiitake khô - đó là chất disodium 5'guanylate [Guanylate Mono-Phosphate GMP]. Ông Kuninaka nhận thấy rằnsỉ nếu trộn mì chính với các nucleotide có vị umami kể trên thì sẽ được một hồn hợp có vị ngọt gấp nhiều lần so với mì chính thông thường [cường độ tùy vào tỉ lệ phối trộn], đó chính là siêu mì chính. Từ năm 1960, loại siêu mì chính này đã chính thức được giới thiệu và tiêu thụ trên thị trường. Ngày nay, nó đã trờ thành một chất điều vị được sử dụng phổ biến trên toàn thế giới. Inosinate có rất nhiều trong cá, thịt bò, thịt heo, còn guanyỉate thì được tìm thấy nhiều nhất là trong các loại nấm. 16.6,2. Sính tổng hợp axit glutamic Trong quả trình lên men axit glutamic, vi khuẩn sử dụng đườiìg, nhờ xúc tác của các enzym có sẵn trong nó, chuyển hóa qua nhiều phản ứng khác nhau đế cuối cùng tạo axit glutamic. Cơ chế như sau: Từ a-ketoglutaric [2 oxoglutarate] có thể có hai hướng tạo ra axit - glutamic. * Amin hóa keto-axii iZOXitrat-dehyđrogenase

[E1]

C 02

izoxitrat NADP

NADPH

a-Ẩs^-glutarate

glutamate NHĩ [E2] Sự tạo ra axit glutamic phụ thuộc vào sự tích tụ axit -a.ketoglutaric và sự có mặt của NH3, cũng như enzym glutamat- dehydrogenase.

Glucose Ỷ

V 'Ỷ

P y ru v a te J^C O

Acetyl-CoA

Mala

CO 2-oxoglu tarate

L-glutamate

Succinate. Succinfl-

Hình 16.27, Sơ đồ tổng hợp L-gỉiitamat. Khi không có NH3 thì axit a-keto-glutaric sẽ được tách ra từ chu trinh Kreb. * Chuyển amin hỏa kcttì-axìt Axit cc-ketoglutaric tác dụng với 1 axit amin nào đó - và có sự trao đổi nhóm keto [O O ] và nhóm amin [-NH 2] với nhau yOOH C=0 [CH2]2 + io O H

COOH CH-NH 2 R A x it am in

ctxit a-xetoglutaric

140

COOH * c |i-N H 2 + [CH2]2 COOHI

axit glutamic

COOH C- 0 k X et*-cuũl

16.6.3. Sản xuất mì chính nhờ vi sinh vật Là phương pháp sử dụng vi khuẩn lên men glucid thành axit glutamic. Năm 1956 nhà vi sinh học người Nhật là Kinosita đã phát hiện ra vi khuẩn Corynebacterium gỉutamicum có khả năng dùng tinh bột ngô, khoai, sắn tạo được axit glutamic. Từ đó, bắt đầu thời kỳ mới sản xuất mì chính bàng phương pháp lên men nhờ vi sính vật, thay cho phương pháp hóa giải từ bột lúa mi, Tính chất ưu việt của phương pháp này là sử dụng nguyên liệu có chứa glucid rẻ tiền, sử dụng vi sinh vật để lên men glutamic vì vậy tạo chù yếu là axit glutamic, giá thành rẻ, tốc độ sản xuất nhanh. Có thể cho lên men tạo axit glutamic trực tiếp tù nguyên liệu có sẵn đường hoặc từ nguyên liệu có bột đã qua đường hóa tạo dung dịch đường. Hiệu suất lên men thường rất cao. Trong môi truờng lên men, ngoài glucid còn cần cỏ muối amon, biotin [vitamin H] cho vi khuẩn phát triển và một ít kháng sinh để ngăn sự nhiễm vi khuẩn lạ. Chủng vi khuần lên men mì chính thường được sử dụng là Corynebacterium gỉutamicum, một loại trực khuẩn, hiếu khí. * Chủng lên men Giống vi sinh vật lên men được chọn phải có năng suất sản xuất cao, ốn định qua nhiều thế hệ, có khả năng chịu được các điều kiện môi trường khắc nghiệt [pH, nhiệt độ nồng độ cơ chất, nồng độ sản phẩm,...]; niôi trường dinh dưỡng phải đơn giản, nguyên liệu rẻ tiền, dễ pha chế, đễ áp đụng vào thực tế. Hiện nay, giống vi sinh vật thường được dùng là: Corynebacterium gìutamicum, Brevìbacterìum divaricatum hoặc Brevìbacterium lactofermentum. Giống khi đưa vào sử dụng được trải qua nhiều giai đoạn cấy chuyền, nhân giống cấp 1, cấp 1IV.. nhàm tăng đù sinh khối phục vụ cho giai đoạn lên men.

Trong quá trình nhân giống, môi trường dinh dirơng phải cỏ chứa đầy đủ các cơ chất cần thiết cho sự phát triển của chủng như carbon, nitrogen, vitamin, và các chất khoáng như muối sulfate, phosphate... Đặc biệt đối với chủng lên men sản xuất axit glutamic thỉ trong môi trường dinh dưỡng phải có biotin [vitamin H], đồng thời phải kiểm soát các điều kiện nuôi cấy [pH, nhiệt độ, độ oxy hòa tan...] ở mức thích hợp nhất. Ngày nay, đa số các chủng sản xuất axit glutamic đâ được biến đổi di truyền nhàm tăng năng suất sản xuất axit glutamic.

Í4I

* Phương pháp đột biến tạo chủiĩg vi khuẩn tổng hợp thừa L-axit glutamic Trong điều kiện sống bình thường, lượng axit amin do vi sinh vật tông hợp nên thường vừa đủ đáp ứng nhu cầu sinh lý của bản thân vi sinh vật. Đó là tính chât tự điêu hòa và cân đối của vi sinh vật. Chính vì vậy, cần sử dụng các phương pháp chọn lọc và tác động tới cơ chế di truyền của vi sinh vật để chúng tổng hợp lượng axit amin dư thừa so với nhu cầu và bài tiết axit amin đó ra ngoài môi trường. c. gỉutamicum không tổng hợp thừa L-axit glutamic dưới nhừng điều kiện nuôi cay thông thường mà cần có một trong số các điều kiện sau đây: - Hạn chế bioíin - Bổ sung chất hoạt động bề mặt - Bổ sung kháng sinh nhóm /3- lactam Các nhà khoa học đã nghiên cứu cợ chế phân tử về ảnh hưởng của nhừng tác nhân này tới việc tổng hợp thừa L-axit glutamic. Những kết quả nghiên cứu cho thấy các tác nhân này đã thay đổi 2 yếu tố ở c. gìutamicum dẫn đến việc tổng hợp thừa L-axit glutamic và L- axit glutamic được tiết ra ngoài môi trường: thay đổi chuồi phàn ứng tổng hợp L-axit glutamic và thay đổi tính thấm của màng tế bào. Cơ chể phân tử của việc tổng hợp thửa L-axit glutamic ờ c. gỉutamicum * Thay đối chuỗi phản ứng tổng hợp Gỉu; tác nhân hạn chế bỉotin VÀ bổ sung chất hoạt dộng bề mật Tại một nhánh cùa chu trình TCA, enzyme 2-oxoglutarate dehydrogenase [ODHC] và Glutamate dehydrogenase [GDH] cạnh tranh cơ chất a - ketoglutarate, một nhánh tạo thành L-AG và một nhóm tạo thành succinyl - CoA. Dưới điều kiện hạn chế biotin trong môi trường nuôi cấy, hoạt tính của ODHC giám, trong khi đỏ hoạt tính GDH không thay đổi, dẫn đến việc tổng hợp thừa L-axit glutamic. Hình minh họa dưới đây cho thấy: dưới điều kiện giới hạn lượng biotin, lượng biotin sẽ giảm dân cùng với quá trình tăng sinh tế bào, làm cho quá trình tăng trưởng vi sinh vật bị chậm lại và L-AG sẽ được tích lũy trong môi trường. Trong khi đỏ với chủng đối chứng không giới hạn lượng biotin, không quan sát thấy sự tích tụ L-AG:

Glucose

1.5

Tăng trường [0 0 X Ự26]

Í!Õ

ssphoenolpyruvat

0 G lu tam ate [m M ]

, Pyruvat

0.0

H o ạ t tính

ODHC

°°

biotin dổi d ả 0 ►CỌ

[A A 3 6 5 /p h ú t/ 0.0 m g p ro te in ]

biotin gióHí hạr t

H o ạ t tín h G D H [^ m o le s /p h ú t/ 2 00 m g p ro te in ]

Fom arat

100 10

Thởtgten

utamate

ODBC; 2-oxogfutarate . debyrogenase complex o Biotin đối dào • Biotín giới hạn GDH; glutamate dehydrogenase Tham khào; Bíoscl. Btotachnot. Bkicham.,

nudi cáy [giở]

11,1109-1112,1®»7

Tương tự, khí bổ sung chất hoạt động bề mặt Tween 40 ngay cà khi cỏ mặt biotin thì hoạt tính của ODHC cũng giảm trong khi hoạt tính GDH không thay đổi. Như vậy, bang cách hạn chê biotin hoặc bổ sung chất hoạt động bề mặt [Tween 40], hoạt tính của ODHC bị giảm bởt trong khi hoạt tính của GDH không thay đối, từ ketoglutarate sẽ thiên về tạo thành L-axit gỉutamic hơn đi theo nhánh tạo succinyỉ - CoA. Hiện nay, cơ chế cùa việc hạn chế biotin và thêm chất hoạt động bề mật đến việc suy giảm hoạt tính ODHC vẫn dang được tiếp tục làm rò.

14}

300

1-5

Glucose

Tâng trướng [OD X 1/26 ] I 200

1.0

isphoenolpyruvate

G lu tam ate

[m M ]

, Pyruvate

100

Hoạt tính0'05

ODHCO.04 0.03 {AA365/pIiútg Q2 /mg protein] 001

S u cd n ateS ^y '-^O z

Hoạt tín h * '^ GDH3.00 [/imoles/ph

H O P ị

L-qlutamate

oĐối Chứng o Tween 40

2.00

út/mg1-00

Tham khảo; Bioscì. Blotechnol. Biochem.,

protein] 10

61,1109-1112,1997

Thời gian nuôi cây [giờ]

* Thay đổi cấu trúc của màng tể bào: tác nhân hạn chế bìotin, bổ sung chất hoạt động bề mặt hoặc khảng sinh Ngay cả khi L-axit glutamic được tổng hợp thừa trong nộị bào, nếu L-axit glutíimic không được bài tiết ra ngoài môi trường thì cũng không đạt được hiệu quả mong muốn. Muốn L-axit glutamic được bài tiết ra ngoại bào cần có sự thay đồi tính thấm của màng tế bào. Ba tác nhân trên có tác dụng làm thay đổi cấu trúc của màng tế bào, giúp bài tiết Laxit glutamic ra ngoại bào theo minh họa hình đưới: -

Protein DtsRl có cấu trúc giống với tiểu phần của acetyl ~ coA carboxilase. Vì

biotin là cofactor cùa acetyl —coA carboxilase nên việc hạn chế biotin cũng như bổ sung chất hoạt động bề mặt cỏ thể ảnh hưởng đến phức hợp biotin - enzyme có chứa DtsRl. Phức hợp này tham gia vào quá trình tống hợp thành phần axit béo cùa màng tế bào, do vậy việc hạn chê biotin hoặc bổ sung chất hoạt động bề mặt ảnh hưởng đến việc tổng hợp lipid màng và làm thay đổi sức căng của màng tế bào. 144

Glucose

Chất hoat đông bề măt

Hình ỉ 6.28. Mó hỉnh thay đổi cẩu trúc màng [ế bào đè bài íiết axit glutamic.

- Penicillin ửc chế việc tổng hợp thành tế bào bàng cách bám vào các protein liên kết penicillin [penicillin binding protein - PBP]. Các protein này tham gia vào nhiều giai đoạn trong quá trình tổng hợp peptidoglican cùa thành tế bào vi khuẩn. Như vậy, bàng cách thay đổi cấu trúc, sức căng và tính thấm của thành tể bào và màng tể bào vi khuẩn, các tác nhân này làm thay đổi cấu trúc GluE là protein vận chuyển L-AG ra ngoại bào - một kênh tương đồng nhạy cảm cơ học [Mechanosensitive channel Msc - homolog]. Nhờ đó, L-AG được vận chuyển ra ngoài tế bào. Protein này được mã hóa bởi gene NCgỉỉ221. Cài biến di tniyền để c. gỉutamicum

tổng hợp thừa L-axit glutamic ngay dưới

những điều kiện sản xuất thông thường mà không cần bố sung tác nhân Trong điều kiện sản xuất thực tế, việc phải bổ sung các tác nhân để vi sinh vật tổng hợp thừa L-axit glutamic có một số nhược điềm như sau: - Tăng chi phí sàn xuẩt - Phải tiến hành tinh chế và loại bò tác nhân khoi thành phẩm

[45

- Việc hạn chế biotin mâu thuẫn với việc vi khuẩn

ghưamicuni

cần có biotin cho

nhu cầu tăng trưởng, ngoài ra nguyên liệu mật mía đường dùng đê sản xuât L-axit glutamic có chứa một lượng đáng kể biotin. Từ những khám phá về cơ chế phân tử, các nhà khoa học đã tiến hành cải biến gene của

gỉutamicum để chủng vi khuẩn này tổng hợp thừa L-axit glutamic ngay dưới những

điều kiện sản xuất thông thường mà không cẩn bổ sung tác nhân. * Thay đỗi chuỗi phản ứng tổng hợp L-axìt glutamic bằng cách giảm hoạt tính ODHC Điều này được thực hiện bằng cách loại bò gene odhÁ, Chủng vi khuẩn thiếu gene odhA không cỏ hoạt tính ODHC và sẽ tổng họp thừa L-axit glutamic ngay cả dưới nhừng điều kiện phản ứng bình thường, không cần hạn chế biotin hoặc bổ sung chất hoạt động bề mặt. - Cẩu trúc gene odhA '. Phức hợp ODHC gồm có 3 tiểu đơn vị: Elo, E2o và E3

Elo: 2-oxoglutarate dehydrogenase

[EC1.2.4.2]

odhA

E2o: dìhydrolipoamide S-succinyitransferase [EC2.3.1.61] E3: dihydrolipoaminde dehydrogenase

[EC1.8.1.4]

Tiểu đơn v ỊE lo được mã háa bởi gene odhA, Gene odhA gồm có 2 vùng chính: vùng xúc tác E2o có cấu trúc giổng domain và vùng bảo tồn Elo. Vùng xúc tác E2o có câu trúc giống domain thường thấy ờ những vi khuẩn Gram dương với ham lượng GC cao như Mycobacterium tuberculosis, Streptomyces coelicolor. Ngoài ra, genome của

glutamicum Vùng xức tác E2o giống dom ain

còn có tiểu đơn vị E2o.

Vùng bào tồn E to ----

e / x / 257* a

3CCa.ứ Qem&đM/ĩ Hình 16.29. Mô ta gene odhA. 146

Phương pháp tạo chủng vi khuần khuyết gene oclhA + Nhân đoạn gene chứa odhA bàng PCR + Sử dụng enzyme giới hạn cat bỏ đoạn gene odhA + Phần gene còn iại được gắn vào plasmid bàng ligase + Đưa plasmid vào vi khuẩn * Điều chỉnh khả năng bán thắm của màng tế bào Điều chỉnh khả năng bán thấm của màng tế bào bằng cách cải biến gene NCgll221 mã hóa protein mang GluE. -

Khuếch đại gene bằng PCR, qua đỏ gia tăng sự bài tiết L-axit glutamic. Tuy nhiên, với cách cải biến này vẫn cần có những tác nhân như hạn chế biotin, bổ sung chất hoạt động bề mặt hoặc penicillin để kích thích bài tiết L-axit glutamic.

Đột biến gene để quá trình bài tiết L-axit glutamic diền ra mà không cần bổ sung các tác nhân. Tạo thể đột biến bàng cách nhân dòng đoạn gen NCgll221, sau đó cát đoạn gene bằng một số loại enzyme giới hạn khác nhau và gán vào plasmid. Tiến hành chọn lọc những chủng đột biển có khả năng bài tiết L-axit glutamic mà không cần có tác nhân.

* Thu hồi và tinh sạch: Dịch sau lên men ngoài axit glutamic còn các tạp chất khác nên cần phải tinh sạch và thu hồi axit glutamic bằng cách điều chỉnh pH địch axit glutamic về điểm đẳng điện của axit glutamic pH = pl = 3,22 bằng H2SO4 và giảm nhiệt độ xuống khoảng 4-15°C. Để loại tạp chẩt khác khỏi dịch lên men có chứa axit glutamic, thông thường người ta có thể dùng nhựa trao đổi ion [Resin]. Resin có hai loại: - Resin dương tính [có tỉnh axit] trao đổi ion [+] - Resin âm tính [có tính kiềm] trao đổi ion [-] Môi trường khi tiến hành trao đổi ion phải axit, nếu pH kiềm hay gần trung tính, axit glutamic thể hiện âm tính, sẽ không tách được [pH phù họp < 5 ]. * Loại màu: Có thể sử dụng than hoạt tính để loại màu dung dịch axit glutamic. Tạo mì chính

147

Trung hoà axit glutamic bằng Na2CƠ3 hay NaOH 40 - 50% đến pH bằng 6,8 để tạo glutamat - Na, lọc, cô đặc, kết tinh, sấy chân không ở nhiệt độ thấp, thu được tinh thể mì chính màu trắng - đem phân loại, đóng gói. Mỉ chính có vị umami, tinh thể trắng, khô, rời, không có mùi vị lạ. Theo tiêu chuẩn Việt Nam, sản phẩm mì chính phải đạt các tiêu chuẩn nhu bảng sau: Yêu cầu kỹ thuật Cảm quan

Tiêu chuẩn Việt Nam [TCVN]

Đơn vi•

Tinh thể trắng hoặc bột kết tinh trắng, không mùi, cỏ vị đặc trung

Monosodium glutamate

Không nhỏ hơn 99

Độ ẩm

Không lớn hơn 0,5 6,7 -7,2

Độ quay cực đặc trung

độ

24,8 - 25,3

Clorua

Không lớn hơn 0,2

Tổng số bảo tử nấm men - mốc

CFU/g

Không lớn hơn 0,2

Kim loại nặng [qui ra chì]

mg/kg

Không lớn hơn 1o2

Asen

mg/kg

Không lớn hơn 10

Chì

mg/kg

Không lcm hơn 5

16.6.2. Sinh tổng họp lysine và sản xuất lysine L-ỉysine là axit amin không thay thế, có nhiều vai trò quan trọng trong cơ thể, cần được bô sung vào thức, ăn cho con người và động vật qua chế độ ăn để đáp ứng nhu cầu cho cơ thể. Đặc biệt các loại ihức ăn từ ngô, lúa mì hay đại mạch rất nghèo lysine. Lysine có công thức phân tử là C6H!4N 20 2, khối lượng phân tử 146,19 CH2[NH2]- [CH2]3- CH[NH2]- COOH Lysine dê tan ừong nước, trong axit và kiềm, khó tan trong cồn và không tan trong ete, bị phân huỳ ở 224-225°C. Lysine tinh thể có màu ừáng, hình lục giác, có vị chát, Bên cạnh đó, bô sung lysine là làm tăng giá trị sử dụng của thức ăn. Chẳng hạn như bổ sung 0,5% thì có thê tăng giá trị sử dụng protein tương đương 20% đậu tương. Vi bất cử nguồn

148

n itơ axit a m in th ư ờ n g sẽ bị c h u y ể n th à n h N H 3 v à thài ra n g o ài. B ổ su n g ly sin e v ào th ứ c ăn

có tác dụng làm giảm lượng protein sử dụng và giảm ô nhiễm chất thải động vật nuôi. * Sản xuất lysine Lysine được sàn xuất bằng con đường lên men sử dụng vi khuẩn Corymbacterium gỉutamicum trong vòng 40 năm nay. * Chủng vi sinh vật Các chủng sinh L-lysine có hiệu quả được tìm thấy trong số các chủng sinh axit glutamic, chủng đột biến của Corynebacterium và Brevibacỉerium và những chủng-khuyết dưỡng homoxerin hoặc khuyết dưỡng methionin-threonin. Những chủng sản sinh nhiều lysine cũng là những chủng bền đối với lizin-antiraetabolic S- [P-aminoethyl]-L-cystein [AEC]. Người ta đã nghiên cứu tạo các chủng đột biến có khả năng tổng hợp L-lysin cao từ Brevibacterium lacto/ermentum. Trong cơng nghiệp, sử đụng B.flavum là chủ yếu. Ngoài ra có thể sử dụng s . cerevisiae, Toruỉopsis ĩitilis, Bacterium megaterum, Brevibacíerium sp., Streptomyces coroniformis, Bacillus subíiỉis, Corynebacterhm acetophìỉỉum, c. gỉutamìcum, từ parafin.' Aỉcaỉỉgem marshaỉỉiì, Pseudomonas fluorcscens, Nocardỉa sp. Bên cạnh đó, các nhà khoa học nhận thẩy rằng, dung họp tế bào trần giữa các chủng có hiệu

suất cao hơn các chủng hoang dại Brevibacterium

lactofermentum,

Corynebacterium và các chủng đột biến Brevịbacterium đã đem lại kết quả là cho ra những chủng có tính chất phát triển mạnh và hiệu suất sinh tổng hợp cao. * Cơ chế sinh tổng hợp ỉysine trong tế bào vì sinh vật Cơ chế sinh tổng họp lysine được giải thích từ axit aspactic. Một đường sinh tổng hợp biển axit aspactic thành lysine, còn con đường kìa thỉ sinh ra homoxerin. Homoxerin là sản phẩm trung gian để tạo thành treonin và isoleucin hoặc tạo ra metionin. Khi phá vỡ sự tổng hợp threonine, methionine và isoleucin ở giai đoạn hình thành homoxerin thì hướng của phản ứng sẽ chuyển sang tổng hợp lysine. Phản ứng đàu tiên của quá trình tồng hợp lysine được xúc tác bằng enzyme aspactate-kinase, được coi là enzyme quan trọng của sự tổng hợp lysine. Enzyme này dường như bị ức chế bởi 2 sản phẩm cuối cùng là L-lysine và L-threonin và sinh ra. ức chế ngược.

149

N hư vậy trong quá trình tổng hợp lysine, enzyme chìa khóa là aspactate kinase. Khi tổng hợp lysine, threonine ở nồng độ cao kìm hẫm enzyme aspactate kinase, kêt quà là làm

tăng lượng lysine. Threonine của các loài vi khuẩn E. coỉi, Micrococcus gỉutamicus kìm hãm sự hoạt động của các enzyme aspactate - aldehyt dehydrogenase và homoxerin dehydrogenase.

Tbreonindehydrogenase là chất kìm hãm isoleucin. 'Nhu vậy, các sàn phẩm trao đôi chất là chất làm giảm các hoạt tính của enzyme tham gia v:*0 qúa trình tổng hợp lysine. Các chất này cần được tách ra, chính vì thế các vi sinh vật khuyết dưỡng là thích hợp nhất để

dùng trong sản xuất như các loài vi sinh vật không cô hoạt tính enzyme homoxerin dehydrogenase đàm bào hiệu suất tạo lysine cao.

Quá trình tổng hợp lysine ở tế bào vi khuẩn [E. coiì, aspactic còn ở nấm men và nấm mổc [Toriiỉa utiỉis,

gỉutamìcum]-

ccrevisiae,

bát đầu từ axit

Penỉcìỉlium]- bắt đầu từ

cc-ketoglutaric.

* Môi tm ờ ng lên men Môi trường dinh dưỡng dùng để nuôi cấy vi sinh vật và để tổng hợp axìt amin chứa

nguồn cacbon, nước chiết ngô hay dịch thuỷ phân protein. Nguồn cung cấp đạm có thể là các muối amon hay ure. Trong quá trình tổng hợp lysine, các chất kích thích sinh truởng đóng vai trò quan trọng - ví dụ biotin. Ngoài ra, còn cần các axit amin như methionín, homoserin, treonin. Nếu giảm nồng độ bỉotin xuống 1-4 \igỉ\ thì vi sinh vật này sinh tổng hợp ra glutamic. Nếu tăng đến 2,5 mg thì tạo thành nhiều iỉXÌt lactic. Đó là hiện tượng của cơ chể tác dụng ngược. N guồn nguyên liệu sản xuất lizin bằng các chủng vi sinh vật khác nhau N guồn c ơ c h ẩ t

150

L oại VI sin h v ậ t

H iệu s u ấ t, g/1

Ri đường củ cải

Ẽrevibacterium sp .22

Rỉ đường mía

flavum

Glucoza

B.flavum

75-105

Giucoza

Corynebcicterium ghitamicum

Acetate

fla vu m

Ethanol

B.iactfermentum

n-alkanes

Nocardia

aỉkcmoglutinosa

i 29

Ọuá trình lên men từ ri đường mía bằng c. gỉutamicum [chùng 901], được thực hiện với các điểu kiện sau: - Giống cap 1: glucose 20g, pepton lOg, cao thịt 5g, NaCl 2,5g, nước 1L; - Giống cấp 2: ri đường 50 g, [NH4]2S04 20g, cao ngô 50g, CaC03 lOg, nước 1L. - Giống chính: Rỉ đường mía 200g [tính theo đường], dịch thủy phân protein đậu tương 18g, nước 1L. * Lên men sản xuất lysine Quá trình lên men diễn ra ờ điều kiện nhiệt độ: 28-30°C. Điều kiện pH tối thích 7,07,6 [thông thường trong thực tế duy trì 6 ,0-8,5]. Thòi gian ln men sinh lysine 60-72 giờ. Trong những ngày đầu sử dụng gần 25% lượng nitơ tổng số, sau đó tốc độ sinh khối giảm Người ta đuy trì pH bằng cch sử dụng NH4OH [25%] hoặc NaOH 15%. Oxy cần cung cấp trong quá trình lên men: tốc độ khuấy 150 rpm, sục khỉ 0,6 vvm. Giống vi khuẩn thường được bổ sung với tỷ lệ 1-5% [so với thể tích dịch lên men] * Tách VÀ thu sản phẩm Có 4 loại sản phẩm: 3 loại dùng cho chăn nuôi và 1 loại lysine tinh khiết. - Lysine đặc - Lysine bột - Lysine thô có chất độn - Lysine tinh khiết Sân phẩm lysine đặc. cần cô đặc dịch lên men có cả tể bào đến nồng độ 5-6%.Sau đó sấy phun bằng không khí nóng 250°c. Sản phẩm này có thành phần: 15-20% lysine, 1517% protein, 14% axit amin khác, 24-25% chất tro, sản phẩm này rất dễ hút ẩm. Săn phẩm ỉysine bội: Để cố loại sản phẩm này cần cô đặc đến 40-70%, dạng sệt. Điều kiện cô đặc chân không 0,8 kg/cm2 để tránh làm hỏng lysine. Sàn phẩm màu đen, có mùi thơm đặc trưng . Sản phẩm bảo quản được 3-4 tháng. Thành phần: Lysine 15-20%; Protein 22-25%; hydratcacbon: 1-2%, đạm amin: 2,1-2,4%.

151

* Sản phẩm lysine

thô có chất đôn

Sản phẩm loại này có sử dụng phụ gia là cám mỳ hoặc cám gạo với mục đích làm giảm hao hụt trong quá trình sẩy và giảm tính hút âm của sản phâm. Sau khi cô đặc đèn độ ẩm 40%, trộn thêm chất phụ gia để độ ẩm đạt 30%, tạo hạt rồi sấy. sấy bàng không khí nóng nhiệt độ 110-120°c, v=6-7 m/s. Nhiệt độ không khí ra là 75-85°C. Các hạt có nhiệt dộ 70-80°C. Sau khi sấy, làm nguội đến 40°c trong 3 phút. Sau đó nghiền để tạo sản phẩm. Hàm lượng lysine trong sản phẩm loại này đạt 7-10% * Sản phẩm lysine tinh khiết Để tách được lysine tinh khiết, trong công nghiệp thường dùng phương pháp trao đổi ion và thực hiện theo các bước như trong sơ đồ. Các loại nhựa hay sử dụng đều là các cationit có tính axit mạnh. Các sản phẩm nhựa trao đổi ion DOWEX để thu nhận lysine Sản phẩm

Dạng

Chất nền

D O W EX N406

Cation axit mạnh

Styrene/DVB Gel, 10% liên kết ngang

DOW EX

Cation axit mạnh

Styrene/DVB Gel, 8% liên kết ngang

Cation axit mạnh

Styrene/DVB Gel 8% liên kết ngang

Cation axit mạnh

Styrene/DVB Gel 6% liên kết ngang

M ARATH ON *

C[H+] DOW EX HCRS

[11+] DOWEX N606

Để thu nhận lysine bàng phương pháp trao đổi ion thường sử dụng nhựa dạng cationit với NH+4. Dịch lên men sau khi tách tế bào được axií hỏa bàng axit HC1 hoặc H2SO4, sau đó cho qua cột trao đôi ion và lysine được gắn trên nhựa qua phản ứng trao đổi íon. Sau đó lysine được tách ra bằng phản ứng rưa giải bàng dung dịch hyđroxyt amon. Phản ứng hấp phụ: Lysine2+ + 2 [NH4 +] cationit

2 NH4+ + Lysine2+ cationit

Phản ứng nhả hẩp phụ: 2 NH4+ + Lysine2+ cationit —» Lysine2+ + 2 [NH4+] cationit Sau khi rửa giải bằng mrớc amoniac nồng độ 0,5-5% đến khi lượng lysine còn trong nước rưa là 1-2%, thu được dịch chứa iysine. Hiệu

SLiất

nhả hấp phụ đạt được 80-90%

lysine. Sau đó đun ớ 80°c dể loại NYU. Rồi dùng HC1 2N để điều chỉnh pH 4,5-5,0. cỏ

đặc ở 60°c, nồng độ lysine đạt 30-50%. Lysine.HCl kết tinh ở nhiệt độ 10-12°c, có tinh thể màu vàng. Các tinh thể này được rửa sạch khỏi các tạp chất bang ethanol [dùng 3-4 lần thể tích tình thể]. Sau khi ly tâm thu được tinh thể có kích thước 0,2-2,5 mm có độ ẩm 17%. Các tinh thể này được đem sấy đến độ ẩm đạt 0,5-1% bằng không khí nóng ờ nhiệt độ 120°c, không qúa 80 giây hoặc 100°c không qúa 100 giây. Đặc điểm của sản phẩm tinh khiết 1 : 97% lysine. HC1, độ ẩm không quá 0,5%, thành phần chất tro 0,3%, khối luợng riêng 525-650 g/1 và độ hòa tan 642 g/1.

Tại Việt Nam đang sử dụng chủng vi khuẩn -

Khuyết gene odhA

Đột biến gene GluE

Chương ĩ 7

GIẢI PHÓNG VÀ BẢO TOÀN NĂNG LƯỢNG Ở VI SINH VẬT

17.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ TRAO ĐỎI CHẮT Sau khi đã đề cập đến các nguyên tẳc cơ bản của nhiệt động học, chu trình năng lượng và vai trò của ATP như đồng tiền năng lượng, bản chất và chức năng của các enzym cũng như việc điều chinh hoạt tính enzym trong chương này chúng ta sẽ bàn về trao đổi chẩt. Trao đổi chất là tổng số các phản ứng hóa học diễn ra bên trong tế bào nhờ có dòng năng lượng và sự tham gia của các enzym. Trao đổi chất có thể được chia thành hai phần chủ yếu: dị hoá [catabolism] vả đồng hoá [anabolism]. Trong dị hoá các phân tử lớn hơn và phức tạp hơn bị bẻ vỡ thành các phân tử nhỏ hơn vả đom giản hơn đồng thời năng lượng được giải phóng. Một phần năng lượng này được giữ lại và tạo thành công, phần còn lại thoát ra ở dạng nhiệt. Sau đỏ, năng lượng giữ lại có thể được dùng trong đồng hoá là giai đoạn sau của trao đổi chẩt. Đồng hoá lả việc tổng hợp các phân tử phức tạp‘ từ các phân từ đơn giản hom và cần năng lượng. Quá trình đồng hoá sử dụng năng lượng để làm tăng trật tự của một hệ thống. Mặc dù việc phân chia trao đổi chất thành hai phần chủ yếu ỉ à tiện lợi và được sử dụng phổ biển, tuy nhiên, càn nhớ rằng, không phải tất cả các quả trình sản sinh năng lượng đều phù hợp với định nghĩa nói trên về sự dị hoá nếu như định nghĩa này không được mở rộng bao gồm cả các quá trình không có sự phân giải các phân tử hữu cơ phức tạp. Theo nghĩa rộng hơn các vi sinh vật thường sử dụng một trong ba nguồn năng lượng. Vi sinh vật quang dưỡng thu nhận năng lượng bức xạ từ mặt trời [hình 17.1], Vi sinh vật hoá đường hữu cơ oxy hoá các phân tử hữu cơ để giài phóng năng lượng, trải lại các vi sinh vật hoá dưỡng vô cơ lại sử dụng các chất dinh dưõng vô cơ lảm nguồn năng lượng.

154

PHOTOTROPHY

CHEMOORGA NOTROPHY

Reduced organic compound

Oxidized organic compound

CHEMOUTHOTROPHY Reduced inorganic compound

Oxidized Inorganic compound

Chemical energy

W ork

Hình Ì7.1: Các nguồn năng luợrtg được sử dụng bởi vi sinh vật. Hầu hét vi sinh vật sử dụng ỉ trong 3 nguồn nàng ỉuợng. Các vi sinh vật quang dưỡng thu nhận năng lượng bức xạ từ mật trời nhờ các sac tổ như bacỉeriochlorophyỉ và chỉorophyỉ. Các vì sinh vật hỏa dưỡng oxy hóa các chất dinh dường hữu cơ và vó cơ khử để giài phóng và thu nhận năng ỉuợng. Hóa năng dần xuất từ 3 nguồn này sẽ được dùng đế sàn ra công. [Theo: Prescott và cs, 2005]. Vi sinh vật không chi khác nhau về nguồn năng lượng mà còn khác nhau về các chất nhận electron được sử đụng ở các cơ thể hoả dưỡng [hình ỉ 7.2]. Các chất nhận electron gồm ba loại chính. Trong lên men cơ chất mang nâng lượng bị oxy hoá và phân giải không có sự tham gia của một chất nhận electron từ bên ngoài hoặc cỏ nguồn gốc từ bên ngoài. Thông thường con đường dị hoá sản ra một chất trung gian như Pyruvat tác dụng như chất nhận electron. Nói chung, lên men diễn ra trong điều kiện kỵ khí nhưng đôi khi cũng được thực hiện ngay khi có mặt oxy. Dĩ nhiên, trao đổi chất sản sinh năng lượng cũng có thể sử đụng các chất nhận electron từ bên ngoài hoặc cỏ nguồn gốc từ bền ngoài. Quá trình trao đổi chất này được gọi là hô hấp [respiration] và được chia làm hai loại khác nhau: 1. Hô hấp biểu khí: chất nhận electron cuối cùng là oxy; 2. Hô hấp kỵ khí: 155

chất nhận electron có nguồn gốc khác nhau từ bên ngoài. Chẩt nhận electron trong hô hấp kỵ khí phổ biến nhất là chất vô cơ [chẳng hạn, NO 3', SO42 , CO2, Fe3+, SeƠ42...] nhưng đôi khi cũng là chất hữu cơ [như fumarat]. Trong hô hấp thường có sự tham gia của một chuỗi vận chuyển electron. Năng lượng thu được ừong lên men và hô hâp rất khác nhau. Chất nhận electron trong lên men có cùng trạng thái oxy hoá như chất dinh dưỡng ban đầu và không có sự oxy hoá hoàn toàn chất dinh dưỡng. Do đó chỉ một lượng nhỏ năng lượng được tạo thành. Chất nhận electron trong các quá trình hô hấp có thế khử dương hơn nhiều so với cơ chất, do đó trong hô hấp năng lượng được giải phóng nhiều hơn đáng kể. Trong hô hấp hiếu khí cũng như kỵ khí ATP được tạo thành nhờ hoạt động của chuồi vận chuyển electron. Các electron tham gia trong chuỗi có thể thu được từ các chất dinh dưỡng vô cơ và năng lượng có thể bắt nguồn từ sự oxy hoá các phân tử vô cơ hơn là từ các chất dinh dưỡng hữu cơ. Khả năng này gặp ở một số vi sinh vật nhân nguyên thuỷ gọi là vi sinh vật hoá dường vô cơ. Chất cho e’ hữu cơ

1' .Chất nhận electron hữu cơ nội sinh

Chất cho e' vô cơ

H ô hấp Hô hấp kị hiểu k h í k h í

NO3- SO,2",

H óa tự dưỡng

1f 0 2, s o / - , n o 3-

coj, fumarate

Hình ĩ 7.2: Các kiểu giải phóng năng luợng. Lên men là quả trình giáỉ phông năng htợng trong đỏ một chất cho electron hữu cơ chuyền các electron cho một chất nhận nội sinh thuừrtg là một chất trung gian bắt nguồn từ sự phân giải chất dinh dưỡng. Trong hô hâp, các electron được chuyền cho một chất nhận từ bên ngoài [ngoại sinh] như O2 [hô hâp hiêu khi] hay NOỉ, s o / ị.hô hấp kị khí]. Các hợp chất khử vô cơ cùng có thế được dùng như các chát cho electron trong việc tạo thành năng luợng [sự hóa dưỡng vô cơ]. [Theo: Prescott vờ cs, 2005]. Cũng cân nhớ răng những định nghĩa về lên men, hô hẩp hiếu khí và hô hấp kỵ khí nói trên hơi khác với những định nghĩa dùng bời các nhà sinh học và sinh hoá học. Lên men cũng cỏ thê được định nghĩa như là một quá trinh sinh năng lượng trong đó cảc phân tử hữu cơ được đong thời dùng làm chât cho và chất nhận electron. Hô hẩp là một quá trình sinh năng lượng trong đó chất nhận là một phân tử vô cơ như oxy [hô hấp hiếu khí] hay một chất vô cơ [hô hấp kỵ khí]. Vì vi sinh vật rất linh hoạt và thay đổi trong trao đổi năng lượng nên những định nghĩa nói trên chừng nào rộng hơn sẽ được dùng ở đây. 156

Hình ỉ 7.3: Ba giai đoạn cùa sự dị hóa. Sơ đồ tong quát cùa sự dị hóa hiếu khỉ trong 1 vi sinh vật hóa dị dưỡng hữu cơ chi ra 3 giai đoạn trong quá trình này vù vị trí trung tâm cùa chu trình axit trỉcacbonxyỉic. Mặc dù có nhiều protein, polixaccarit vỏ lipit nhưng chủng bị phân giài chi qua hoạt tinh của 1 vài con đường trao đổi chất phổ biển. Chú ý, các đường ...ở đáy chi dòng các electron mang bởi NADH và FADHj tới chuỗi vận chuyến electron. [Theo: Prescott và cs, 2005]. Trao đổi chất trong điều kiện hiếu khí cỏ thể được chia thành 3 giai đoạn [hình ỉ 7.3]. Trong giai đoạn thứ nhất của sự dị hoá các phân tử chất dinh dưỡng lớn hơn [protein, polixaccarit và lipit] bị thuỷ phân hoặc bị phân giải theo kiểu khác thành các phần nhỏ hcm. Các phản ứng hoá học diễn ra trong giai đoạn này không sản sinh nhiều năng luợng. Các 157

axit amin, monoxaccarit, axit béo, gỉyxerol và các sản phẩm khác của giai đoạn này bị phân giải theo kiểu khác thành một số phân tử đơn giản hơn trong giai đoạn hai như Acetyl-coenzym A, Pyruvat và các chất trung gian của chu trình axit tricacbonxylic. Giai đoạn thử hai có thể hoạt động trong điều kiện hiếu khí cũng như kỵ khí và thường tạo thành một số ATP cũng như NADH và/hoặc FADH2. Cuối cùng cacbon trong chất dinh dưỡng được chuyển vào chu trình axit tricacbonxylic trong giai đoạn ba của sự dị hoá và các phân tử được oxy hoá hoàn toàn thành CO2 đồng thời với sự tạo thành ATP, NADH và FADH 2. Chu trình hoạt động hiếu khí và giải phóng nhiều năng lượng. Phần lớn ATP bất nguồn từ chu trinh axit tricacbonxylic [và các phản ứng của giai đoạn 2] là do sự oxy hoá của NADH và FADH 2 nhờ chuỗi vận chuyển electron. Oxy hoặc đôi khi, một phân tử vô cơ khác là chất nhận electron cuối cùng. Mặc dù sơ đồ trình bày trẽn đã được đơn giản hoá đi nhiều nhưng vẫn thuận tiện cho việc phân tích mô hình tổng quát của sự dị hoá. cần chú ý rằng, vi sinh vật bắt đầu với rất nhiều phân tử và ờ mỗi giai đoạn số lượng và sự đa dạng của chúng bị giảm đi. Nghĩa là, các phân tử chất dinh đưõng được chuyển thành các chẩt trung gian trao đổi chất với sổ lượng liên tục nhỏ hơn cho tới khi, cuối cùng, chúng đi vào chu trình axit tricacbonxylic một con đường chung thường phân giải nhiều phân tử tương tự, chẳng hạn nhiều loại đường khác nhau. Các con đường trao đổi chất này bao gồm các phàn ứng do enzym xúc tác được sắp xếp sao cho sản phẩm của phản ứng này sẽ dùng làm cơ chất cho phản ứng sau. Sự tồn tại của một số con đường dị hoả chung, mỗi con đường phân giải nhiều chất đinh dưỡng, sẽ tăng rõ rệt hiệu quả trao đổi chất nhờ tránh được nhu cầu đối với một số lượng lớn các con đường kém linh hoạt về trao đổi chất. Các vi sinh vật thể hiện tính đa dạng về dinh dưỡng chính là trong pha dị hoá. Hầu hết các con đường sinh tổng hợp ở vi sinh vật và ở các sinh vật bậc cao là khác nhau. Tính độc đáo của trao đổi chất ở vi sinh vật là sự đa dạng các nguồn tạo thành ATP và NADH [hình 17.1 và ì 7.2]. Cốc hidrat cacbon và các chất dinh đương khác đàm nhiệm hai chức năng trong trao đổi chất của các vi sinh vật dị dưõng: 1. Bị oxy hoá để giải phóng năng lượng. 2. Cung cấp các khối cacbon hoặc khổi xây dựng dùng cho tổng hợp các thành phần của tế bào mới. Mặc dù nhieu con đường đồng hoá và dị hoá tách riêng nhau nhưng cỏ một số con đường là lưỡng hoá [amphibolic] hoạt động cả trong đồng hoá và dị hoá. Hai trong số các con đường quan ừọng nhẩt là đường phân và chu trình axit tricacbonxylic. Hầu hết các phản ứng trong hai con đường này đeu thuận nghịch dễ dàng và có thể được dùng để tổng

158

hợp và phân giải các phân từ. Một số bước dị hoá một chiều được đi vòng trong sinh tổng hợp với các enzym đặc biệt xúc tác phản ứng ngược lại [hình Ị 7.4].

\ l / D

Sự dị hỏa Catabolism

Sự đồng hóa wiaiXHism

Hĩnh ỉ 7.4: Con đường lưỡng hóa. Đây là sơ đồ của ỉ con đường ìitỡng hóa, chẳng hạn đường phân, cằn chú ý, sự chuyển hóa qua lọi cùa các chất trung gian F và G được xúc tác bởi 2 enzym riêng biệt: E/ hoạt động theo hướng phân giải và E2theo hướng tổng hợp. [Theo: Prescott và cs, 2005]. Chẳng hạn, enzym fructoz-bisphotphataz xúc • tác ngược chiều với

bước

photphorusfructozkinaz khi glucoz được tổng hợp từ pyruvat. Sự tồn tại của hai enzym riêng rẽ, enzym này xúc tác phản ứng ngược chiều với enzym kia cho phép chức năng dị hoá và đồng hoá của các con đường nói trên được điều chỉnh độc lập. 17.2. S ự PHÂN GIẢI GLUCOZ THÀNH PYRUVAT Vi sinh vật sử dụng một số con đường trao đổi chất để chuyển hoá glucoz và các đường khác. Do tinh đa dạng về trao đổi chất như vậy mà trao đổi chất của chúng thường rắc rối. Để tránh những rác rối cỏ thể xày ra các con đường vi sinh vật phân giải đường thành Pyruvat và các chất trung gian tương tự sẽ được tập trung vào ba con đường: đường phân, con đường pentoz-photphat và con đường Entner - Doudoroff. Tiếp theo đó, các con

159

đường phân giải pyruvat hiếu khí và kỵ khí sẽ được đê cập. Đê đơn giản, câu trúc hoá học của các chất trung gian trong trao đổi chất sẽ không đuợc dùng trong sơ đô của con đường. 17.2.1. Con đường đường phân [con đường Embden-M eyerhol] Đây ỉà con đường phổ biến nhất đùng phân giải glucoz thành pyruvat trong giai đoạn hai của dị hoá. Đường phân gặp ở tất cả các nhóm chù yếu của vi sinh vật và hoạt động trong sự có mặt cũng như vắng mặt của oxy. Quá trình này diễn ra trong phần nền tế bào chất cùa cơ thể nhận nguyên thuỷ và nhân thật. Đường phân có thể được chia thành hai phần [hình 17.5]. Trong chặng mở đầu 6cacbon glucoz được photphoryl hoá hai lần, cuối cùng được chuyển thành fructoz-1,6bisphotphat. Các đường khác thường nhập vào con đường đường phân thông qua việc chuyển hoá thành glucoz-6-photphat hoặc fructoz-6-photphat. Chặng mở đầu này không sinh năng lượng, trái lại phải tiêu thụ hai phân tử ATP cho một phân tử glucoz. Tuy nhiên, nhờ việc gắn photphat vào mỗi đầu của đường mà các photphat này sẽ được dùng để tạo thành ATP. Chặng 3-cacbon của đường phân bắt đầu khi enzym fructoz-l,6-bisphotphat aldolaz xúc tác phân giải fructoz-l,6-bisphotphat thành hai nửa, mỗi nửa đều chứa nhóm photphat. Một ừong các sản phẩm là glyceraldehit-3-photphat được chuyển trực tiếp thành pyruvat trong quá trình gồm 5 bước. Sản phẩm thứ hai là dihydroxyaceton-photphat có thể dễ dàng chuyển thành glyceralđehit-3-photphat, do đó cả hai nửa của fructoz-l,6-bisphotphat đều được sử dụng trong chặng 3-cacbon. Trước hết, glyceraldehit-3-photphat bị oxy hoá nhờ NAD+ là chất nhận elecừon, đồng thời một nhóm photphat được gắn vào để tạo thành 1,3b isp h o tp h a t g ly cerat là m ộ t p h â n tử cao năng. S a u đó p h o tp h a t cao n ă n g ở c a cb o n 1 được

chuyên cho ADP và xuất hiện ATP. Việc tổng hợp ATP nói trên được gọi là photphoryl hoá ở mức độ cơ chât vì quá trình photphoryl hoá ADP liên kết với sự phân giải ngoại năng của một phân tử cơ chất cao năng. Một quá trinh tưong tự tạo thành một phân tử ATP thứ hai cũng nhờ photphoryl hoá ờ mức độ cơ chât. Nhóm photphat trên 3-photphorusglycerat được chuyển sang cacbon 2 và 2-photphorusglycerat bị loại nước để tạo thành một phân tử cao năng thứ hai là photphorusenol pyruvat. Phân tử này chuyển nhóm photphat sang ADP tạo thành một ATP thứ hai và pyruvat là sản phẩm cuối cùng của con đường.

160

Giai đoạn 6 carbon Glucose ATP'

ADP Glucose 6-phosphat« Sx-carbon stag * Fructose 6>phosphate

ATP-O ADP Fructos# 1,8-bìsptiosphate Aldolase

Glycera]dehyde-3- [p ] NAỏr— . NADH

+ H'

Three-cartoon [tag *

1^J-bĩsphOiphỂ>glycerate ADP

Substrate-level phosphorylation ATP «*-•'

3-phosphữglycerate

2-phoaphog!yeerflie

I—

H.o

Phosphoenolpyruvate ADP ’—

Substrate-level phosphorylation ATP Pyruvate

Hình Ỉ 7.5: Con đường đường phản. Trong hỉnh là con đường đường phân phân giải glucoz thành Pyruvat. 2 giai đoạn cùa con đường và các sàn phẩm đuợc trình bày ờ đầy. [Theo: Prescott và cs, 2005]. Con đường đường phân phân giải một glucoz thành 2 pyruvat qua chuỗi phản ứng mô tả như trên. ATP và NADH cũng được tạo thành. Sản lượng của ATP và NADH có thể tính được khi xem xét hai chặng riêng rẽ. Trong chặng 6-cacbon hai ATP được dùng để tạo thành fructoz*l ,6-bisphotphat. Vì 2 glyceraldehit-3-photphat xuất hiện từ một glucoz [1 từ dihydroxyaceton-photphat] chặng 3-cacbon tạo thành 4 ATP và 2 NADH từ 1 glucoz. Neu trừ ATP dùng trong chặng 6-cacbon ta sẽ được sản lượng thực là 2 ATP/glucoz. Do đó sự phân giải glucoz thành pyruvat trong đường phân có thể được biểu thị trong phương trinh đơn giản sau:

Glucoz + 2ADP + 2Pi + 2NAD+ -> 2 Pyruvat + 2ATP + 2NADH + 2H+ 17.2.2. C on đường pentoz-photphat [con đường hexo-monophotphat] Con đường này có thể được dùng đồng thời với con đường đường phân và con đường Entner - Doudoroff, diễn ra trong điểu kiện hiếu khí cũng như kỵ khí và có vai trò quan ừọng ữong sinh tổng hợp cũng như trong phân giải. Con đường pentoz-photphat bẳt đầu với việc oxy hoá glucoz-6-photphat thành 6photphorus-glucoznat, tiếp theo là oxy hoá ó-photphorusglucoznat thành ribulo-5-photphat và CO2 {hình 17.6]. NADPH được tạo thành trong các phản ứng oxy hoá nói ừên. Sau đó ribulo-5photphat đuợc chuyển thảnh một hỗn hợp gồm các đường photphat 3 đến 7-cacbon. Hai enzym đặc trưng của con đường đóng vai trò trung tâm ữong những sự chuyển hoá này là: 1] Transketolaz xúc tác chuyển nhóm ketol 2 cacbon và 2] Transaldolaz xúc tác chuyển nhóm 3-cacbon từ sedoheptulo - 7 - photphat với glyceraldehìt-3-photphaí [hình 17.7]. Kết quả chung là 3 glucoz-6-photphat được chuyển thành 2 fructoz-6-photphat, glyceraldehit3-phơtphat và 3 phân tử CƠ 2 theo phưomg trình sau: 3 glucoz-6-photphat + 6NADP+ + 3H 2O -> 2 fructoz-6-photphat + glyceraldehit-3photphat + 3C 02 + 6 NADPH + 6H+ Các chất Ưung gian nói ừên được sử dụng ừong hai con đường. Fructoz-6-photphat có thể được ehuyển trở lại thành glucoz-6-photphat, còn gỉyceraldehit-3-photphat được chuyển thành pyruvat bởi các enzym của đường phân. Glyceraldehit-3-photphat cũng có thể trờ lại con đường pentoz-photphat qua việc tạo thành glucoz-6-photphat. Điều này dẫn đến sự phân giải hoàn toàn glucoz-6-photphat thành CO 2 và tạo thành một lượng lớn NADPH: Gỉucoz-6-photphat + 12NADP+ + 7H20

6 C 02 + 12NADPH + 12H+ + Pi

Con đường pentoz-photphat có một sổ chức năng đị hoá và đổng hoá, chẳng hạn: 1. NADPH từ con đưòng pentoz-photphai được dùng làm nguồn electron cho việc khử các phân tử trọng sinh tổng bợp. . 2. Con đường tổng hợp các đường 4-cacbon yà S-cacbon dung vào một sổ mục đích. Đường 4-cacbon erytro-4-photphat được dùng để tổng hợp các axit Mnin thơm và vitamin B6 [piridoxal]. Ribo-5-phơtphat là thảnh phần chù yếu của các axit nucleic và rìbulo-1,5-diphotphat là chất nhận G 0 2 đầu tiên trong quang bợp. Tuy nhiên; khi một vi sinh vật đang sinh trưởng trên một nguồn cacbon là pentozse, con đường cũng có thể cung cấp eacbori cho việc tổng họp hexoz [glucoz cần cho việc tổng hợp peptiđoglican].

162

Hình ì 7.6: Con đitờng pentoz-photphat. Ở đây, 3 phán tử gỉU C O Z - 6-photphal được chuyển hóa thành 2 fructoz-6-photphat và gỉyceraỉdehií-3-photphat. Fructoz 6-photphat được chuyển hóa trờ lợi thành ghicoz-6'photphat. Gỉyceraỉdehit-3-photphat có thê đitợc chuyên thành Pyruvaỉ hay két họp với ỉ phán từ dihydroxyaceton-phoiphaí [từ gỉyceraldehìt-3-photphat tạo thành ở vòng thứ 2 của con đường] đế sàn ra fructoz-6-photphat. [Theo: Prescott và cs, 2005].

Th« transketoiasB reaction

H — c — OH

/ H c I H “ c — OH I H — C““ OH I H — c — OH

C ^O ©

CHgO 0

Xylulose 5-phosphate

Ribos* 5-phosphate

CHjOH c\ ~ °

HO — c “ H

CI-iOH i c= 0 I HO — c — H I H — Ộ OH H— C - O H I H — c — OH

V H

c — OH I C H ,0 ®

dyceraldehyde 3-phosphate

C H ,O 0 Sadohéptuiosa 7-phosphata

Th« tra n u td « l« M reaction

CHjOH T

c= 0

I HO- C —H I H — C “~ OH H-~C ~ OH H — Ộ — OH I C H p®

\ V

Ĩ H — c — OH I A C H ,0® Glyc«raldehyde 3-phosphati

CH.OH I c “ 0 Ĩ HO — c — H I H—C-O H H “ C — OH

°*

c I

/ H

H— C-OH I H — c — OH

CH,Q© Fructosi 6«phosphat#

Sadohaptulosft 7-phosphat*

Erythrosft 4-phosphat®

Hình 17.7. Transketolaz và transaldolaz. Trong hình ỉà các phán ứng xúc tác bởi 2 enzym này. [Theo: Prescott và cs, 2005].

1. Các chất trung gian trong con đường pentoz-photphat có thể được dùng để tạo thành ATP. Glyceraldehit-3-photphat từ con đường có thể đi vào chặng 3-cacbon cùa con đường đường phân và được chuyển thành ATP và pyruvat. pyruvat cỏ thể bị oxy hoá trong chu trình axit tricacbonxylic đề cung cấp nhiều năng lượng hơn. Ngoài ra, một phần NADPH có thể được chuyển thành NADH để sản ra ATP khi NADH bị oxy hoá trong chuỗi vận chuyển electron. Vì các đường 5-cacbon là nhưng chất trung gian trong con đường đo đó con đường pentoz-photphat có thể được dùng để chuyển hoá pentozse cũng như hexoz.

164

Mặc dù có thể là nguồn năng lượng đối với nhiều vi sinh vật nhưng con đường pentoz-photphat thường có vai trò quan trọng hon trong sinh tổng hợp. Hơn nữa, tuy cả hai con đường đường phân và pentoz - photphat đều sử dụng glucoz-6-P nhưng mức độ hoạt động cùa mỗi con đường tùy thuộc vào trạng thái sinh trưởng của tế bào. Trong giai đoạn sinh trưởng mạnh mẽ nhất 2 con đường được sử dụng với tỉ lệ 2:1 [EM: pentoz-P]. Tuy nhiên khi sinh trưởng chậm lại năng lực sinh tổng hợp cũng giảm theo, đồng thời NADPH cùng như các photphat đường C5 và C4 cần ít hom khiến cho tỉ lệ giữa hai con đường bây giờ trở thành 10:1 thậm chí 20:1. 17.2.3. Con đường Entner-D oudoroff Mặc dù đường phàn là con đường phổ biến nhất dùng chuyển hoá các hexoz thành pyruvat nhưng một con đường khác, tương tự cũng đã được phát hiện. Con đường EntnerDoudoroff mở đầu với các phản ứng chi như con đường pentoz-photphat tức là tạo thành glucoz-6-photphat và 6-photphorus-glucoznat [hình 17.8]. Tuy nhiên, sau đó 6-photphorusglucoznat không bị oxy tiếp mà bị loại nước tạo thành 2-keto-3-deoxy-6photphorusglucoznat [KDPG] là chẩt trung gian chủ yếu ừong con đường này. KDPG sẽ bị phân giải bởi KDPG aldolaz thành Pyruvat và glyceraldehit-3 -photphat. Glyceraìdehit-3-photphat được chuyển thành pyruvat ở phàn cuối của con đường đường phân. Con đường Entner-Doudoroff phân giải glucoz thành pyruvat, 1 ATP, 1 NADH và 1 NADPH.

Glucosfl ■ATP

r - ‘' ADR

CtlLKoss 6>phosptut« 'hỉADPT

N i■ W D P H

6-phosphoglucon.at*

■HjO

2*k

to3-d»oxy-6ptKaphoglLỉConat« Pyruvat®

.................... GÉycsraldBhyde 3-pho^>rtatt •NAlỳ

‘NADH

fc— ADR

f^A T P

^2‘ HCOOH -> C 0 2 + H2

167

0 NADH Lactate

NADH Pyruvate

Acetaldehyde

Ethanoỉ

+ CoASH

0 Oi-Acetolactate

Oxaloacetate NADH

Malate

Fumarate

Acetoac

CO, Succinate

Acetone NADH

T , T , NADHỈ Propionate Isopropanol : V ; I Butanol

Batyrate

Hình ỉ 7.10; Một số quá trình lên men phô biển ở vì sinh vật. Để cho đơn giản ở đây chỉ giới thiệu các quá trình lên men Pyruvat; trên thực tế nhiều phân tử hữu cơ khác cũng có thể được lên men. Hầu hết các quá trình lên men này đã được đơn giản hóa bằng cách loại bỏ 1 hoặc nhiều buớc và các chất trung gian. [Theo: Prescott và cs, 2005]. 1. Vi khuẳn axit lactic [Streptococcus, Lactobacillus, Bacillus]. 2. Nấm men, Zymomonas. 3. Vi khuẩn axit propionic [Propionibacterium]. 4. Enterobacter, Serratia, Bacillus. 5. Vi khuẩn đường ruột [Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Proteus]. 6. Clostridium. 168 k.

Có hai loại lên men fomic. Lên men axit hỗn hợp cho sản phẩm là etanol và một hỗn hợp các axit đặc biệt là axetic, lactic, succinic và fomic [bàng 17.2].Neu fomic hydroliaz có mặt axií íomic sẽ bị phàn giải thành H2 và CO2. Dạng lên men này gặp ở Escherichia, Salmonella, Proteus và một số chi khác. Lên men butandiol đặc trưng ở các chi Enterobacter, Serratia, Erwinia và một số ioài của Bacillus [hình 17.10, số 4]. pyruvat được chuyển hoá thành acetoin, sau đó acetoin bị khử thành 2,3-butandiol với NADH. Một lượng lớn etanol cũng được tạo thành cùng với những lượng nhỏ các axit gặp trong lên men axit hỗn hợp. Bảng 17.1: Các sản phẩm lên men axil hỗn hợp ỞE. colù [Theo: Prescott và cs, 2005] Cân bằng lên men Lên meo

Etanoỉ Axitfomic Axií axeíic Axit lactic Axil succinic co2 H: Butandiol

[jiM sản phẩm/100fjM glucoz] Sinh trưởng axit [pH6]

Sinh trưởng kiềm [pH8]

50 2 36 80 ỉỉ 88 75 0

50 86 39 70 Ỉ5 2 0,5 0

Lên men fomic rất có ích trong việc xác định các cá thể của họ Enterobacteriacme. Các vi khuẩn lên men butandiol có thể được phân biệt với các vi khuẩn lên men axit hỗn hợp ỡ ba điểm sau: 1. Thử nghiệm [test] Voges-Proskauer là một phương pháp so màu dùng phát hiện tiền chất acetoin của butandiol [hình 17.10]. Thử nghiệm này chỉ dương tỉnh với các vi khuẩn lên men butandiol. 2. Các vi khuẩn lên men axit hỗn hợp tạo thành các sản phẩm axit nhiều hơn 4 ỉần các sản phẩm trung tính, trong khi các vi khuẩn lên men butandiol tạo thành các sản phẩm trung tính là chủ yếu. Do đó các vi khuẩn lên men axit hỗn họp axit hoá rất rõ rệt môi trường nuôi cấy. Đây là cơ sở của thử nghiệm đỏ metil [metyl red]. Thử nghiệm là dương tính chi với lên men axit hỗn hợp vì pH giảm xuống dưới 4,4 và màu của chất chi thị chuyển từ vàng sang đỏ.

169

3. CO 2 và H 2 xuất hiện đẳng lượng do hoạt tính của fomic-hydroliaz trong lên men axit hỗn hợp. Các vi khuẩn lẽn men butandíol tạo thảnh dư thừa CO2 và íỉ lệ CO2/H2 xấp xỉ 5:1. Các vi khuẩn lên men fomic đôi khi tạo thành ATP trong việc tái oxy hoá NADH. Chúng sử dụng Acetyl-CoA để tổng hợp Acetyl-photphat sau đó nhóm photphaí này được chuyển đến ADP. Acetyl-CoA + Pi

CoA.SH + Acetyl-P

Acetyl-P + ADP -» Axetat + ATP Các ví sinh vật tiến hành các quá trình lên men khác với các quá trình nói trên. Động vật nguyên sinh và nam thường lên men đường thành lactat, etanol, glyxerol, succinat, format, axetat, butandiol vả các sản phẩm bổ sung.

Hình 17.11: Phản ứng Stickland. Âỉanin bị oxy hóo thành axetat và glixin được dùng đè oxy hóa lợi NADH sàn ra trong sự phân giai alanin. Lên men cũng tạo [hành A TP. [Theo: Prescott Vđ cs 2005].

170

Các chất không phải đường cũng được lên men bởi vi sinh vật. Chẳng hạn, một số loài cùa chi Clostridium thường lên men các hỗn hạp axit amin. Các Clostridia phân giải protein như các vi khuẩn gây bệnh. c. sporogens và

botuỉinum thực hiện phản ứng

Stickland trong đó một axit amin bị oxy hoá trong khi một axit amin thứ hai tác đụng như chất nhận electron. Phản ứng Stickland điển hình là phàn ứng trong đó alanin bị oxy hoá và glixin bị khử để tạo thành axetat, CO2 và NH3. ATP được sản ra từ Acetyl - p nhờ photphoryl hoá ở mức độ cơ chất và kiểu lên men này rất thích hợp cho các vi khuẩn khi sinh trưởng trong môi trường kỵ khí giàu protein. Phản ứng Stickland được dùng để oxy hoá một số axit amin như: alanin, leuxin, isoleuxin, valine, phenylalanin, tryptophan và histamin. Các axit amin khác như glicine, glutamat, threonine, arginine và cả alanin cũng được vi khuẩn lên men nhưng theo cơ chế khác. Ngoài đường và axit amin các axit hữu cơ như axetat, ỉactat, propionat và xitrat cũng được lên men. Một sổ quá trình lên men nói ưên có ý nghĩa rất quan ừọng ừong thực tế chẩng hạn xitrat cỏ thể được chuyền thành diacetyl tạo cho sữa lên men hương vị thơm ngon. 17.4. CHU TRÌNH AXIT TRICACBONXYLIC Mặc dù một phần năng lượng có thể thu được từ sự phân giải glucoz thành pyruvat qua các con đường nói trên nhưng phần lớn năng lượng lại được giải phóng khi pyruvat bị phân giải hiếu khí thành CO2 trong giai đoạn 3 của sự đị hoá. Phức hợp đa enzym pyruvat dehiưogenaz trước hết oxy hoá pyruvat thành CO2 và acetyl - CoA cũng là một phân tử cao năng bao gồm coenzym A và axit axetic nối với nhau qua liên kết cao năng tiol este [hình ỉ 7.ỉ 2], Acetyl-CoA xuất hiện từ sự phân giải của nhiều hidrat cacbon, lipit và các axit amin [hình 17.3] có thể bị phân giải tiếp trong chu trình Axit trícacbonxylic [TCA] hoặc cững gọi là chu trình Krebs. Cơ chất đối với chu trình TCA là Acetyl-CoA [hỉnh 17.12]. Khi xem xét chu trình này ta cần chú ý đến các chất trung gian, các sản phẩm và hoá học cùa mỗi chặng. Trong phản ứng thứ nhất Acetyl-CoA kết hợp với Oxaloaxetat [chất trung gian 4C] thành xitrat và mở đầu chặng 6C. Xitrat [chứa 3 gổc COOH] được sắp xếp lại tạo thành izoxitrat. Sau đó izoxitrat bị oxy hoá và loại carboxyl hai lần sản ra D-ketoglutarat rồi succinyl-CoA. Ở chặng này 2NADH được tạo thành và 2C bị tách khỏi chu trình như CO2 [Chủ ý: Ở vi khuẩn phản ứng izoxitrat —> a-ketoglutarat sử đụng NADP+]. Vì 2C được bổ sung ở dạng Acetyl-CoA lúc ban đầu nên cân bằng dược duy trì và không có cacbon nào bị mất. Bây giờ chu trình đi vào giai đoạn 4C trong đó qua hai bước oxy hoá xuất hiện một FADH2 và một NADH. Ngoài ra, GTP [một phân tử cao năng tương đương ATP] được tạo thành từ succinyl-CoA nhờ photphoryl hoá ờ mức độ cơ chất. Cuối cùng

oxaĩoaxetat được tái tạo và sẵn sàng kết hợp với một phân tử acetyl-CoA khác. Từ hình 17.12 nhận thấy chu trình TCA sản ra 2 C 0 2, 3 NADH, 1 FADH2 và 1GTP đối với mồi phân từ Acetyl-CoA bị oxy hoá. pyruvate

' CoA NAD' 'V*-NADH + H' ,

S^CỌ,

Hình ỉ 7.12: Chu trình axỉt tricacbonxyĩic. Chu trình có thể được chia thành 3 giai đoạn dựa vào sổ ỉuợng các chất trung gian. 3 giai đoạn được tách riêng bởi 2 phàn ímg loại carboxyl, [phàn ứng trong đó nhóm carboxyl bị mất đi ở dạng CO2] Phức hệ pyruvat-dehitrogenaz tạo thành Acetyl-CoA qua oxy hóa Pyruvat. [Theo: Prescoti và cs, 2005].

Đứng về mặt chức năng có thể xem chu trình TCA là con đường oxy hoá AcetylCoA thành CO2. Ở đây, bước đầu tiên là việc gắn nhóm acetyl vào chất mang acetyl tức là oxaloaxetat để tạo thành xitrat. Bước thứ hai bắí đầu vói xitrat và kết thúc với việc tạo thành succinyl-CoA. Ở đây, phần mang acetyl của xitrat mất đi 2C khi bị oxy hoá để cho 2 CO 2. Bước thứ ba và bước cuối cùng chuyển succinyl-CoA ừở lại oxal-axetat [chất mang acetyl] rồi chất này lại kết hợp với một nhóm acetyl khác. Các enzym của chu trình TCA gặp phổ biến trong vi sinh vật. Chu trình hoàn toàn hoạt động ở nhiều vi khuẩn hiếu khí, động vật nguyên sinh sống tự do, hầu hết tào và nấm.

Điều này là dễ hiểu vì chu trình là nguồn năng lượng rất quan trọng. Tuy nhiên, E. colì kị khí không bắt buộc không sử dụng chu trình đầy đù trong điều kiện kị khí hay khi nồng độ glucoz cao nhưng sử dụng chu trình đầy đủ trong những trường hợp khác. Mặc dù thiếu chu trình hoàn chình nhưng E. coỉi thường vẫn có hầu hết các enzym cùa TCA vì một trong các chức năng chù yéu của chu trình này là cung cấp bộ khung cacbon dùng cho sinh tổng hợp. 17.5. S ự VẬN CHUYẺN ELECTRON VÀ PHOTPHORYL HÓA OXY HÓA Khi một phân tử glucoz bị oxy hoá thành 6 phân tử CO2 qua con đường đường phân và chu trình TCA chỉ khoảng 4 phân tử ATP được tạo thành, còn hầu hết ATP thu được là từ sự oxy hoá NADH và FADH2 ừong chuồi vận chuyền electron. 17.5.1. Chuỗi vận chuyển electron Chuỗi vận chuyển electron được nghiên cứu kỹ nhất là chuỗi ở ty thể. Chuỗi bao gồm một dãy các chất mang electron hoạt động phối hợp với nhau để vận chuyển electron từ các chất cho như NADH và FADH2 tới các chất nhận như O2 {hình ỉ 7. ỉ 3]. -0.4

F&S

-0.3 -NADH

Phửc hệ I

FMN FeS -

0.2

0.1

tí i

+0.2

+0.3

FeS

■Succin°

_ ^ CoQ s

Phức hệ III CytbH

Phức hệ II

Hình Ị 7.16: Các chuỗi vận chuyển electron ở Paracoccus denitnficans. [a] Chuỗi vận chuyển hiểu khi chi với chuỗi vận chuyển electron ở ty thể và sứ dụng oxy ỉà chất nhận electron. Metano/ vỏ metiỉamin cũng cổ thế chuyển electron cho Cytocrom c. [b] Chuỗi vận chvỵển kị khỉ phàn nhánh mợnh mẽ được thực hiện bời cà các protein cùa màng và các protein chu chat. Nitrat bị khử thành nitơphân từ nhờ tác dụng phối hợp của 4 reductaz khác nhau tiếp nhận các electron từ CoQ và xừ.c. Vị tri di chuyền cùa proton được chi rô nhimg số hrợng proton bao gồm thì còn chưa chắc chắn. Ghi chú: FP- flavoprotein; MD = ĩũ£ỉat\ol-dehừrogenaz; Nar = nitrat reductaz; Nir = nitrit reductaz; Nor - oxỉt nitric reductaz; Nos = oxit nitrơ reduciaz. [Theo: Prescott và cs, 2005]. ' Phức hợp Cytocrom aa3 không hoạt động. Các electron từ Cytocrom c của chuồi được chuyển tới nitrit oxyd nitric - và oxyd nitro reductaz. Nitrat reductaz nhận elecưon từ CoQ. Số lượng proton tách khỏi màng sấp xếp theo kiểu này là không lớn nhưng nhờ vậy vi khuẩn có khả nàng sinh trưởng kỵ khỉ. 177

17.5.2. Photphoryỉ hoá oxy hoá Mặc dù đã được nghiên cứu tích cực trong nhiều năm nhưng chỉ gần đây cơ chế của photphoryl hoả oxy hoá mới được chấp nhận rộng rãi theo giả thuyết hoá thâm thấu [chemiosmosis] do nhà sinh hoá người Anh Peter Mitchell đề xuất đầu tiên vào năm 1951. Khoang trong màng 4H+

4H+

2H+

3H+

AD P + P j

ị

ATP

air Hình ỉ 7. ỉ 7: Hỏa thẩm thấu. Sơ đồ già thuyết hóa thâm thấu áp dụng cho chức năng của tv thê. Dòng electron từ NADH tới oxỵ tạo điểu kiện cho các proton dì chuyển từ chất nền [matrix] ty thẻ tới khoang giữa cúc màng. Ke! quả là sự xuất hiện của các gradien proton và gradiert điện tích. Khỉ các proton chuyến trờ lại chất nền qua phức hợp F ịF0 F ị sẽ tổng hợp A TP. Ở vi khuẩn quá trình diềrt ra hỉơng tự nhimg các proton di chuyển từ tế bào chất đến chu chất. [Theo: Prescott và cs, 2005].

Theo giả thuyết này chuỗi vận chuyển electron được sắp xếp sao cho các proton được đẩy từ chẩt nền ty thể ra phía ngoài, còn các electron thì được vận chuyển bên trong chuỗi {hình 17.Ỉ7]. Sự di chuyển của proton cỏ thể xuất phát từ các núm [loop] của chất mang [hình ỉ 7. ỉ 4] hay từ tác dụng của các bơm proton đặc biệt thu được năng lượng nhờ sự vận chuyển electron. Kết quả ỉà xuất hiện một động lực proton [proton motive force, PMF] bao gồm một gradien proton và một thế hiệu màng đo sự phân bổ không đều của điện tích. Khi các proton di chuyển trở lại chất nền ty thể nhờ PMF ATP sẽ được tổng hợp ngược chiều với phản ứng thuỷ phân ATP [hình ĩ 7. ỉ 7].

178 à

Ở vi khuẩn cũng diễn ra quá trình tương tự: dỏng electron tạo điều kiện cho các proton di chuyển ra phía ngoài qua màng sinh chất [hình Ì7.15 và 17.16] sau đó ATP được tổng hợp khi các proton này khuếch tán trở lại tế bào. PMF cùng có thể hướng dẫn vận chuyển các phân tử qua màng cũng như sự quay của tiên mao nghĩa là đỏng vai trò trung tâm trong sinh lý học của vi khuẩn [hình ỉ 7. ỉ 8]. Giả thuyết hoá thẩm thấu đuợc chấp nhận bởi hầu hểt các nhà vi sinh vật học. Việc tạo thành gradien proton và gradien điện tích qua màng dã được chứng minh rõ rệt. Tuy nhiên, chứng cớ gradien proton là động lực trực tiếp của photphoryl hoá oxy hoá vẫn chưa được khẳng định. Ở một số vi khuẩn biển ưa mặn các ion natri có thể được dùng để hướng dẫn tổng hợp ATP.

Quang họp

Vận chuyển electron Dộng lực proton Y Electron transport

Photosynthesis

Sự quay của tiên mao vi khuân

ADR + P:i '"v— ATP

Bacterial tlagôHa rotation

Vận chuyển chủ động

Active

transport

Hình ] 7. ỉ 8: Vai trò trung tâm của động lực proton {Proton Motive Force].

Catĩ chú ỷ rằng việc vận chuvên chủ động khôngphài bao giờ củng được hưởng dân bởi PMF. [Theo: Prescott và cs, 2005].

179

ềầ

Cytoplasm

/yyKKy>

Energy

ATP

[>]

Hình 17.19: cấu trúc và chức năng cùa A TP-synthaz. [a] Các đặc tỉnh cẩu trúc chủ yếu của ATP-synthaz. FỊ là cấu trúc hình cầu bao gồm chù yếu là các duới-đơn vị luôn phiên a và P; 3 vị trí hoạt động nằm trên các dưới-đơn vị p. Dưới đơn vị y kéo dài lên trên qua trung tâm cùa cẩu trúc hình cầu và cỏ thể quay. Phần cuống [các dưới đơn vị Y và £] nối hình cấu với F0; Fỹ là phức hợp bên trong màng đóng vai trò như ỉ kênh proton. Fq chứa Ị dịtởi đơn vị a, 2 dưới đơn vị b vờ 9-Ị2 dưới đơn vị c. Nhánh stato bao gồm ditới đơn vị a, 2 chfới đơn vị b và dưới đơn vị ỗ; nhảnh síaio nằm trong màng và gắn với F/. Một vòng các dưới đơn vị c trong Fq được nổi với cuổng vò có thể tác dụng như 1 roto và chuyền động qua I ditởi đơn vị cùa stato. Khi vòng dtiới đơn vị c quay nỏ sẽ làm quay trục [các dưới đơn vị Y £]■ [b] Sơ đồ tổng hợp ATP theo cơ chế liên kết thay đổi trong đó [hể cầu F ỉ được nhìn từ phía màng. 3 vị trí hoạt động có thể tồn tại ờ 3 hỉnh thể khác nhau: ỉ hình thể mở, bất hoạt [O] với ái ỉực thấp đối với cơ chất và ỉ hình thể L bất hoạt có ái lực khả lỏng lẻo đối với cơ chất và Ị hình thể chột hoạt động [T] cỏ ái lực cao đối với cơ chất. Trong bước đầu tiền ADP và Pỉ gắn vào vị trí o. Tiểp theo dưới đơn vị ỵ quay Ỉ2Ơ1nhờ năng luợng có ỉẽ từ dòng proton di chuyến qua Fa. Sự quay này gây ra những thay đổi hình thề trong tất cà 3 dưới đơn vị dẫn đến việc giải phóng ra ATP mới được tạo thành và việc chuyển hỏa vị trí L thành ỉ hình thể T hoạt động. Cuối cùng ATP được tồng hợp ờ vị trí Tmới trong khi ADP và Pi lọi được liên kết vào vị trí o còn trổng và mọi việc lại sẵn sàng cho sự quay tiếp cùa dưới đơn vị y hướng dẫn nhờ năng luợng. [Theo: Prescott và cs, 2005]. 180

Dù cơ chế nào là chính xác, việc tồng hợp ATP đều diễn ra trên F]Fo ATPaz hoặc ATP-synthaz {hình 17.19]. Thành phần Fi ở ty thể có cấu trúc hình cầu gắn vào bề mặt màng bên trong ty thể bởi một cuống, còn thành phần Fo đuợc lắp vào màng. FlFo - ATPaz ở ví khuẩn lại nằm ở bề mặt bên trong của màng sinh chất. Fo tham gia vào việc di chuyển của proton qua màng và việc di chuyển này qua một rãnh trong F0 có thể dùng để hướng dẫn photphoryl hoá oxy hoá. Fi là một phức hợp lớn chứa 3 dưới - đom vị a luân phiên với 3 dưới - đơn vị Ịỉ. Dưới - đơn vị 7 kéo dài từ phức hợp 03]83 xuống phía dưới. Duới - đơn vị nảy bao gồm một phần cùa cuống và tương tác với Fo- Dưới - đơn vị ô cùng nàm ở phần cuống. Phần lớn dưới - đơn vị 7 gặp ở trung tâm của Fi được bao quanh bởi các dưới - đom vị a và p. Dưới - đơn vị xquay nhanh theo hướng trái chiều kim đồng hồ bên trong phức hợp Ọ3& tựa như trục quay ô tô và gây ra những thay đổi hình thể hướng dẫn tổng hợp ATP ở các vị trí hoạt động trên các dưới - đơn vị p [hình Ỉ7.19b]. Do đó ATP - synthaz là một động cơ quay nhỏ nhất hiện biết, nhỏ hơn nhiều so với tiên mạo vi khuẩn. Ở nồng độ đủ cao nhiều hoá chất kìm hãm tổng hợp ATP trong điều kiện hiếu khí và thậm chỉ có thể giết chết tế bào. Các chất kìm hãm này, nói chung, có thể được phân thành hai loại. Một số ngăn cản trực tiếp việc vận chuyển electron. Chất kháng sinh pierixidin cạnh tranh với CoQ; chất kháng sinh antimixin A cản trở việc vận chuyển electron giữa các Cytocrom b và c; xianit vả azit làm ngừng việc vận chuyển electron giữa Cytocrom a và O2 do chúng cỏ cấu trúc tương tự với O2. Một nhóm chất kìm hãm khác gọi là chất cách li [uncoupler] cỏ tác dụng đình chi tổng hợp ATP nhưng không ức chế việc vận chuyển electron. Trên thực tế, các chất cách li cũng có thể nâng cao tốc độ di chuyển của electron. Thông thường, sự vận chuyển electron liên kết chặt chẽ với photphoryl hoá oxy hoá sao cho tốc độ tổng hợp ATP điều hoà tốc độ vận chuyển electron. Tổng họp ATP trong photphoryl hoá oxy hoá diễn ra càng nhanh thi chuỗi vận chuyển electron hoạt động để cung cấp năng lượng cần thiết cũng càng nhanh. Các chất cách li tách riêng photphoryl hoá oxy hoá khỏi vận chuyển electron. Vì vậy, năng lượng do chuỗi thải ra sẽ ở dạng nhiệt chứ không phải ATP. Nhiều chất cách ỉi như dinitrophenol và valineomixin có thể cho phép các ion H+, K+ và các ion khác qua màng mà không hoạt hoá FiFo-ATPaz. Kết quà là các gradien pH và ion bị phả huỷ. Valineomixin cũng có thể liên kết trực tiếp với FjFo-ATPaz vả kỉm hâm hoạt tính của enzym này. 17.5.3. Sản lượng của ATP trong đường phân và hô hấp hiếu kbí Sán lượng cực đại của ATP ở các sinh vật nhân thật trong quá trình đường phân, chu trình TCA và vận chuyển electron cỏ thể được tính toán dễ đàng. Sự chuyển hoá glucoz thành 2 pyruvat trong đường phân cho 2NADH và 2 ATP. Vì 1 NADH ở tế bào chất có thể

sản ra cực đại 2-3 ATP trong vận chuyển electron và photphory] hoá oxy hoá [ti lệ p /o - 2 hoặc 3], tổng sản lượng ATP khi có mặt O 2 của con đường phân là 6-8 phân từ. Bảng 17.2: Sản iuợngATP từ sự oxy hóa glucoz ở tế bào nhân thật. [Theo: Prescott và cs, 2005] Con đường đường phân Photphoryl hóa ờ mức độ cơ chất [ATP] Photphoryl hóa oxy hóa với 2NADH

2ATP 4-6ATP

2Pyruvat thành 2Acetyl-CoA Photphoryl hóa oxý hóa với 2NADH

6ATP

Chu trình TCA Photphoryl hóa ờ mức độ cơ chất [GTP] Photphoryl hỏa oxy hóa với 6NADH Photphơryl hỏa oxy hỏa với 2FADH2

2ATP 18ATP 4ATP

Tổng sàn lượng hiếu khí

36-38ATP

a/ Sản lượng ATP được tính với ti lệ p/o được thừa nhận là 3 đối vói NADH và 2 đối với f a d h 2.

b/ Sản lượng ATP đirợc tính tùy thuộc vào việc các electron của NADH đi vào ty thể như thế nao. Khi O 2 có mặt và chuỗi vận chuyển electron hoạt động pyruvat sẽ bị oxy hoá tiếp thành Acetyl-CoA tức cơ chất cho chu trình TCA. Phàn ửng này sản ra 2NADH vì 2 pyruvat xuất hiện từ một glucoz, đo đó 6ATP nữa được tạo thành. Việc oxy hoá một phân tử Acetyl-CoA trong chu trình TCA sản ra 1GTP [hoặc ATP], 3NADH và IFADH 2 nghĩa là nếu 2 phân tử Acetyl - CoA bị oxy hoá trong chu trình trên thì sẽ xuất hiện 2GTP [ATP], 6NADH và 2 FADH2. Theo bảng 17.2 việc oxy hoá NADH và FADH2 trong chu trình thông qua chuỗi vận chuyển electron sẽ cung cấp tối đa là 38ATP. Tuy nhiên, nhừng tính toán được tóm tát và trình bày ờ bảng 17.2 chỉ là lý thuyết và dựa vào tỉ lệ p /o [số lượng ATP tạo thành khi một nguyên tử oxy bị khử bởi 2 elecữon trong sự vận chuyển electron] là 3 đối với việc oxy hoá NADH và 2 đổi với việc oxy hoá FADH2. Trên thực tế tỉ lệ p /o có lẽ vào khoảng 2,5 đối với NADH và 1,5 đối với FADH2. Như vậy tổng sản lượng ATP trong điều kiện hiếu khí cỏ thể xấp xỉ chỉ 30 hơn là 38ATP. Vì các hệ thống vận chuyển electron ở vi khuẩn thường có tỉ lệ p /o thấp hơn hệ thống ở ty thể nên sản lượng ATP ở vi khuẩn trong điều kiện hiếu khí có thể ít hơn. Chẳng hạn, E. coỉi với chuỗi vận chuyển electron ngắn có tỉ lệ p /o khoảng 1,3 khi sừ dụng nhánh cytocrom bo ở nồng độ oxy cao và chỉ 0,67 khi sử dụng nhánh Cytocrom bđ [hình 17.15] ở nồng độ oxy thấp. Trong trường hợp này việc tạo thành ATP thay đổi tuỳ theo điều kiện 182

môi truờng. Có ỉẽ vì thường sổng ở những nơi như đường ruột rất giàu chất dinh dường mà E. coỉi không cần phải tổng hợp ATP thật hiệu quả. Chuỗi vận chuyển electron chỉ hoạt động khi E. coỉi sống trong mõi trường nước ngọt, hiếu khí giữa các vật chủ. Rõ ràng, hô hấp hiếu khí hiệu quả hơn rất nhiều so với các quá trình kỵ khí không bao gồm sự vận chuyển electron và photphoryỉ hoá oxy hoá. Chẳng hạn, dưới điều kiện kỵ khí khi NADH không bị oxy hoá bởi chuỗi vận chuyển electron chì 2ATP được tạo thành trong sự phân giải glucoz thành pyruvat. Khi chuyển từ điều kiện kỵ khí sang điều kiện hiểu khí nhiều vi sinh vật giảm mạnh mẽ tốc độ phân giải đường và chuyển sang hô hấp hiếu khí. Đây là một hiện tượng điểu chỉnh được gọi là hiệu ứng Pasteur. Hiệu ứng này có lợi rò ràng cho vi sinh vật vì chỉ cần phân giải một lượng đường ít hơn mà vẫn thu được sàn lượng ATP như nhau do quá trinh hiếu khí đem lại hiệu quả hơn. 17.6. HÔ HÁP KỴ KHÍ

Các electron dẫn xuất từ đường và các phân tử hữu cơ khác thường được chuyển cho các chất nhận electron hữu cơ nội sinh hoặc cho Ơ2 thông qua chuỗi vận chuyển electron [hình 17.2]. Tuy nhiên nhiều vi khuẩn có các chuỗi vận chuyển hoạt động với các chất nhận electron từ bên ngoài khác O2. Quá trình sản sinh năng lượng này được gọi là hô hấp kỵ khí. Các chất nhận electron chủ yếu là nitrat, sulfat và CO2 nhưng các kim loại và một số phân tử hữu cơ cũng có thể bị khử {bảng ỉ 7.3]. Bảng 17.3: Mội sổ chất nhận electron được đùng trong hô hấp. [Theo: Prescott và cs, 2005] Chất nhận electron

Các săn phẩm khử

Các vi sinh vật dùng làm ví dụ

Hỉếu khí

h 20

Tất cả các vi khuẩn hiếu khí, nấm, động vật nguyên sinh vả tảo

Kỵ khí

N 03*

NCV

Vi khuẩn đường ruột

NCV SO42' C02 s° Fe3+ HAs0 42'

n o 2\ n 2o, n 2 h 2s CH< H-.S Fev HAs02

Pseudomonas, Bacillus,Paracoccus Desulfovibrio và Desulfotomacuium Tất cà các vi khuẩn sinh metan Desulfuaomonas và Thermoproteus Pseudomonas, Bacillus, và Geobacter Bacillus, Desulfotomaculum, Sulfuaospirillum

Se042‘ Fumarat

Se, HSe023‘ Succinat

Aeromonas, Bacillus, Thauera Wolinella

183

Một số vi khuẩn có thể sừ dụng nitrat làm chất nhận electron và tông hợp ATP. Quá trình này thường được gọi là sự khử nitrat dị hoá [dissimilatory nitrat reduction]. Nitrat có thể bị khử thành nitrit bởi nitrat - reductaz là enzym thay thế Cytocrom-oxydaz. N 0 3'+ 2e + 2H+ -+ NO 2 +H2O Tuy nhiên sự khử nitrat thành nitrit không phải là con đuèmg thu nhận ATP có hiệu lực vì để sinh trường vi khuẩn cần một lượng lớn nitrat [1 phân tử nitrat chỉ nhận 2 electron]. Nitrit tạo thành lại rất độc. Vì vậy niírat thường bị khử tiếp thành N 2 trong quá trình gọi là phản nitrat hóa [denitrification]. Mỗi nitrat sẽ nhận 5e và sản phâưi sẽ là không độc: 2 NO 3' + 10e + 12H+ -> N 2 + 6H 2O Phản nitrat hoá là một quá trình nhiều bước bao gồm 4 enzym tham gia: nitrat-, nitrit, oxit nitric- và oxit niươ-reductaz: N 0 3'-> N 0 2‘ -> NO -> N20 ->N 2 Đáng chủ ý, một ừong các chất trung gian là oxit nitric [NO]. Ở động vật có vú NO tác dụng như một chất dẫn truyền thần kinh đóng vai trò điều chỉnh huyết áp và được các đại thực bào sử dụng để tiêu diệt vi khuẩn cũng như các tế bào u. Ỏ vi khuẩn có hai loại nitrit reductaz xúc tác sự tạo thành NO: một loại chứa các Cytocrom c và di [ở Paracoccus và Pseudomonas aeruginosa] và một loại là protein chứa đồng [ở Alcaỉigens]. Ở vi khuẩn Gram âm nitrit reductaz có lẽ nằm trong chu chất. Oxit nitric reductaz xúc tác việc tạo thành oxit nitrơ từ NO và là một phức hợp Cytocrom bc gắn vào màng. Phản nitrat được nghiên cứu kỳ ở vi khuẩn đất, gram âm Paracoccus denitrifìcans\ vi khuẩn này có khà năng khử nitrat thành N 2 trong điều kiện kỵ khí. Chuỗi vận chuyển elecừon ở chúng chứa nitrat - reductaz và oxit nitric - reductaz gan vào màng còn nitrit reductaz và oxit nitrơ re d u c ta z thì tồ n tại tro n g chu c h ấ t {hình Ỉ 7 . ì 6 b ] . 4 e n zy m sử d ụ n g các e le c tro n từ C o Q và

các Cytocrom typ c để khử nitrat và sản ra PMF. Phản nitrat hoá gặp ở một số loài thuộc các chi Pseudomonas, Paracoccus và Bacillus. Chúng sử đụng con đường này thay cho hô hấp hiếu khí bình thường và có thể được xem là các vi khuẩn kỵ khí tuỳ tiện. Khi O2 có mặt chúng thực hiện hô hấp hiểu khí [tổng hợp nitrat reductaz bị kịềm chế bởi O2]. Trong đất kỵ khí phản ứng niừat hoá dẫn đến sự mất nitơ của đất vả ảnh hưởng xấu đến độ phì của đất. Hai nhóm vi khuẩn chủ yếu khác sử dụng hô hấp kỵ khí là các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc. Bọn sử dụng CO2 hoặc cacbonat làm chất nhận electron tận củng được gọi là các vi khuẩn sinh metan vì chủng khử C 0 2 thành metan [CHẠ Sulfat cũng có thể đóng vai trò như chất nhận electron tận cùng ờ vi khuẩn Desulfovibrio. Sulfat bị khử thành sulfua [S2" hoặc H 2S] và 8 electron được tiếp nhận.

S 0 42' + 8 e + 8 H+ -> s 2' + 4H20 So với hô hấp hiếu khí - hô hấp kỵ khí kém hiệu quả hơn trong việc tổng hợp ATP nghĩa là việc photphoryl hoá oxy hoá vói các chất nhận electron tận cùng là nitrat, sulfat hoặc CO2 cho ít ATP hơn. Sàn lượng ATP giảm đì bắt nguồn từ chỗ các chất nhận electron nói trên có thể khử kém dương hơn so với O2 . Sự khác nhau trong thế khử giữa chất cho như NADH và nitrat lả nhỏ hơn sự khác nhau giữa NADH và O2 . Vì sản lượng năng lượng trực tiếp liên quan với độ lớn của sự khác nhau trong thế khử nên ít năng lượng hơn được cung cấp cho việc tạo thành ATP trong hô hấp kỵ khí. Tuy nhiên hô hấp kỵ khí là có ích vì có hiệu quả hơn lên men và cho phép tổng hợp ATP nhờ vận chuyển electron và photphoryl hoá oxy hoá ừong điều kiện vắng mặt O2 . Hô hấp kỵ khí chiếm ưu thế trong các đất và các bùn kỵ khỉ. Thường ta quan sát sự kế tiếp của các vi sinh vật trong một môi trường khi có mặt một số chất nhận electron. Chẳng hạn, nếu trong môi trường đặc biệt tồn tại O2 , nitrat, ion mangan, ion feưic [Fe3+], sulfat và CO2 ta sẽ thấy diễn ra thứ tự dự đoán của việc sử dụng chất nhận elecứon khi có mặt một cơ chất có thể oxy hoá thích hợp với chùng [population] vi sinh vật. Oxy được sử dụng truớc tiên như một chất nhận electron vì nỏ kìm hâm việc sử dụng nitrat bởi các vi sinh vật có khả năng hô hẩp với O2 cũng như với nitrat. Khi O2 có mặt các vi khuẩn khử sulfat và vi khuẩn sinh metan bị kim hãm vì chúng là bọn kỵ khí bắt buộc. Một khi O2 và nitrat bị cạn kiệt và các sản phẩm lên men, kể cả hydro, được tích luỹ thi sẽ bắt đầu diễn ra sự cạnh ừanh sử dụng các chất nhận electron khác. Mangan và sắt sẽ được sử dụng đầu tiên, tiếp theo là sự tranh giành giữa vi khuẩn sử đụng sulfat và vi khuẩn sinh metan. Sự cạnh tranh chịu ảnh hưởng bởi sản lượng năng lượng lớn hơn thu được với sulfat là chất nhận electron. Cũng quan trọng là sự khác nhau trong ái lực cùa enzym đổi với hydro vì đây là cơ chẩt phổ biến của cả hai nhỏm vi khuẩn. Vi khuẩn khử sulfat Desulfovibrio sinh trưởng nhanh và sử dụng hydro sẵn có với tốc độ nhanh hơn Metanobacterium. Khí sulfat cạn kiện Desulfovibrio không oxy hoả hydro nữa và nồng độ hydro tăng lên. Cuối cùng vi khuẩn sinh metan chiếm ưu thế và khử CO2 thành CH4 . 17.7. S ự PHÂN GIẢI CÁC HIDRAT CACBON VÀ CÁC POLYME D ự TRỮ NỘI BÀO Ngoài glucoz vi sinh vật có thể phân giải nhiều loại hidrat cacbon. Các hidrat cacbon cỏ thể bắt nguồn từ bên ngoài tế bảo hay từ những nguồn nội bào. Cảc bước mở đầu trong sự phân giải các hidrat cacbon từ bên ngoài thường khác với các bước mở đầu sử dụng với các polyme dự trữ nội bào.

185

17.7.1. Các hidrat cacbon Một số con đường phân giải các monoxaccarit [đường đem] như glucoz-, fructoz-, manno- và galactoz được trình bày ở hình ỉ 7.20. Ba đường đơn đầu tiên được photphoryl hoá nhờ ATP và dễ dàng đi vào con đường đường phân. Trái lại, galactoz, sau phản ứng photphoryl hoá mờ đầu phải được chuyển thành uridin diphotphat galactoz rỗi trong một quá trinh 3 bước được chuyển thành glucoz-6 -photphat [hỉnh 17,20]. Monosaccharide intercứnvarsions

Gaỉactose

ỊÃn* Galactcse-1- [p ]

ịuTP UDP galactose J glucose . UDP

Mamott

Glucosa

^S^G aM - ®

UDP Gal Glucose-1-[£]

AĨP

Glucosỡ-6- [p ]

Fructostì-S- [p]

ATP

^Mannosộ-6-® ATP

ị Glycolytic pathway Disaccharidô ci*avaQ& mattase 2 glucose 1. Maltoss f ạ o „ maltos# phosDhorylasíL * + p — -- p-o-glucos&-1 -[p]+ glucose

ATx

_ Mrtlobỉose phosphorylasô 2. CollobtDm I|+P|'---► ~-o-gkicos#-1-CP;+ glucose ,, A Slicra&a

3. Sucm se + H jO -Sucrcso

» gtuco«s+fruclo»&

:+ p, _iH£S¥££ÍL«E!ĩ£DdSV

- ® * tructo» .

Lactina + H,0 —0-gafactoãđas& —*» galactose + glucose

Hình ỉ 7.20: Sự phân giải hydrat cacbon. Trong hình là những vi dụ vê các enzym và các con đường dùng phân giải dixaccarit và monoxaccarit. [Theo: Prescott và cs, 2005].

Các dixaccarit thông thường bị phân giải thành các monoxaccarit bởi ít nhất hai cơ chế {hình 17.20]. Malto-, saccaro- và lactoz có thể bị thủy phân trực tiếp thành các đưcmg đơn. Nhiều dixaccarit như malto-, xenlobio- và saccaroz cùng bị phân giải bởi sự tấn công của nhánh photphat trên liên kết nối giữa hai đường; quá trình này được gọi là phân giải nhờ photphat hay gọi tắt là lân phân [photphorolysis]. Cũng như các dìxaccarit các polixaccarit bị phân giải bời cả íhuỷ phân và lân phân. Vi khuẩn vả nấm phân giải các polixaccarit ngoại bảo nhờ tiết ra các enzym thuỷ phân phân giải các polixaccarit thành các phàn tử nhỏ hơn, sau đó các phân tử này được đồng hoá. Tinh bột vả glycogen bị thuỷ phân bởi amilaz thành glucoz, mantoz và các sản phẩm khác. Xenluloz khó bị phân giải horn; nhiều nấm và một số vi khuẩn [vi khuẩn trượt, Clostridia và các xạ khuẩn] tổng hợp xenlulaz thuỷ phân xenluloz thành xenlobioz và glucoz. Một số loại thuộc chi Cytophaga phân lập từ biển cỏ khả năng tiết ra enzym agaraz phân giài thạch. Nhiều vi khuẩn đẩt và vi khuẩn gây bệnh thực vật tổng hợp enzym phân giải pectin là polyme của axit galacturonic [một dẫn xuất của galactoz], axit này là một thành phần quan trọng của mô và thành tể bào thực vật. Đáng chú ý, vi sinh vật cũng có khà riẫng phân giải các chất lạ [xenobiotic] rất bền vững. Đây không phải là các chất do sinh vật tổng hợp mà là do con người tạo Ta. Chẳng hạn các chất trừ sinh vật hại [pesticides] và các hợp chất thom khác nhau. Nhờ sử dụng các enzym và các con đường đặc biệt vi sinh vật chuyển hoá các chất này thành các chất trung gian trao đổi chất bình thường sau đó tiếp tục phân giải theo con đường thông thường. Phanerochaete chrysosporíum là một loài nấm đặc biệt có khả năng phân giải các chất lạ. 17.7.2. Các poỉyme dự trữ Vi sinh vật thường phải sống từng thời gian dài trong điều kiện thiếu vắng chất dinh dưỡng từ bên ngoải. Trong hoàn cảnh như vậy chúng phải tiến hành phân giải các chất dự trữ nội bào như glycogen, tinh bột, poli-/3-hydroxybutyrat... Glycogen vả tinh bột bị phân giải nhờ các enzym photphorylaz. Enzym này xúc tác phản ứng lân phận dẫn tới làm ngắn chuỗi polixaccarit một glucoz và sản ra gIucoz-1-photphat: [Glucoz]n + Pi —►[GluCOZ]n-l + glliC02-l-P

Glucoz-1-phophate có thể đi vào con đường đường phân qua con đường glucoz-6 photphat [hình 17.20]. Poli~/3-hyđroxybutyrat [PHB] là một chất dự trữ quan trọng, phổ biến và sự phân giải PHB đã được nghiên cớu kỳ ở Azotobacter. Vi khuẳn này thuỷ phân PHB thành 3 -hydroxybutirat sau đó oxy hoá hydroxybutirat thành acetoaxetat. Acetoaxetat được chuyển thành Acetyl-CoA và Acetyl-CoA cỏ thể bị oxy hoá trong chu trỉnh TCA.

187

17.8. PHÂN GIẢI LI PIT Vi sinh vật thường sử dụng lipit làm nguồn năng lượng. Các triglixerit hoặc triaxilglyxerol, các este của glyxerol và các axit béo [hình 17.21] là các nguôn năng lượng phổ biến. Chúng có thể bị thuỷ phân thành glyxerol và các axit béo bời các lipaz vi sinh vật. Sau đó glyxerol được photphoryl hoá rồi được oxy hoá thành dihydroxyaceton phoíphat và bị phân giải trong con đường đường phân {hình 17.5]. 0 I CH, — o — C — R,

1 y CH — 0 — C ■—

ỉ

0 !!

CHị —■0 “ C — Rj Hình 17.21: Một triaxilgỉyxerol hoậc trỉglixerit. Các nhỏm R biểu thị các chuỗi bền là axit béo.[Theo:Prescottvà Các axit béo từ các triaxilglyxerol và các lipit khácthườngbị đường j8 -oxy hoả sau khi chuyển thành các este của coenzym A [hình ỉ 7.22].

cs, 2005]

oxy hoá tron

Hình ỉ 7.22: p - Oxy hóa axit béo. [Theo: Prescott và cs, 2005]. Trong chu trình này các axit béo bị phân giải thành acetyl-CoA; Acetyl-CoA có thể đi vào chu trinh TCA hay được sử dụng trong sinh tổng hợp. Mỗi vòng của chu trinh sản ra Acetyl-CoA, NADH và FADH 2- NADH và FADH 2 có thể bị oxy hoá trong chuỗi vận chuyển electron tạo thành nhiều ATP hơn. Axit-CoA ngán đi 2C lại sẵn sàng đi vào vòng

tiểp theo của chu trình. Các axit béo của lipit là nguồn giàu năng lượng đối với sinh trưởng của vi sinh vật. Theo cách tương tự, một số vi sinh vật có khả năng sinh trưởng tốt trên các hydrocacbon của dầu lửa trong điều kiện hiếu khí. Sự phân giải các axit béo giải phóng năng luợng chủ yếu ở dạng nhiệt hơn là sự tạo thành ATP. Điều này là do sự kết hợp phản ứng tái oxi hóa của FADH2 với oxi tạo thành H2 O2 . Sau đó H2 O2 bị phân giải bởi catalaz cho H2 O và V2 O2 với sự giải phóng nhiệt là chủ yếu. Vì vậy các vi sinh vật sinh truởng trên axit béo và các chất có liên quan như các alkan chuỗi dải thường tạo thành lượng lớn nhiệt. 17.9. PHÂN GIẢI PROTEIN VÀ AXIT AMIN Một sổ vi khuẩn và nấm, đặc biệt là các vi sinh vật gây bệnh, vi sinh vật làm hư hỏng thực phẩm và vi sinh vật đất, có thể sử đụng các protein làm nguồn cacbon và năng lượng. Nhiều vi sinh vật khác phân giải protein và axit amin chỉ khi vắng mặt các nguồn c như glucoz và lipit. Chúng tiểt ra enzym proteaz thuỷ phân các protein và polipeptit thành axit amỉn; các axit amin được vận chuyển vào tế bào và được phân giải.

ĩ CH, CH,

r----

I CH, CH,

c = 0

0 -

CHj

coo1 l c=0

l II

CH-NH.

0 -

cocr coo-

COO-

CH-NH,

CH,

coo-

COO«-Kôtoglutaratậ «-Kôtoglutaratậ

CH, Alaninử

coo*

Pyruvate Pyruvate

Glutamate

Hình 17.23: Sự chuyển amin. Trên đãy là ỉ ví dụ phổ biển của sự chuyển amin. Nhóm a-amino của alanin được chuyển sang chất nhận a-ketogỉutarat tạo thành pyruvat và gỉutamat. Pyruvat có thể được chuyên hỏa trong chu trình axit tricacbonxylic hoặc được dừng trong sinh tông hợp. [Theo: Prescott và cs, 2005]. Bước đầu tiên trong việc sử dụng axit amin là loại amín [deamination] tức là tách nhóm amin khỏi axit amin. Điều này thường được thực hiện bằng sự chuyển amin [transamination]: nhỏm amin được chuyển từ một axit amin sang một chất nhận là axit-aketó [hình ỉ 7.23]. Axit hữu cơ xuất phát từ việc loại amin có thể được chuyển thành pyruvat, AcetylCoA hay một chất trung gian của chu trình TCA và, cuối cùng, được oxy hoá ừong chu trinh TCA để giải phóng năng lượng. Axit hữu cơ nói trên cỏ thể được sử dụng làm nguồn

c cho việc tổng hợp các thành phần của tế bào. Niíơ dư thừa do loại amin có thể được thài 189

ờ dạng ion amoni đo đó làm cho môi trường trở nên kiềm. Đáng chú ý, oxit trimetilamin [TMAO] là phế phẩm chứa N trong trao đổi chất của cá và có công thức [CH 3] 3NO. TMAO đóng vai trò trong việc tạo thành mùi “cá”. Đây là dạng N dư thừa trong sự phân giải axit amin và bị thải ra. TMAO là chất không mùi đo đó không ảnh hưởng đển mùi, vị và ngoại hình của cá tươi. Tuy nhiên một số vi khuẩn sử dụng TMAO như chất nhận electron tận cùng trong hô hấp kị khí và khử TMAO thành trimetilamin [TMA] có mùi “cá” khó chịu thậm chí mũi người chỉ vài phân tử TMAO đã cảm nhận được vì việc phân giải cá đo vi khuẩn và việc tạo thảnh TMA bắt đầu ngay khi cá chết nên khi cá không có mùi là cá tươi hoặc được ướp lạnh ngay khi cá còn tươi. 17.10. OXI HÓA CÁC PHÂN TỬ HỮU c ơ Như đã nói ở trên, vi sinh vật có thể oxy hoá các phân tủ hữu cơ như hidrat cacbon, lipit, protein và tạo thành ATP nhờ năng lượng được giải phóng. Chất nhận electron là: [1] một phân tử hữu cơ khác nội sinh, oxy hoá hơn xuất hiện trong lên men; [2 ] O 2 trong hô hấp hiếu khí hoặc [3] một phân tử oxy hoá khác O 2 có nguồn gốc từ bên ngoài dùng trong hô hấp kỵ khí [hình 17.2]. Trong cả hô hấp hiếu khí và kỵ khí ATP đều được tạo thành do kểt quả hoạt động của chuỗi vận chuyển electron. Các electron đi vào chuỗi có thể bắt nguồn từ các chất vô cơ và nãng lượng có thể thu được từ sự oxy hoá các phán tử vô cơ hơn là từ các chất dinh dưỡng hữu cơ. Khả năng chỉ gặp ở một nhóm vi khuẩn được gọi là hoá dưỡng vô cơ [chemolithotroph]. Mỗi loài đều đòi hỏi các chất cho và chất nhận electron đặc trưng [bảng 17.4]. Chất nhận electron thường là 0 2 nhưng cũng có thể là nitrat hoặc sulfat. Các chất cho electron phổ biến nhất là H 2, các hợp chất nitơ khừ, các hợp chất sulfua khử và sắt ferrơ [Fe2+]. Vi khuẩn hoá dưỡng vô cơ thường là tự dưỡng và sử dụng chu trình Calvin để cố định C 0 2 là nguồn cacbon. Tuy nhiên một sổ chúng có thể sinh trưởng như vi khuẩn hoá dị dưỡng khi có mặt các hợp chất hừu cơ khử. Quá trình khử C 0 2 thành hidrat cacbon tiêu tốn nhiều năng lượng. Việc gán một phân tử C 0 2 vào chu trình Calvin cần 3ATP và 2NADPH. Tuy nhiên phản ứng oxy hoá các phân tử vô cơ [bảng 17.5] cho năng lượng ít hơn nhiều so với-oxy hoá hoàn toàn glucoz thành C 02; sự oxy hoá hoàn toàn này đi kèm với sự thay đổi năng lượng tự đo chuẩn là - 686 kcaVmol. Tì lệ p /o đối với photphoryl hoá oxy hoá ở vi khuẩn hoá dưỡng vô cơ chỉ vào khoảng 1,0 [tỉ lệ này cao hơn nhiều trong phản ứng oxy hoá H2]. Do sản lượng ATP thấp vi khuẩn hoả dưỡng vô cơ phải oxy hoá một lượng lớn chat vô cơ đê sinh trường và sinh sản, điều này tăng cường tốc động sinh thái cùa chúng.

Bảng 17.4: Các vi khuẩn hóa dưỡng vô cơ tiêu biểu và các nguồn năng ĩuợng của chúng. [Theo: Prescott và cs, 2005] Vỉ khuẩn Aỉcaỉigens, Hydroophaga, và Pseudomonas spp. Nitrobacter Nitroxomonas Thiobacilỉus denitriýicans Thiobacilỉusferrooxydans

Chất cho electron h2

Chất nhận electron

Sản phẩm

h 20

n o 2'

02 0,

NOj-, h 20 NOĩ', HiO so/-, n 2 Fe3+,H 20, h 2s o 4

n h 4+

s°, h 2s Fe3+, s°, H2S

NO302

Bảng 17.5: Sản lượng năng luợng từ những sự oxy hóa sử dụng bởi các vi khuẩn hóa dưỡng vô cơ. [Theo: Preệcoít và cs, 2Ơ05] Phản ứng

AC"’[kcaI/mol]*

H2 + ’/ : 0 2 - ►HjO n o 2 + '/ĩ o 2 ► n o 3-

-56,6 - 17.4

NH4++ 1'/2O2 ►N02' + H20 + 2H+ s° +1 y20 2+ h 20 ► h 2s o 4

-65,0 -118,5 - 223.7 - 11,2

s20 32- + 2O2 + H,0 ►2SO42' + 2H+ 2Fe2+ + 2H++ '/2 0 2 --- ► 2Fe3+ + H30

a,/ ả ơ đổi với sự oxy hỏa hoàn toàn của gỉucoz thành C02 là -686 kcaưmol.ỉkcaỉ tương đương với 4,184 kJ. Một số chi vi khuẩn [bảng ỉ 7.4] có thể oxy hoá khí hydro để sản ra năng lượng vì chúng có enzym hydroaz xúc tác phản ứng oxy hoá hydro: H2

2H+ +2ẽ

Các elecừon được chuyển vào chuôi vận chuyển electron hoặc chuyển đến NAD+ tuỳ thuộc vào hydroaz. Nếu NADH được tạo thành Ĩ1Ó cỏ thể được dùng để tổng hợp ATP nhờ việc vận chuyển electron vá photphoryỉ hoá oxy hoá với c>2 là chất nhận electron tận cùng. Tuy nhiên khi đầy đủ chất dưỡng các vi khuẩn hydro nói trên lại thường sử dụng chất hữu cơ làm nguồn năng lượng. Các vi khuẩn hoá dưỡng vô cơ oxy hoá nitơ được nghiên cứu kỹ nhất là vi khuẩn nitrat hoả. Đây là nhừng vi khuẩn đất và vi khuẩn nước có ý nghĩa sinh thái rõ rệt. Sự oxy hoá amoni thành nitrat phụ thuộc vào hoạt tính của ít nhất hai chi khác nhau. Chẳng hạn, Nitroxomonas và Nitrosospira oxy hoá amoni thành nitrit: nh; +

1 /2

0 2 -> N O 2 + H20 + 2H+

191

Sau đó nitrit có thể bị oxy hoá tiếp bởi Nitrobacter và Nitrococcus thành nitrat:

no;

+ y2o2->NO~, Poriplasm

NOf + HjO

NO*' + 2H*

H* Cytoplasm

Hình 17.24: Dòng electron trong chuỗi vận chuyển electron ỞNỈtrobacter Nitrobacter oxy hóa nitrit và thực hiện việc vận chuyên electron bình thường đê sản ra PMFdùng cho tông hợp ATP. [Nhánh bên phàỉ cùa sơ đồ]. Một phần PMF cũng được đùng đê đây các electron di chuyên ngược với thời gradien thế khử từ nitrit đến NAD+[nhánh bên trái cùa sơ đồ]. Xit.c và 4phức hợp tham gia vào đây ỉà: NADH-Ubiquinone oxydoreductaz [ỉ], ubiquinol-xit.c oxydoreductaz [2], nitrit oxydaz [3] và xit.aaj oxydaz [4]. [Theo: Prescott và cs, 2005]. Khi hai chi hoạt động phổi hợp araoni trong đất bị oxy hoá thành nitrat. Quá trình này được gọi là nitrat hoá [nitrification]. Năng lượng thoát ra trong quá trình oxy hoá của cả amoni và nitrit được dùng đế tổng hợp ATP nhờ photphoryl hoá oxy hoá. Tuy nhiên để khử C 0 2 và các phân tử khác vi sinh vật cần một nguồn electron [lực khử] cũng như một nguồn ATP. Vì amon và nitrit có thể khử dương hơn NAD+ chúng không thể truyền trực tiếp cảc electron đổ tạo thành NADH và NADPH càn thiết. Nguyên nhân là vì các electron chuyển động ngẫu nhiên chỉ từ các chất cho với thế khử âm hơn tới các chất nhận với thế khử dương hom [hình 1 7.7]. Vi khuẳn oxy hoá sulfua cũng gặp phải khó khăn như trên. Cả hai nhóm vi khuẩn hoá dường vô cơ đã khắc phục trở ngại này bằng cách sử dụng PMF để đảo ngược dòng electron trong chuỗi vận chuyển electron và khử NAD+ với các electron từ các chất cho nitơ và sulfua [hình 17.24]. Vì năng lượng được dùng để tạo thành NADH và ATP nên sản lượng thực của ATP ỉà rất thấp. Vi khuẩn hoá dưỡng vô cơ chịu được sự kém hiệu quả này vì chúng không có các đối thủ cạnh tranh về các nguồn năng lượng đặc trưng.

192

[a] Direct oxidation of sulfite

so;-

sulfiteoxidas^ s o ;- + 2e-

[b] Formation of adenosine 6 -phosphostjffats 2 S O j' + 2 AMP — +■ 2APS + 4ô*

2APS + 2p , ► 2ADP + 2SO;2ADP — *• AMP + ATP

2SOs:" +AMP + 2Pj ■ —** 2SO;' + ATP + 4e~

NH, N o l] -o -s-o -p IJ i o o 0

o - CH, 0>

Adộnosinô 5'-phosphosultat& ĩ

y OH OH

[c]

jtfwA Ỉ 7.25: Sự tạo thành năng hiợng bởi sự oxy hóa sulfua. [a] Sulfil cỏ thể bị oxy hỏa trực tiếp để cung cáp electron cho vận chuyển electron vù phoíphoryl hóa oxy hóa. [b] SuỊ/ìt cũng có [hẻ bị oxy hỏa rờ diuvên thành APS. Con chrỏiìg này sàn ra các electron dùnệ cho việc vận chuyến electron và sàn ra A TP nhờ photphoryỉ háu ở mức đọ cơ chất với APS. [c] Cẩu trúc cùa adenozin - 5' - photphontssiúĩat [Theo: Prescoit vù cs, 2005]. Vi khuẩn oxy hoả sulfua ỉà nhóm quan trọng thử ba tron” so củc vi Uhuản hoá vL:C..0 vô cơ. Trao đổi chất của Thiobaciỉỉus đẵ được nghiên cứu chi tiết nhất. Vi khuẩn này oxy hoá sulfua [S°], sulfua hydro [H2S], tiosulfat [S 20 ^ ] và các hợp chất sulfua khử khác thành axit sulfuric, do đó chúng có ý nghĩa sinh thái rõ rệt. Đáng chú ý Thiobacilỉus tổng hợp ATP nhờ photphoryl hoá oxy hoá cũng như photphoryl hoá ở mức độ cơ chất bao gồm adenozin-5-photphorussulfat [APS] là phân tử cao năng tạo thành từ sulfit và adenozin monophotphat [hình 17.25]. Một sổ V! k h u ẩn o x y h o á su lfu a rất linh h o ạ t tro n g tra o đ ổ i chất. Ơ 2 c h ú n g tiế n h à n h hô hấp kỵ khí và oxy hoả chất hữu cơ với sulfua là chất nhận electron.

193

Cũng như các vi khuẩn hoá dưỡng vô cơ khác vi khuẩn oxy hoá sulfua có thể sừ dụng CƠ2 làm nguồn cacbon. Nếu được cung cấp eác nguồn cacbon hữu cơ khử [glucoz hay axit amin] nhiều loài sẽ sinh trưởng dị dưỡng. 17.11. QUANG HỢ P Chẳng hạn, Sulfolobus brierỉeyi và một vài vi khuẩn khác có thể sinh trường hiểu khí nhờ oxy hoá sulfua với O 2 là chất nhận electron. Bảng 17.6: Tính đa dạng của các cơ thể quang hợp [Theo: Prescott và cst 2005] Cơ thể nhân thật Thực vật bậc cao Tảo đa bào màu lục, màu nâu và màu đỏ Tảo dcm bào [tảo mắt, tảo giáp, tảo silic]

Cơ thể nhân nguyên thủy Vi khuần lam Vi khuẩn sulfua màu lục, vi khuẩn không sulfua màu tía, Prochỉoron

Vi sinh vật thu được năng lượng không chỉ từ sự oxy hoá các hợp chất vô cơ và hữu cơ nhưng nhiều trong số chúng có thể thu nhận năng lượng ánh sáng [quang năng] và sử dụng năng lượng này để tổng hợp ATP và NADH hoặc NADPH [hỉnh 77.7]. Quá trinh ữong đỏ quang năng được thu nhận và vận chuyển thành hoá năng gọi là quang hợp. Thường một cơ thể quang hợp khử và cố định CO2 và đây cũng là các phản ứng nằm trong quá trình ưên. Quang hợp là một trong các quá trình trao đổi chất quan trọng nhất trên trái đẩt vì hầu hết năng lượng của chúng ta tựu trung đều bắt nguồn từ năng lượng mặt trời; năng lượng này cung cấp cho các sinh vật quang hợp ATP vả NADPH dùng tổng hợp chất hừu cơ cần cho sinh trưởng. Các sinh vật quang hợp lại là cơ sở cho hầu hết các chuỗi thức ân trong sinh quyển. Quàng hợp cũng có chức năng bổ sung 0 2 cho con người, đây là quá trình quan trọng đo nhiều cơ thể thực hiện, cả sinh vật nhân thật tẫn nhân nguyên thuỷ [ b ò n g 1 7 . 6 ] . M ặ c d ù c o n r ì g ư ò í t h ư ờ n g ĩrá n q u a n g h ọ -p c h o

cý:

• ; v ậ t b ậ c c a o n i i ư t v tL'Cii

thực tế quá nửa quang hợp trên trái đất là do vi sinh vật góp phần. Nhiii chung, có thể chia quang hợp thành hai phần. Trong các phản ứng sáng quang năng bị thtì giữ và được chuyển thành hoá năng. Sau đó năng lượng này được dùng đề khừ hoặc eổ định C 0 2 và tổng hợp các thành phần của tế bào trong các phản ứng tối.

17,11.1. Phản ứng sáng ở các sinh vật nhân thật và vi khuẩn lam Cốc sình vật quang hợp đeu có các sắc tố dùng hấp phụ ánh sáng trong đó sắc tố quan trợng nhất là chlorophyl [chất diệp lục]. Đây lả các vòng phăng, lớn gồm 4 nhân pirol thay thể bởi 1 nguyên từ magiê phổi hợp với 4 nguyên tử nitơ ở trung tâm [hình 17.26]. Một số chlorophyl gặp ở sinh vật nhân thật mà quan trọng nhất là chlorophyl a và chlorophyl b 194

[hình 17.26]. Hai phân tử chlorophyl này hơi khác nhau về cấu trúc và-cac đặc tính quang phổ. Khi hoà tan trong axeton chiorophyl a có đình hấp thụ ánh sáng ở 665 nm; còn chlorophyl b có đỉnh hấp thụ ở 645nm. Ngoài đặc tính hấp thu ánh sảng đỏ các chlorophyl cũng hấp thu mạnh ánh sảng xanh [đỉnh hấp thu thứ hai đối với chlorophyl a là ở 430nm]. Vi các chlorophyl hấp thu chủ yếu trong vùng đỏ và xanh do đó ánh sáng íục được truyền qua. Hậu quả là các sinh vật quang hợp có màu lục. Đuôi dài kỵ nước gắn vào vòng chlorophyl giúp cho sắc tổ này gắn vào màng là vị trí của các phàn ứng quang.

Bactanochlorophyli a CH, I

Ca 0 T

/ >CH,

H' c S °

I h

'•C ' Q

ch-

“Chlorophyll b CH.

Bacterk>chIoro phy! I a

Chlorophyll a

H - l H ./ í * \ 0= \0 v

\ - J ừ

c ^0\— -CH.

Hình ỉ 7.26: cẩu trúc chỉorophyì. Trong kình là cẩu trúc của chlorophyl a, chlorophyl b và bacteriochlorophyl a. Chi ỉ nhóm trong chỉorophyì a bị thay đổi để sàn ra chỉorophyl b, trái lại để chuyển chlorophyi a thành bacteriochỉorophyl a phải cần 2 sự cải biển trong hệ thống vòng. Chuỗi bên [R] cua bacteriochĩorophyl a có thể ỉà phytil [ỉ chuỗi gồm 20C cũng gặp trong các chỉorophyỉ a và b] hay geramỉgeranil [ì chuỗi bền gồm 20C tương tự phytìl nhung nhièĩi hơn 3 nối đôi]. [Theo: Prescott và cs, 2005].

195

P-Carơt*ne

Hình ĩ 7.27: Cảc sắc tổ phụ tiêu biếu. Beia-caroíen là Ị caroíenoìt gặp ở tào và các thực vật cao cẩp. sắc tổ này chúa ỉ chuỗi dài cùa các nối đôi và nổi đơn luân phiên gọi là các nối đôi tiếp hợp. Fucoxantin là 1 sắc tố phụ cùa carotenoit gặp trong một số ngành tào [Dấu chấm trong cấu trúc biêu thị ỉ nguyền từ c']. Phycoxyanobiỉin là một ví dụ cùa tetrapiroỉ đường thẳng ỉiên kết với ỉ protein để tạo thành phycobỉỉiprotein. [Theo: Prescott và cs, 2005]. Các sắc tố quang hợp khác cũng thu giữ quang năng mà phổ biến nhất là c a ro te n o it. Đây là các phân tử đài thường cỏ màu vàng nhạt có một hệ thống liên kết kép tiếp họp [hình 17.27]. jă-caroten gặp ở Prochloron và hầu hết các nhóm tảo; ílucoxantin cỏ mặt ò khuê tảo [diatoms], tảo giáp [Dinoflageỉỉates] và tảo nâu [Phaeophyta]. Tảo đỏ và vi khuẩn lam chứa các sắc tố quang hợp gọi là phycobiliprotein bao gồm một protein liên kết với một tetrapyrol [hình 17.27]. Phycoerytrin là một sắc tố đỏ có đinh hấp thu cực đại ở 550nm và phycocyanin là sắc tố xanh [hẩp thu cực đại ở 620-640nm]. v ề vai ưò trong quang hợp carotenoit và phycobiliprotein thường được coi là sác tố phụ. Mặc đù các chlorophyl không thể hấp thu quang năng một cách có hiệu quả trong vùng xanh - lục đến vàng [khoảng 470-630nm] nhưng các sác tố phụ hấp thu ánh sáng trong vùng này và truyền năng lượng thu được đến chlorophyl. Nhờ vậy chúng giúp cho quang hợp có hiệu quả hơn qua một vùng rộng hơn của chiều dài sáng. Các sắc tố phụ cũng bảo vệ vi sinh vật khỏi ánh sáng mặt trời gay gắt có thể oxy hoá và gây hư hại cho bộ máy quang hợp ừong trường hợp thiếu chúng.

196

Các chlorophyl và sắc tố phụ được tập hợp thành từng dãy có tổ chức cao gọi là ăngten với chức năng tạo ra một diện tích bề mặt rộng dùng thu giữ các photon càng nhiều càng tốt. Mỗi ăngten chứa khoảng 300 phân tử chlorophyl. Quang năng được thu giừ trong một ãngten và được chuyền từ chlorophyl này sang sang chlorophyl khác cho đến khi đạt tới một chlorophyl đặc biệt ở trung tâm phản ứng; chlorophyl này trực tiếp tham gia vào việc vận chuyển electron quang hợp {hình 17.28].

Hình ĩ 7.28: Một chuỗi phàn ứng quang hợp. Trung tâm phản ứng của vi khuẩn không sulfua màu tía Rhodopseudomonas viridỉs. Sơ đồ cận cành của các nhóm thêm ở trưng tâm phán ứng. Trước hết 1 photon được hấp thu bởi ỉ “cặp đặc biệt ” của các phân từ bacteriochỉorophyỉ a và kích hoạt chúng. Sau đó ỉ electron được kích hoạt chuyển động tới phân từ bacteriopheophytin ở nhánh bên phải của hệ thong. [Theo: Prescott và cs, 2005]. Ở các tế bào nhân thật và vi'khuẩn lam có hai loại ăngtcn liên kết với bai hệ

quang

khác nhau. Hệ quang I hấp thu ánh sáng vói bước sóng dài hon [> 680nm] và chuyền năng lưạng tới phân tử chlorophyl a đặc biệt gọi là P700. Thuật ngữ P700 có nghĩa rằng phân tử hấp thu ánh sáng hiệu quả nhất ở chiều dài sóng 700nm. Hệ quang II hấp thu ánh sáng ở các bước sóng ngắn hơn [ [CH 20 ] + 3AĐP + 3PÌ + 2NADP*

Hệ thống không vòng sản ra 1NADPH và 1ATP đổi với mỗi cặp electron, do đỏ 4 electron đi qua hệ thống sẽ sản ra 2NADPH và 2ATP. Tống cộng 8 lượng tử [quantum] của quang năng [4 lượng tử cho một hệ quang] là cần để đẩy 4 electron từ nước đến NADP+. Vì tỉ lệ của ATP đối với NADPH cần cho cố định C 0 2 là 3:2 nên ít nhất .1ATP nữa phải được cung cấp. Quang photphoryl hoá vòng có lẽ hoạt động độc lập với việc sản ra ATP thêm này. Điều này đòi hỏi sự hấp thu 2-4 lượng tử nữa. Như vậy khoảng 10-12 lượng từ quang năng là cần để khử và cố định một phân tử CO 2 trong quang hợp.

199

Chkxoplast

Trên đậy là minh họa màng thyỉacoit của lục lạp chứng minh chức năng cùa chuỗi vận chuyên electron quang hợp và quangphotphoryỉ hóa không vòng, Chuỗi bao gồm 3 phức họp: PSỈ, phức hợp Cytocrom bf và PSỈI. Dồng electron hướng dẫn bởi ánh sáng bơm các proton qua màng thyỉacoit và tạo ra ỉ gradìen điện hóa, sau đỏ gradien nậy cô thể được dùng để tổng hợp ATP. Nước là nguồn electron và phức hợp giải phỏng oxy [OEC] sản ra oxy [Theo Prescott và cs, 2005].

17.11.2. Phản ứng quang ờ vi khuẩn lục và vi khuẩo tía Vi khuẩn lục và vi khuẩn tía quang hợp khác vớỉ ví khuẩn lam và các cơ thể quang hợp nhân thật ở một số điểm quan ừọng [bảng 17.7], Đặc bỉệt, vỉ khuẩn lục và vi khuẩn tíạ không sử dụng nước là nguồn elecừon hoặc tạo thành Ũ2 trong qụang hợp nghĩa là chúng tiến hành quang hợp không thải 0 2. Trái lại, vi khuẩn lam và các sinh vật quang hợp nhân thật hầu nhu bao giờ cũng thải oxy [một số vi khuẩn lam có thể tiến hành quang hợp không thải oxy]. Trong phản ứng sáng của quang hợp ờ vi khuẩn tía NADPH không được tạo thành trực tiếp.

Bảng 1 7.7: Đặc tính của các hệ thống quang họp vi sinh vật. [Theo: Prescott và cs, 2005] Đặc tính

Sinh vật nhâa thật

Vi khuẩn lam

Vỉ khuẩn màu lục và màu tía

Sắc tố quang hợp

Chlorophyl a

Bacteriochlorophyl

Hệ quang II

Có mặt

Cỏ mặt

Vắng mặt

Các chất cho electron quang hợp

h 20

H2, H2S, s, chất hữu cơ

Kiểu sản sinh 0 2

Thải 0 2

Thải 0 2’

Không thải 0 2

Các sản phẩm sơ cấp của sự chuyển hóa năng luợng

ATP + NADPH

ATP

Nguồn cacbon

C0 2

Cacbon hữu cơ và/hoặc C0 2

* Một số vi khuẩn lam có thể hoạt động không thải Oĩ dưới Ị số điều kiện, chẳng hạn Osciũatorìa cỏ thể sử dụng HỉS ỉàm chất cho electron thay cho HỉO. Tuy nhiên, vi khuẩn lục có thể khừ NAD+ trực tiếp trong phản ứng sáng. Để tổng hợp NADH và NADPH vi khuẩn lục và vi khuẩn tía phải sử dụng các chất cho electron như hydro, sulfua hydro, sulfiia nguyên tố và cảc hợp chất hữu cơ là các chất có thể khử âm hơn nước và vì vậy dễ oxy hoá hơn [nghĩa là các chất cho electron tốt hơn]. Cuối cùng, vi khuẩn lục và vi khuẩn tía chứa các sác tổ quang hợp hơi khác nhau gọi là bacteriochlorophyl [hình ỉ 7.26], nhiều trong số chúng có điểm cực đại hấp thu ở những bước sóng dài hom. Các bacteriochlorophyl a và b có đỉnh cực đại trong ete lần lượt ở 775 và 790 nm. Đỉnh cực đại in vivo của bacteriochlorophyl a là khoảng 830-890 nm và cùa bacteríochlorophyl b là 1020-1040 nm. Sự chuyển dịch của cực đại hấp thu vào vùng hồng ngoại như vậy sẽ giúp cho vi khuẩn thích ứng tốt hơn với các ổ sinh thái. Có 4 nhỏm vi khuẩn quang hợp màu lục và màu tía, mỗi nhóm đều chửa một số chi: vi khuẩn sulfua [Chỉorobium], vi khuẩn không-sulfua màu lục [Chloroflexus], vi khuẩn sulfua màu tía [Chromatium] và vi khuẩn không-suỉfua màu tía [Rhodospirillum, Rhodopseudomoanas].

Hình ỉ 7.31; Quang hợp ở vi khuẩn không-suỉ/ua màu tía. Hệ ỉhổng vận chuyến electron quang hợp ờ vi khuẩn không suỉfua màu tía, Rhodobacter sphaeroides. Sơ đồ trên ỉà chưa hoàn toàn và mới ỉà giả định. Ubiquinone [Q] rât giổng với CoQ.BPh là bacteriopheophytin, NAD+yà succinat [nguồn electron] được đảnh dấu. [Theo: Prescott và cs, 2005]. Do thiếu hệ quang II nhiều sự khác biệt gặp ở vi khuẩn rriảu lục và màu tía. Những vi khuẩn này không thể sử đụng nưóc làm chất cho electron trong sự vận chuyển electron không vòng. Thiếu hệ quang II chúng không thể tạo thành O2 từ H2O trong quá trình quang hợp và bị hạn chế ở quang photphoryl hoá vòng. Trên thực tế hầu như tất cả vi khuẩn sulfua màu tía và vi khuẩn sulfua màu lụe là bọn kỵ khí bắt buộc. Trên hình 17.3ỉ là sơ đồ giả định đối với chuỗi vận chuyển electron quang hợp của một vi khuẩn không - sulfua màu tía. Khi chlorophyl P870 đặc biệt của trung tâm phản ứng bị kích hoạt nó sẽ chuyển một electron cho bactériopheophytin. Sau đó các electron di chuyển đến các quinon rồi qua một chuỗi vận chuyển electron lại ừở về P870 đồng thời ATP được tổng hợp, Mặc dù cà vi khuẩn lục và vi khuân tía đều thiếu hai hệ quang nhưng vi khuẩn tía có một bộ máy quang hợp tưcmg tự như hệ quang II, còn vi khuẩn sulfua màu lục có một hệ thống tương tự hệ quang I. Do cũng cẩn NADH và NADPH để cổ định CO2 nên vi khuẩn lục và vi khuẩn tía còn phải đối mặt với một vấn đề nữa. Chúng có thể tổng hợp NADH theo ít nhất ba con đường. Nếu vi khuân đang sinh trường trong sự có mặt của H2 có thể khử âm hơn của NAD+, hydro có thể được sử dụng trực tiếp để sản ra NADH. Cũng như bọn hoá dưỡng vô cơ nhiêu vi khuân tía quang họfp sử dụng PMF để đẩy ngược dòng electron trong chuỗi vận chuyển electron và chuyển các electron nảy từ các chất cho vô cơ hoặc hữu cơ tới NAD+ 202

[hình 17.31 và 17.32]. Các vi khuẩn sulfua màu lục như Chỉorobium có lẽ khử NAD+ nhờ một dạng đơn giản cùa dòng electron quang hợp không vòng [hình ỉ 7.33].

ATP V

ADP 4 p

4 + ỈVADH + H'

Hình ỉ 7.32: Sự khừNAD ờ vi khuẩn màu lục v à

Vỉ' khuẩn

màu tía.

Dòng electron ngược được sừ dụng đế khừ NAD+, Mũi tên trong sơ để biếu thị ỉ chuỗi vận chuyến electron chuyền ngược hướng nhờ động iực proton hoặc ATP, nghĩa ịà các eỉectrọn di chuyển từ các chất cho với thể khử dương hơn tới 1 chất nhận [NAD+] với the khừám hơn. [Theo: Prescott và cs, 2005].

Hình ỉ 7.33: Quang hợp ờ vi khuẩn sulfua màu lục. Hệ thống vận chuyển electron quang hợp ớ vi khuẩn suifua màu lục Chlorobium lìmicoỉa. Quang nâng được dùng để tổng hợp ATP nhờ quang photphorỵl hóa vòng và vận chuyên các electron từ chất cho s tới NAD+. Chuỗi vận chuyển electron chứa I quinon gọi là menaquinon [MK]. [Theo: Prescott và cs, 2005].

Chương 18

s ử DỤNG NĂNG LƯỢNG TRONG SINH TỒNG HỢP Ở VI SINH VẬT

Như trên đã nói vi sinh vật có thể thu nhận năng lượng qua nhiều con đường. Phần lớn năng lượng này được đùng cho sinh tổng hợp hoặc đồng hoá. Trong quá trình sinh tổng hợp vi sinh vật bát đầu với các tiền chất đơn giản như các phân tử vô cơ và các monome và kiến trúc nên các phân tử ngày càng phức tạp hơn cho tới khi xuất hiện các bào quan và các tế bào mới [hình 18.Ỉ]. Mỗi tế bào vi sinh vật phải sản xuất ra nhiều loại phân tử khác nhau; tuy nhiên, ừong chưcmg này chỉ cỏ thể giới thiệu việc tổng hợp những thành phần tế bào quan trọng nhất. Vi du

Cắp đô tồ chức Tế bào

Bào quan

Algae Fungi Protozoa Nuclei

Miiochondria Ribosomes Flagella

Các hệ thống siêu phân tử

Các cao phân tìr

Các monome hoặc các đơn vj kiến trúc

I Các phân tử vô cơ

Membranes Enzyme complexes

Nucleic acids Proteins Polysaccharides Lipids Nucleotides Amino acids Sugars Fatty acids

co>' NHJ' H10, P0*J

Hình 18.1; Kiến trúc cúa các tế bào.

204

Sinh tổng hợp của các thành phần tể bào nhân nguyên thủy và nhãn thật. Sinh tòng hợp được tồ chức ở các cấp độ ngày càng phức tọp hơn. [Theo Prescott và cs, 2005]. Vì đồng hoả là tạo ra một trật tự và mỗi tế bào được sắp xếp ở mức độ cao, cực kỳ phức tạp, do đó sinh tổng họp đòi hỏi nhiều năng lượng. Điều này dễ nhận thấy khi ta xem xét năng lực sinh tổng hợp của tế bào E. coỉi đang sinh trưởng nhanh [bàng 18.1]. Mặc đù hầu hết ATP dành cho sinh tổng hợp được dùng cho tổng hợp protein, nhưng ATP cũng được dùng cho tổng họp các thành phần khác của tế bào. Bảng 18.1: Sinh íểng hợp ởE . coli [Theo: Prescott và cs, 2005] Tbànb pbần tế bào

Sổ phân tử/tế bào*

Các phân tử được tổng hợp/giây

Các phân tử ATP cần/giây cho tỗng họp

ADN ARN Poỉyxaccarít Lipit Protein

lb 15.000 39.000 15.000.000 1.700.000

0,00083 12,5 32,5 12.500 1.400

60.000 75.000 65.000 87.000 2 . 120.000

aỉ Tính cho ỉ tế bào cỏ thế ịich 2,25 ỊMn, trọng lượng ỉx ỉơ 12g, trọng lượng khô 2,5xlơn g và chu trình phân bào là 20 phút. b/Chủ ý: vi khuẩn có thể chửa nhiều bản sao cùa ADN genome. Năng lượng tự do cần cho sình tổng hợp trong các tế bào trưởng thành có kích thước ổn định vì các phân tử của tế bào liên tục bị phân giải và được tổng hợp lại ừong một quá trình được gọi là vòng quay [turnover]. Các tế bào không bao giờ chi nhau ở từng thời điểm khác nhau. Mặc dù vòng quay của các thành phần tế bào là liên tục nhưng trao đổi chất vẫn được điều hoà cẩn thận sao cho tốc độ sinh tổng hợp nói chung, được cân bằng với tốc tộ phân giải. Ngoài năng lượng dùng cho quay vòng các phân tử nhiều tế bàơ không sinh trưởng cũng sử đụng năng lượng để tổng hợp các enzym và các chất khác giải phổng vào mồi trường. 18.1. CÁC NGUYÊN TẲC ĐIỀU CHỈNH SINH TỎNG HỢP Trao đổi chất trong sinh tồng hợp tuân theo một số nguyên tắc chung, 6 trong số các nguyên tắc này được tóm tát dưới đây: 1. Mỗi tế bào vi sinh vật chứa một lượng lớn các protein, axit nucleic và polixaccarite. Tất cả đều là các cao phân từ tức là các polyme gồm các đơn vị nhỏ hơn liên kết với nhau. Việc kiến trúc cảc phân tử lán, phức tạp từ một vài đem vị cấu trúc đom giản hoặc monorne tiết kiệm được nhiều dự trữ đi truyền, nguyên liệu cho sính tổng hợp và năng lượng. Ta hãy xem xét tổng hợp protein để hiểu rõ vấn đề này. Các protein, bất kể có kích thước, hình dạng

205

hoặc chức năng như thể nào, đều được tạo thành chỉ bời 20 axit amin thông thường nổi với nhau nhờ liên kết peptít. Các protein khác nhau đơn giàn chỉ là do có thứ tự axit amin khác nhau nhưng không phải là các axit amin mới và khác. Giả dụ, nếu các protein được tạo thành không phải bằng 20 mà bằng 40 axit amin khác nhau, tế bảo sẽ phải cần các enzym để sản xuất ra các axit amin nhiều gấp đôì [hoặc phải nhận được các axit bổ sung từ thức ăn]. Các enzym bổ sung đòi hỏi phải có các gen và tế bào lại phải đầu tư thêm nguyên liệu và năng lượng cho việc tổng hợp các gen, các enzym và các axit amin bổ sựng nạy. Rõ ràng, việc sử dụng một vài monome nối với nhau bởi một liên kểt cộng hoá trị duy nhất khiến cho việc tổng hợp các cao phân tử trờ thảnh một quá trình rất có hiệu quả. Hầu như tất cả các cấu trúc tế bào đều được kiến trúc chủ yếu bởi khoảng 30 tiền chất nhỏ. 2. Tế bào thường tiết kiệm các nguyên vật liệu và năng lượng bằng cách sử dụng các enzym đùng cho cả dị họá và đồng hoá. Chẳng hạn, hầu hết các enzym đường phân đều tham gia tổng họp và phân giải glucoz. 3. Mặc dù nhiều enzym ừong các con đường lưỡng hoá hoạt động trong cả phân giải và tổng họp nhưng một số bước lại được xúc tác bởi hai enzym khác nhau: một xúc tác phản ứng theo hướng phân giải và một theo hướng tổng hợp [hình 18.2]. Vỉ vậy, cậc cori đường dị hoá và đồng hoá không bão giờ chi nhau mặc dù có nhiều enzym chung. Việc sử dụng các enzym riêng rẽ theo hai hướng ở một bước đơn độc cho phép điều chỉnh dị hoá và đồng hoá một cách độc lập. Cần nhớ răng việc điều chỉnh đồng hoá hơi khác với điều chinh dị hoá. Cả hai con đường đều có thể điều chỉnh được bởi sân phẩm cuối cùng cũng như bởi nồng độ ATP, ADP, AMP và NAD+. Tuy nhiên, trong các con đường đông hoá việc điều chỉnh bỏd sản phẩm cuối cùng, nói chung, có vai trò quan trọng hơn. 4. Để tổng hợp các phân tử một cách hiệu quả các con đường đồng hoá phải hoạt động không thuận nghịch theo hướng sinh tổng hợp. Tế bào có thể thực hiện điêu này bằng cấch liên kết một số phản ứng sinh tổng hợp với sự phân giải ATP và các nucleozit triphotphat khác. Khi hai quá trinh này được liên kêt năng lượng tự do thoát ra trong sự phân giải nucleozit triphotphat sẽ hướng đẫn phản ứng sinh tổng hợp hoàn thành, 5. ơ các vi sinh vật nhân thật các con đường sinh tổng hợp thường diễn ra bên trong các khoang tê bào khác với các con đường phân giải tương ứng. Chẳng hạn, sinh tông hợp axit béo gặp ưong tế bào chất trong khi sự oxy hoá axit

béo được thực hiện bên trong ty thể. Sự phân khoang tạo điều kiện cho các con đường hoạt động đồng thời không phụ thuộc vào nhau.

Hình 18.2: Một con đường sình tồng hợp giả thuyết. Các con đường íìêỉĩ kểt G vời X, Y và Z hoàn toàn là đồng hỏa vì chúng chi được dùng để tồng hợp các sản phẩm cuối cùng. Con đường từ A ăển G là ỉtrỡng hóa, nghĩa ỉà có cả chức nâng dị hỏa và đồng hỏa, Hầu hểt các phàn ứng được dùng trong cả 2 vai trò; tụy nhiên, sự chuyển hỏa qua lại cùa c và D được xúc tộc bởi 2 enzym riêng biệt, Eì [dị hóa] và Eĩ [đằng hỏa]. [Nguồn Prescott và cs, 2005]. 6 . Cuối cùng, các con đường đồng hoá và dị hoá thường sử dụng các cofactor khác

nhau. Gác phàn ứng oxy hoá trong phân giải, nói chung, sản rạ NADH là một cơ chất cho vận chuyển electron. Trái lại, khi một chất cho electron ỉà cần cho sinh tổng hợp thì NADPH chứ không phải NADH thường đảm nhiệm chức năng này. Trao đổi chất của axit béo cung cấp ví dụ thứ hai. Các phân tử acyl-CoA của axit béo bị oxy hoá để sản ra năng lượng trong khi tổng hợp axit béo có sự tham gia cùa các tioeste của proteịn mang nhánh acyl. Sau khi các cao phân íử đã được kiến trúc từ các tiền chất đơn giản hơn chúng sẽ được tập hợp thành các cấu trúc lớn hơn, phức tạp hơn như các hệ thổng siêu phân tử và các bào quan [hình 18. ỉ]. Các cao phân tử thường chứa thông tin cần thiết để tạo thành một 207

cách ngẫu nhiên trong một quá trình gọi là tự tập hợp. Chẳng hạn, riboxom là những tập hợp lớn gồm nhiều protein và các phân tử axit ribonucleic nhưng chúng được tạo thành nhờ sự tập hợp của các thành phần không cần cỏ sự tham gia của các yếu tổ bổ sung: 18.2. CÓ ĐỊNH QUANG HỢP C 0 2 Mặc dù hầu hết vi sinh vật có thể cố định CO2 ít nhất là trong các phản ứng bổ sung tuy nhiên chì các cơ thể tự dưỡng mới cỏ khả năng sử dụng CO2 làm nguồn cacbon duy nhất hoặc chủ yếu. Sự khử và cổ định CO2 đòi hỏi nhiều năng lượng. Các cơ thể tự dưỡng thường thu năng lượng nhờ sự hấp thu ánh sáng trong quang họp nhưng một số nhận được năng lượng từ phản ứng oxy hoá các chất cho electron vô cơ khử. Sự cố định CO2 tự dưỡng cỏ ý nghĩa quyết định đối với sự sổng trên ừái đất vì nó cung cấp chất hữu cơ cho các cơ thể dị dưỡng. Vi sinh vật có thể cố định CO2 hoặc chuyển phân từ vô cơ này thành cacbon hừu cơ và đồng hoá nó theo ba con đường chủ yếu. Hầu như tất cà các vỉ sinh vật tự dưỡng đều cố định CO2 qua con đường trao đổi chất đặc biệt được gọi là chu trình Calvin [cũng gọi là chu trình Calvỉn-Benson hoặc chu trình pentoz-photphat khử]. Mặc dù hoạt động trong các cơ thể quang hợp có nhân thật và hầu hết cơ thể quang hợp có nhân nguyên thuỷ nhưng chu ưình Calvin lại vắng mặt ở Archaea [Cổ khuẩn], một số vi khuẩn kỵ khí bắt buộc và một số vi khuẩn hiếu khí. Những vi khuẩn này thường sử dụng một trong hai con đường khác. Một số archaea Ợhermoproteus, Suỉ/oỉobus] và các vi khuẩn Chỉorobium và Desulfobacter sử dụng con đường axit tricacbonxylic khử. ở các vi khuẩn sinh metan, vi khuẩn khử sulfat và các vi khuẩn sinh axetat [các vi khuẩn tạo thành axetat từ CO2 trong quá trình lên men] lại tồn tại con đường Acetyl-CoA. Chu trình Calvin gặp trong chất nền [stroma] của lục lạp của các vi sinh vật nhân thật tự dưỡng. Vi khuẩn lam, một sổ vi khuẩn nitrat hoá và các thỉobacỉllỉ chứa các thể vùi, đa diện gọi là cacboxyxom. Cacboxyxom chứa enzym ribulo-1 »5-bisphotphat carboxylaz, có thể là vị trí cổ định CO2 hoặc Vị trí dự trữ carboxylaz và cốc protein khác. Có thể chia chu trình Calvin thành 3 pha: carboxyl hoá, khử và tái sản. Sơ đồ chung của chu trinh được giới thiệu ở hình ỉ 8.4.

18.2.1. Pha carboxyl hoá [carboxylation phaz] Sự co định CO2 được xúc tác bởi enzym ribulo-l,5-bisphotphat-carboxylaz hoặc oxyaz [rubisco] {hình 18.3] xúc tác việc gắn C 0 2 vào ribulo-ỉ,5-bisphotphat [RuBP] tạo thành 2 phân tử 3-photphorus-glycerat [PGA].

208

18.2.2. Pha khử [reduction phaz] Tiếp theo, PGA bị khử thành glyceraldehit-3-photphat. Sự khử được xúc tác bởi 2 enzym, thực chất là sự đảo nghịch một phần của con đường đường phân mặc dù glyceraldehit-3-photphat-dehitrogenaz khác với enzym đường phân trong việc sử dụng NADP+ thay cho NAD+ [hình ỉ 8.4]. ooc—Ỹ~-OH H—c —OH 1 '

■ ."

c -f 0 ĩ

H,0

CH,0 [p] H—C—OH 1. ĩ . COOH

; ;VV:" ' ■ COOH ■

■,

CHẠ0 _

CHP

' Rlbuloso 1.5«

titephosphate

[RuBP]

glucoz + 18ADP + 18Pi + 12NADP* ATP và NADPH được cung cấp bởi các phản ứng sáng quang hợp hay bởi sự oxy hoá các phân tử vô cơ ở các vi khuẩn hoá tự dưỡng. Sau đỏ các đường tạo thành trọng chu trình Calvin có thể được dùng để tổng hợp các phân tử cần thiết khác.

209

ch2o ® p =0 I_ HỘOH i_ HCOH

HỘÃ

CHjO® CO:’2 RibuĩoseHjO 1,5-btephosphata

carboxylase

I HQCH TOOH. C

Krif

HCOH 3-phosphogiycerate CHjO®

•

4 Phosphotfycerate kinase •■>* ■ ■> •A D P -* > ■■ ij* '*■ "1 Ỉ : ATP —^ t * t

.f "■ ■■k ■ '■> ’Ì1 1

► ' : ■ . rr ■

COOH

ATP ADR fl ^ G-Q©

HCOH

1,3-bispho8pbogtyeerat«

CHjO[P] -NADPH + H* Gtyceraldehyde3-phosphate

dehydrogenase

robylọaá s - ■■ ' phosphate

I ị -; , v . I' ■ -

PHASE

Biosynthetic

[5]

products

Fructose ^,5*u'sp.‘:c:.i::,';.a Fructose 6-phosphate

L ‘ J- • •

r e g e n e r a t io n

I '

■■■•'"|. Erythrose 4-phosphate 1 Hibose 5-phosphate /,ạhdơtheíÍ ntejwiedipta*,

,- f ” * - ' , - i" ,'i

Hình 18.4: Ghtt trình Calvin. Trên đây là sơ đo van tẳt của chu trình chì với các pha carboxyl hóa và khử ẩirợc trình bày chi tiết. 3 ribuỉo-Ị,5-bisphotphat được carboxyl hóa tạo íhành sáu 3-photphorusglycerat trong pha carboxyl hóa. Các chất này đirợc chuyển hỏa thành ổ gỉycerat-3-photphat rồi có thể thành dihydroxyaceton phoiphat [Ì]HAP] S trong sổ 6 trió2 [gỉyceraìấehit photphat vổ dìhydroxyaceton photphat] được dùng để tạo lại 3 ribuỉo-ĩ,5-bispỉìotphat trong pha tái sởn. Trioz còn ỉại được dùng trong sinh tống hợp. Những con sổ trong ngoặc đơn ở bên phải phía dưới chi ra dòng cacbon này. [Theo: Prescott và cs, 2005].

210

18.3. TÒNG HỢP CÁC ĐƯỜNG VÀ POLISACCHARIDE Nhiều vi sinh vật không có khà năng quang hợp và là các cơ thể dị dưỡng phải tổng hợp đường từ các phân tử hữu cơ khử thay cho từ C 0 2. G lucose A TP Hflxckmase

ADP

G lucosa I p h o sp h ate

F ructose 8 5ho*phat« ATP Phsspnolructakinase

^ p .

A D P ^t

H.o

Fructose 1,0-bi

íh a ta

: D ihydroxyaeeton# p h o sp h a ts

Q ycsraldahycts 3-phosphat«

wP, —MAD'

-f'iADH + K 1,ạ-bíspho®phoglyeflrate A -*-Á d p

h — ATP 3-ptiosphoglycflratu

2-pỉiosphoglyc«ratfl

ph o s ph Qù n o\pyruvat fl

^GŨP ADP

Pyrưvate k m as »

p h c Sph 2 è II ữl pyru . Í1i ử

— GTP

carbaxykịnasa

Q xaỉoacatata AD p

ATP

K _ ATp ^

• — CO

“:r

-jgff ịj;i; '

utàtcậrbt^ắmTị

ìỂèẵ^M rịám sM ầữÊỉ^i

Pyruvat#

Hình Ị 8.5: Sự tải tạo đường. Cort đirờng tảị tạo đường gap ở nhiều V I sinh vật. Tên cùa 4 enzym gộp trong đường phản được đóng khung. Các bttởc đường phân cùng âược biểu thị để so sảnh.[Theo: Prescott VÀ cs, 20Ọ5].

211

Việc tổng hợp glucoz từ các tiền chất không phải hydratcacbon được gọi là sự tái tạo đường [gỉucoz neogensis]. Mặc đù con đường tái tạo đường không chi con đường đường phân nhưng chúng cỏ 7 enzym chung [hình ỉ 8.5]. Ba bước đường phân sau đây là không thuận nghịch trong tế bào: 1] Chuyển hoá photphorusenolPyruvat thảnh pyruvat; 2] tạo thành fructoz -1,6-bisphotphat từ fructoz -6photphat và 3] photphoryl hoá glucoz. Các bước này phải đi vòng khi con đường hoạt động theo hướng sinh tổng hợp. Chẳng hạn, sự tạo thành fructoz -1,6-bisphotphat bởi photphorusfructoz kinaz được đảo nghịch bởi enzym fructoz -bisphotphataz, enzym này loại bỏ nhờ thuỷ phân một photphat từ fructoz -bisphotphat. Thông thường ít nhất hai enzym tham gia vào việc chuyên hoá pyruvat thành photphorusenol pyruvat [đảo nghịch buớc pyruvat kinaz]. Từ hình 18.5 cỏ thể thấy con đường tổng họp fructoz za tương tụ ihhư con đường tổng hợp glucoz se. Một khi glucoz và fructoz za đã được tạo thành các đường phổ biến khác cũng được sản sinh. Chẳng hạn, mannoz được hình thành trực tiếp từ fructoz qua một sự sáp xếp lại đon giản: Fructoz -6 -photphat

Mannoz-6 -photphat

Một số đường được tổng hợp trong khi liên kết với một nucleozit diphotphat. Đường nucleozit điphotphat quan ừọng nhất là uridin diphotphat gỉucoz [ƯDPG]. Glucoz được hoạt hoả nhờ gẳn với pyrophotphat của uridin diphotphat qua phản ứng với uriđin triphotphat [hình 18.6]. 0

mA o K r í

CH,

V -r OH

ỎH

Uridtrwdiphosphat* Hình 18.6: Uriđin diphotphaị glucoz [Theo: Prescott và cs, 2005]. Phần UDP của HDPG đurợc các enzym nhận ra và mang glucoz đi kháp tể bào dùng tham gia vào các phản ứng hệt như ADP mang photphat ở dạng ATP. ƯDP-galactoz được tổng hợp từ UDPG qua việc sắp xếp lạĩ của một nhóm hydroxyl. Một enzym khác xúc tác việc tổng hợp ƯDP - axit glucuronic qua việc oxy hoá UDPG [hình 18.7]. 212

Các đưcmg nucleozit điphotphat cũng đỏng vai trò chủ chốt trong việc tổng hợp các polixaccarite như tinh bột và glycogen. Cũng lại ở đây, sinh tổng hợp không đơn giản chỉ là sự đảo ngược trực tiếp của phân giải. Sự phân giải glycogen và tinh bột diễn ra qua sự thuỷ phân để tạo thành các đường tự do hay qua việc gắn thêm nhảnh photphat vào các polyme này để sản ra glucoz -1-photphat. Các đường nucleozit diphotphat không tham gia vào quá trinh trên. Trái lại trong việc tổng hợp glycogen và tinh bột ở vi khuẩn và tảo adenosine diphotphat glucoz được tạo thành từ glucoz - 1-photphat và sau đó chuyển glucoz vảo cuối chuỗi glycogen và chuỗi tinh bột: ATP + Glucoz -1-photphat -» ADP-glucoz + PPi [Glucoz se]n + ADP-glucoz -> [Glucoz se]n+i + ADP Các đường nucleozit diphotphat cũng tham gia vào việc tổng hợp cảc phân từ phức tạp như thành tế bào vi khuẩn.

UDP-galactose

UDP-glucuronic acid

Hình 18.7: Uridin diphotphat galactoz vò tổng hợp glucuronat. Trên hình là việc tổng hợp UDP-gaỉactoz và UDP-axit glucuronic từ UDP-glucoz se. [Theo: Prescott và cs, 2005].

18.4. S ự ĐỎNG HÓA PHOTPHORUS, LƯU HUỲNH [SULFUA] VÀ NITƠ [NITƠ] VÔ C ơ Ngoải cacbon và oxy vi sinh vật cũng cần một lượng photphorus, sulfua và nitơ cho sinh tổng hợp. Mồi nguyên tố nói trên được đồng hoá hoặc được cổ định thành các phân tử hữu cơ qua các con đường khác nhau.

213

18.4.1. Sự đồng hoá photphorus Photphorus gặp trong cảc axit nucleic, protein, photphoỉipit, ATP và các coenzym như NADP. Nguồn photphòrus phổ biến nhất là các este của photphat vô cơ và photphat hữu cơ. Photphat vô cơ được cố định qua việc tạo thành ATP thông qua một tròng ba con đường: I] quang photphoryl hoá; 2] photpboryl hoá oxy hoá và 3] photphoryl hoá ờ mức độ cơ chất. Đường phân cung cấp một ví dụ của con đuòmg thứ ba. Photphat được gắn với glyceraldehit-3-photphat tạo thành 1,3 -bisphotphorusglycerat, sau đỏ chất này được đùng để tổng hợp ATP. Glyceraldehit-3-photphat + Pi + NAD+ -» 1,3-bisphotphorusglycerat +- NADH + H* 1,3'bisphotphorusglycerat + AJDP

3-photphòrusglycerat + ATP

Vi sinh vật có thể thu nhận các photphat hữu cơ từ môi trường bao quanh ở dạng hoà tan hay dạng hạt. Các este cùa photphat hữu cơ thường bị thuỳ phân bời các photphataz và tách ra photphat vô cơ. Vi khuẩn gram âm chứa cảc photphataz trong khoang chu chất nằm giữa thành tế bào và màng sinh chất;vì vậy sau khi được giải phóng photphat được hấp thu trực tiếp qua màng. Động vật nguyên sinh, trái lại, có thể sử dụng trực tiếp các photphat hữu cơ sau khi ăn hoặc thuỷ phân chủng trong lyzoxom và tiêu thụ photphat.

18.4.2. Sự đồng hoá sulfua Sulfua cần cho việc tổng hợp axit amin [cystein và metionin] và một số coenzym [coenzym A, tiamin-pyrophotphat và biotin] và có thể thu được từ hai nguồn. Nhiều vi sinh vật sử dụng cystein và metionin dẫn xuất tử các nguồn bên ngoài hoặc từ dự trữ axit amin nội bào. Ngoài ra, sulfat có thể cung cẩp sulfua cho sinh tổng hợp. Nguyên tử sulfua trong sulfat oxy hoá hơn nguyên tử sulfua trong cystein và các phân từ hữu cơ khác, do đỏ sulfat phải bị khử trước khi có thể được đồng hoá. Quá trình này được gọi là sự khử sulfat đồng hoá để phân biệt với sự khử sulfat dị hoá diễn ra khi sulfat tác dụng như chất nhận electron trong hô hấp kỵ khí. 0

!! 0

I 0'

tí J| ■0 —S ~ G—p —o —CH

Aổônina

0= p - 0

cr H ình 18.8: Photphorusadenosin 5 ’-photphorussulfat [PAPS]. Theo: Prescott và cs, 2005].

pp, Aderiosina5'«phosptiòsú]faté

L ^A TP

Phosphoade nosine 5'- phosphosuJfat* K — NỊADPIHUH* .

Phospỉvoạdenosln# ậ"*phosphatộ

’W I F ' '

" ■Ỉ+ H*

■-1

;' " " i

1 ^M A D P‘

**■ ' 1r .....j-'K.i '

", V.'

Ọ rộáÃíe s u lfu r COm p p u n ậ *

•,

ỉ

"■' I '

•

’

Hình 18,9: Con đường khử sulfat [Theo: Prescott và cs, 2005]. Sự khử sulfat đồng hoá đòi hỏi phải hoạt hoá sulfat qua việc tạo thành photphoadenosine-5’-photphosulfat [hình ỉ 8.8] tiếp theo là sự khử sulfat. Đây là một quá trình phức tạp [hình Ị 8.9] ữong đó sulfat trước hết bị khử thành sulíĩt [S O 3- ] sau đỏ thành H2S. Cystein có thể được tổng hợp từ sulfua hydro qua hai con đường. Nấm cỏ thể kết hợp H2S với serin tạo thành cystein nhưng nhiều vi khuẩn lại gắn H2S với O-Acetylserin [quá trình 1 và 2, lần lượt]: [1] H2S + Serin -»Cystein + H2O Acetyl-CoA

[2] Serin

CoA

H2S

Acetat

O-Acetylserin Cystein

215

Một khi được tạo thành cystein có thể được đùng để tổng hợp cảc hợp chât hữu cơ khác có chứa sulfua. 18.4.3. Sự đồng hoá nitơ Do là thành phần chủ yểu của các protein, axit nucleic, coenzym và nhiều thành phàn khác nên năng lực đồng hoá nitơ của tế bào là cực kỳ quan trọng. Mặc dù khí quyển giàu khỉ nitơ nhưng chỉ một số ít vi khuẩn có thể khử khí này và sử đụng làm nguồn nitơ. Còn hầu hết vì sình vật có khả năng đồng hoá amonỉ hoặc nitrat.

Sự đồng hoá amonỉ Nitơ của amoni có thể được chuyển hoá thành chất hữu cơ tương đối dễ dàng và trực tiếp VI nitơ ở đây gặp trong ừạng thái khử hơn các dạng khác của nitơ vô cơ. Một số vi sinh vật tổng hợp axit arain Alanin ừong một phản ứng amin hoá khừ xúc tác bởi Alanin dehitrogenaz: Pyruvat + N H J + NADH [NADPH] + H* Alanin

+ NAD+[NADP+] + H20

Hình 18.10; Con đường đồng hỏa amonì. Sự đồng hỏa amoni nhờglutamat.dehitrogenaz [GDH] Vớ tramaminaz. Cảc GDHphụ thuộc NADP hoặc NẢD cỏ thể tham gia vào đây. Con đường này hoạt động mạnh nhất ở những nồng độ amonỉ cao [ Theo Prescott va cs, 2005]. Con đường chủ yếu đồng hoá amoni là tạo thành glutamat từ a-ketoglutarat [một chất trung gian của chu trình TCA]. Nhiều vi khuẩn và nấm sử dụng glutamat*đehitrogenaz khi nồng độ amoni cao: a -ketoglutarat + NHJ + NADPH [NADH] + H*

Glutamat + NADP+[NAD+] + H20

Việc sử dụng NADPH và NADH [tác nhân khử] trong tổng hợp glutamat thay đổi tuỳ theo loài. Một khi Alarnn hoặc glutamat đã được tổng hợp nhóm a-atnin mới được tạo thành có thê được chuyên sang các bộ khung cacbon khác thông qua các phản ứng chuyển atnin, từ đó sẽ xuât hiện các axit amin khác. Các ừansaminaz chứa coenzym pyridoxal photphat có

chức năng chuyển nhóm amin. Vi sinh vật có một sổ transaminaz, mãi enzym này xúc tác việc tạo thành một số axit amin bàng cách sủ dụng cùng một axit amin làm chất cho nhóm amin. Khi glutamat-dehitrogenaz hoạt động phối hợp vói các transaminaz amoni có thể được chuyển thành nhiều axit amin [hình ì 8.10].

Phản ứng glutamine synthetase 0

COOH

C -N H ,

ĩHỉ

CH,

CH I '

CH,

NH, + ATP

+ ADR + P.

ĨH — NH,

C H -N K

COOH

Acid glutamic

Glutamine

Phản ứng glutamat synthase COOH

COOH

ỢOOH

COOH

ọ= 0

CH—NH

CH—NHj

C H -N H ,

CH,

CH I CH}

! CH,

?H' ỸH' COOH

Acỉd aketoglutaric

ỸHj c

+ NHj

Glutamine

NADPH + H’

or Fci

ĩ Hj COOH

I I

NADP* or

COOH

2 acid glutamic

Hình 18.1 ỉ: Gỉutamin syntetaz và gỉutatnạt synthaz. Các phàn úng do 2 enzym này xúc tác tham gia vào việc đồng hóa amonỉ. Một số gỉutamat syntetaz sử dụng NADPH là nguồn electron, số khác lại sử dụng ferredoxin khử [Fd]. [Nguồn Prescott và cs, 2005]. Con đường thứ hai dùng đồng hoá amoni bao gồm 2 enzym tác dụng theo thứ tự, đó là glutamin syntetaz và glutamat-synthaz [hình ì 8.l ì] . Amoni được dùng để tổng hợp glutamin từ glutamat, sau đó am it nitơ của glutamin được chuyển đến oketoglutarat để tạo thành một phân tử glutamat mới. Vì glutamat tác dụng như một chất cho amin trong các phản ứng cùa transaminaz nên amoni có thể được dùng để tổng hợp tất cả các axit amin thông thường khi có mặt các transaminaz thích hợp {hình 18A2].

Cả ATP và một nguồn các electron như NADPH hay ferredoxin khử đều cần. Con đường này gặp ở E. coli, B. megaterium và nhiều vi khuẩn khác. Hai enzym tác dụng theo thứ tự hoạt động rất hiệu quả ở các nồng độ amoni thấp khác với con đường glutamat dehiưogenaz. Như đã nói ở trên glutamin syntetaz được điều hoà chặt chẽ nhờ sự cải biến cộng hoá trị thuận nghịch và các effector dị lập thể.

Con đường nậy hoợt động có hiệu quả ở nhãng nồng độ amoni thấp. [Theo: Prescott và cs, 2005].

* Sự khử n itra t đồng hoá Nitơ trong nitrat [ N O 3 ] ở trạng thái oxy hoá hơn nhiều so với nitơ trong amoni. Nitrat trưởc hết phải bị khử thành amoni trước khi nitơ có thể được chuyển hoá thành một dạng hữu cơ. Sự khử này của nitrat được gọi là khử nitrat đồng hoá. NỌ,‘

Nitrate reductase Mo*+ -PAD -^-NADPH

NO.2

26' ịNOH]

Nitroxyl

2e‘

Niiriíe reductase

NHpH H/droxylùmìne 2H

2e" H,0

NH. Hình ỉ 8.13: Khừ nỉtrat đồng hóa.

218

Con đường này gập ớ các vì khuân có thể khừ và đồng hóa nitơ cùa nitrat. Theo: Prescott và cs, 2005]. Quá trình này khác với quá trình diễn ra trong hô hấp kỵ khí và khử nitrat dị hoá. Trong sự khử nitrat đồng hoá nitrat được chuyển thành chất hữu cơ và không tham gia vào việc sản sinh năng lượng. Khử nitrat đồng hoá gặp phổ biến ờ vi khuẩn, nấm và tảo. Quá trinh nói trên diễn ra trong tế bào chất ở vi khuẩn. Bước thử nhất trong đồng hoá nitrat là khử nitrat thành nitrit xúc tác bài nitrat reductaz là enzym chứa FAD và molipden [Hình 18.13], NADPH là nguồn electron: N O ; + N ADPH +H+

N 0 2+ NA D P+ + H 20

Sau đó, nitrit bị khử thảnh amoni thông qua một số lần bổ sung 2 elecừon được xúc tác bởi nitrit reductaz và có thể cả các enzym khác. Hydroxylamin có thể là một chất trung gian. Tiếp theo amoni được chuyển hoá thành các axit amin nhờ các con đường đã mô tả. ỉ 8.4.4. Sự cố định Nitơ [Nỉtơ fixation] Sự khử khí nitơ của khí quyển được gọi là sự cố định nitơ. Vì nồng độ của amoni và nitrat thường thấp, hơn nữa chỉ một số vi khuẩn cỏ khả năng trên [các tế bào nhân thật hoàn toàn không thể thực hiện được cố định N 2] nên tốc độ của quá trình này trong nhiều hoàn cảnh, hạn chế Eniymê sinh trưởng của thực vật. c ố định nitơ gặp ở: 1] các vi khuẩn sống tự do [vỉ dụ: Azotobacter, Klebsiella, Clostridium và Metanococcus]; 2] các vi khuẩn cộng Enzym# • N = N sinh với thực vật như các cây họ Đậu [Rhizobittm], cây phi lao [xạ khuẩn Frankia] và bèo dâu [vi khuẩn lam Anabaena azollae] và 3] các vi khuẩn lam {Nostoc và Y Enzynifi * = NH Anabaena]. | ^ . 28‘t2 H4 Sự khử nitơ thành amoni được xúc tác bởi enzym nitaaz. Mặc dù các chất trung gian gắn vào enzym ta còn chưa rõ nhưng cỏ lẽ nitơ bị khử qua một số lần bổ sung 2 electron như Hình 18.14 mô tả. Sự khử nitơ phân tử thành amoni phát nhiệt mạnh nhưng phản ứng có năng lượng hoạt hoá cao do nitơ phân tử là một khí trơ với một liên kết ba giữa hai nguyên tử nitơ.

Enzyms »

— NH2

2NH3 Erưyma ĩ

Hình 18.14: K h ừ n itơ . Già thuyết k h ù rtiíơ nhờ nitơaz [Theo: Prescott và cs, 2005].

219

Vì vậy, sự khử nitơ là tốn kém và tiêu thụ nhiều ATP. ít nhất 8 electron và 16ATP, cứ 4ATP là cần cho một cặp electron: N 2 + 8H* + 8e + 16ATP

2NH3 + H2 + 16ADP + 16PÌ

Các electron bắt nguồn từ ferredoxin đã bị khử bởi một số con đường, chẳng hạn qua quang hợp ở vi khuẩn lam, qua các quá trình hô hấp ờ các YỈ khuẩn cố định nitơ hiếu khí hoặc qua lên men ở các vi khuẩn kỵ khí. Ví dụ, Clostridium pasteurianum [một vi khuẩn kỵ khí] khử ferredoxin trong quá trình oxy hoá Pyruvat, trong khi Azotobacter [một vi khuẩn hiếu khí] lại sử dụng electron từ NADPH để khử ferredoxin. Nitơaz là một phức hệ gồm 2 protein chủ yếu: một protein MoFe [hay nitaaz, MW 220.000] liên kết với 1-2 protein Fe [hay nitoaz reductaz, MW 64.000]. Protein MoFe chứa 2 nguyên tử molipđen và 28-32 nguyên tử sắt; protein Fe chứa 4 nguyên tử sắt [hình 18.15]. Fe và Mo của protein MoFe được chứa bên trong một cofactor gọi là FeMo-co và sự khử N 2 diễn ra ở cofactor này. Trước hết protein Fe bị khử bởi ferredoxin sau đó nó liên kết ATP [hìnhl8.'ỉ6]. Sự liên kết ATP làm thay đổi hỉnh thể của protein Fe và hạ thấp thế khử của protein này [từ lOOmV đển ~ 400 mV] tạo điều kiện cho protein Fe khử protein MoFe. ATP bị thuỷ phân khi diễn ra sự chuyền electron này. Cuối cùng, protein MoFe khử chuyền các electron tới nitơ nguyên tử. Một số vi khuẩn chứa enzym hydrogenaz oxi hóa H 2 thành H2O và liên kết phản ứng này với việc tạo thành ATP hay với việc khử ferredoxin [Fd] hoặc flavodoxin [Fld] rồi các chất này lại cỏ thể chuyển electron cho protein Fe. Nitơaz rất mẫn cảm với O2 và phải được bào vệ sao cho khỏi bị bất hoạt bời O2 bên trong tế bào. Ở nhiều vi khuẩn lam sự bảo vệ này được thực hiện nhờ một cấu trúc đặc biệt gọi là dị bào nang [heterocyst], có vách dày, chi chứa hệ quang I [dùng tổng hợp ATP nhưng không tạo thành O2].

H ình 18.15: c ẩ u trúc của protein Fe ở nitơaz [Theo: Prescott và cs, 2005].

220

Nitoaz cố định N 2 bên trong dị bào nang và nhận được saccaroz từ các tế bào lân cận sau đó truyền nitơ cố định đuợc cho các tế bào trên. Ở các vi khuẩn hiếu khí, cổ định N2 nhu Azotobacter nitoaz được bảo vệ nhờ: [1] Lớp vò nhày bao quanh tế bào cản trở sự khuếch tản của O2 vào tế bào; [2] Vận tốc hô hấp cao nhờ đó O2 bị loại bỏ nhanh; [3] Nitơaz được kết hợp với một protein đặc biệt nhờ đó không bị bất hoạt bởi O2. Nốt rễ cùa các cây đậu thuộc họ Leguminosae tạo thành một protein màu đỏ gọi là leghemoglobin có khả năng liên kết O 2 tự do đủ cho quá trình hô hấp tạo thành ATP nhưng không kìm hãm hoạt tính của nitơaz của vi khuẩn Rhizobium.

Hình 18. ì 6: Cơchể tác dụng của nitơaz. Quá trình di chuyển của 2 electron từferredoxin tới nitơ được lặp lại 3 lần để khửN2thành 2 phàn từ amoni. Cân bằng ở phía dưới bao gôm cả việc khừ proton thành H2. [Theo: Prescott và cs, 2005]. Đáng chú ý, ở đây có sự cộng sinh di truyền giữa hai cơ thể: cây tổng hợp phần protein còn vi khuẩn tổng hợp nhóm hem. Tổng hợp nitơaz không những bị kìm hãm bởi O2 nhưng cũng bời các hợp chất nitơ vô cơ và hữu cơ. Khi thiếu nguồn năng luợng ADP được tích lũy lại và ức chế hoạt tính của enzym. Điều nảy làm tăng cái giá của sự khử N2. 221

Theo tính toán để cố định được 1 mg N Clostridium pasteurianum phải tiêu thụ lg c hữu cơ trong glucoz khi đó vi khuẩn hiếu khí Azotobacter chroococcum thậm chí cần tới 30g. Trong điều kiện đất thiếu Mo một số vi khuẩn có thể tổng hợp 2 loại nitơaz khác: chứa Va [vanadi] Fe hay chi chửa Fe. Các cofactor tương tự FeMo-co gặp trong cả 2 nitơaz nói ữên nghĩa là FeVa-co [trong nitơaz vanadi] và 1 nhóm Fe*s [tương tự FeMo-co và FeVa-co] nhưng thiếu cả Mo và Va [ừong nitơaz sắt]. Sự khử nitơ thảnh NH 3 diễn ra qua ba bước, mỗi bước cần 2 electron {hình ỉ 8. Ị 4 và 18.16]. Như vậy 6 electron sẽ được chuyển và cần tổng cộng 12ATP đối với một phân tử nitơ bị khử. Tuy nhiên trẽn thực tế quá trình thường tiêu thụ ít nhất 8 electron và 16ATP vi nitơaz cũng khử các proton thành H 2. Hydro phản ứng với diamin [HN = NH] tạo thành nitơ và hydro. Chu trình vô ích này sản ra một phần N 2 ngay trong điều kiện thuận lợi khiến cho việc cố định nitơ trở nên tốn kém hơn. Các vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh có thể tiêu thụ tới 20% ATP do cây chủ sản ra nitơaz có thể khử một số phân tử chứa liên kết ba [như acetylen, xianit vả azit]: HC s CH + 2H+ + 2e

H2C = CH2

Tốc độ khử acetylen thành etilen được dùng để đánh giá hoạt tính nitơaz. Một khi nitơ phân tử đã bị khử thành amonì, amoni có thể được chuyển thành các chất hữu cơ. Ở Rhizobium [vì khuẩn cố định nìtơ QỘng sinh], có lẽ amoni khuếch tán khỏi tế bào vi khuẩn và được đồng hoá bởi các tế bào của cây đậu bao quanh. Việc đồng hoá amoni có lẽ chủ yếu là tổng hợp glutamin bởi hệ thống glutamin syntetaz - glutamat synthaz [hình 18.11]. Tuy nhiên, allantoin và axit allantoic [các dẫn xuất của Purin] cùng được tổng hợp và được dùng cho việc vận chuyển nitơ tới các phân tử khác của cây. 18.5. TỎNG HỢP CÁC AXIT AMIN Vi sinh vật thay đổi về các nguồn nitơ được sử dụng nhưng hầu hết có thể đồng hoá một vài loại nitơ vô cơ nhờ các con đường đã mô tả. Việc tổng hợp axit amin cùng đòi hỏi sự kiến trúc nên các bộ khung cacbon thích hợp và thông thường đây là một quá trình phức tạp bao gồm nhiều bước. Do nhu câu bảo ton nitơ, cacbon và nâng lượng nên các con đường tổng hợp axit amin, nói chung, được điều hoà chặt chẽ bởi các cơ chế đị lập thể và cơ chế kìm hãm bởi sản phẩm cuổi cùng. E. coỉi, tảo và hau hết thực vật có khả năng tổng hợp tất cả axit amin từ các tiền chất. Các sinh vật khác ke cả người không có khả năng tổng hợp một số axit amin không thay thê và phải thu được chúng trong thức ăn. Một số vi khuẩn lactic như Lactobacillus hoàn toàn không tông hợp được một axit amin nào và phải thu nhận chúng nhờ phân giải protein

222

trong môi trường.Trong mục này không thể trình bày chi tiết con đường sinh tổng hợp của tùng axit amin mà chi giới thiệu khái quát về sinh tổng hợp axit amin.

Hình 18. ỉ 7: Tồ chức của sự đồng hóa. Các sản phẩm sinh tổng hợp dẫn xuẩt từ cảc chất trung gian của con đường lưỡng hỏa. Chú ý 2 phản ứng cố định c o 2 bể sung chủ yếu. [Theo: Prescott VÀ cs, 2005]. 223

Hình 18.17 mô tả quan hệ của con đường sinh tổng hợp axit amin với các con đuờng lưỡng hoá. Bộ khung của axit amin bắt nguồn từ Acetyl-CoA và các chất trung gian của chu trinh TCA, đường phân và con đường pentoz-photphat. Để cho hiệu quả và kinh tế nhẩt các tiền chất dùng cho sinh tổng hợp axit amin được cung cap chi từ một vài con đường lường hoá chủ yếu. Thứ tự dẫn đến các axií amin riêng rẽ phân nhánh từ các con đường trung tâm này. Alanin, aspatat và glutamat được được tổng hợp nhờ sự chuyển amin lần lượt, trực tiếp từ pyruvat, oxaloaxetat và a-ketoglutarat.

Oxaloacetate

Aspartate

Aspartate p-semialdehyde

Hình Ị8.18: Con đường phân nhảnh của tọng hợp axỉt amin. Các con đường dẫn tới metionin, threonine, izoleuxin và lỵzin. Mặc dù ỉ sổ mũi tên biểu thị ỉ bước tuy nhiên hầu hết những sự chuyên hỏa qua lại đêu đòi hòi sự tham gia của ỉ sỗ enzym. [Theo: Prescott và cs, 2005]. Hâu hêt các con đường sinh tổng hợp đều phức tạp hơn và các chất trung gian quen thuộc thường được dùng trong sinh tổng hợp của các họ axit amin có liên quan nhàm mục đích tiêt kiệm hơn. Chăng hạn, lyzin, threonine, izoleuxin và metionin đều được tổng hợp từ oxaloaxetat từ một con đường đồng hoá phân nhánh [hình 18.18], Con đường sinh tổng hợp các axit amin thơm phenylalanin, tyrozin và tryptophan cũng có chung nhiều chât trung gian [hỉnh Ì8.Ỉ9].

224

Pho sphoenolpy ruvate

+ Erythrose-4- [p]

1' Shikimate

Prephenate

Anthranitate

/ V T

Phonyiaianlne I

Tyrosine

Ttyptophan

Hình 18.19: Tổng hợp cácaxit amin thơm [phenyìaỉữnin, tyrozin, tryptophan]. Chú ý: hầu hết các mũi tên đều biểu thị trên ĩ phàn ứng enzym. [Theo: Prescott vỏ cs, 2005]. 18.6. CÁC PHẢN Ú ttG BỔ SUNG Khi xem xét hình ỉ 8. Ị 7 ta thấy các chất trung gian của chu trinh TCA được dùng trong sinh tổng hợp các pyrimiđin và nhiều axit amin. Trên thực tế, các chức năng sinh tổng hợp của chu trình này quan trọng đến mức hầu hết chu trình hoạt động kỵ khí để cung cấp các tiền chất sinh tổng hợp mặc đù NADH là không cần thiết cho việc vận chuyển electron và photphoryl hoá trong sự vẳng mặt của 0 2. Do đó chu trình TCA có vai trò đáng kể trong việc cung cấp cacbon cho sinh tổng hợp và các chất trung gian của chu trình có thể bị cạn kiệt nếu tế bào không có biện pháp duy trì chúng. Tuy nhiên vi sinh vật có các phản ứng hoàn lại các chất trung gian của chu trình giúp cho chu trình TCA cỏ thể hoạt động liên tục khi sinh tổng hợp đang diễn ra mạnh mẽ. Các phản ứng thay thế các chất trung gian của chu trình được gọi là các phản ứng bổ sung [anaplerotic reactions]. Hầu hết vi sinh vật cỏ thể thay thế các chất trung gian của chu trình TCA bằng có định CƠ2 , ừong đó CO2 được chuyển hoá thành cacbon hữu cơ và được đồng hoá. cần phân biệt là, các phản ứng bổ sung không đảm nhiệm cùng chức năng như con đucmg cố định CO2 cung cấp cacbon cần thiết ở các cơ thể tự dưỡng, c ổ định CO2 ở các cơ thể tự dưỡng cung cấp hầu hết hoặc toàn bộ cacbon cần cho sinh trường. Các phản ứng bổ sung cố định CO2 chỉ nhằm thay thế các chất trunggian và duy trì cân bàng trao đổi chất. Thường thường CO2 được gắn vào mộtphân tử chất nhận [Pyruvat hoặc photphorusenolPyruvat] để tạo thành chất trunggian cùa chu trình là Oxaloaxetat [hình

225

18.17]. Arthrobacter globiformis và nấm men sử dụng Pyruvat-carboxylaz xúc tác phàn ứng này: Pyruvat + C 0 2 + ATP + H20 — —

» Oxaloaxetat + ADP + Pi

Enzym trên cần COfactor là biotin và sử dụng năng lượng của ATP để liên kết CO2 vào Pyruvat. Biotin thường là cofactor của các enzym xúc tác phản ứng carboxyl hoá. Do có chức năng quan trọng như vậy nên biotin là yếu tố sinh trưởng cần thiết đối với nhiều loài vi sinh vật. Các vi sinh vật khác như E. coli, Salmonella typhìmurium lại sử dụng enzym photphoenolpyruvat-carbox ylaz xúc tác phản ứng dưới đây: Photphoenolpyruvat + CO2 -> Oxaloaxetat + Pi

GKAlesMtầto H o

CHU TR ÌN H G LIO X Y LA T

H -U -O -

CKS1ỞK*18t« Q LYO XYLATE C Y C LE

C ltrsl*

1—C— [I 0* o C -o-~c-c H

i ầữữĩì-m *

i f . - ĩ i-y.i

u»

Fum arat*

H 0 / y

1 /4 ỉ— — H—A— c— C o

°0.

H -^ -H

Suectnyl-CoA Ov*rall •quatlon; 2 A c « t y i - C o A 4. f a d

♦ 2N A D ' ♦ 3 H 0

— ► 0*ílo*cétit» ♦ 2CoA-» FADH.+ 2NADH *

ĨH

Hình 18.20: Chu trình glioxylat. Chú ý: Các enzym của chu trình TCA ở phần dirới được bỏ qua. [Theo: Prescott và cs 2005]. 226

Một số vi khuẩn, tảo, nấm và động vật nguyên sinh có thể sinh trưởng với nguồn cacbon duy nhất là axetat bằng cách sử đụng axetat để tổng hợp các chất trung gian của chu trình TCA trong chu trình glioxylat [hình 18.20]. Chu trình được thực hiện nhờ hai enzym đặc biệt - Izoxitrat liaz và malat synthaz - xúc tác các phản ứng sau: T_izoxurai ÍV< lzoxitrat — — ■ — Succínat + Glioxylat Glioxylat + Acetyl-CoA

malatsin taza— sm_t££a

\> Malat + C o A

Chu trình glioxylat, thực ra là một chu trình TCA cải biến. Hai phản ứng loại carboxyl của chu trình TCA [bước Izoxitrat dehitrogenaz và ữ-ketoglutarat dehitrogenaz] được bỏ qua giúp cho việc chuyển hoá Acetyl-CoA để tạo thành Oxaloaxetat mà không để mất cacbon của Acetyl-CoA như C 02. Theo cách này, axetat và bất kỳ các phân từ nào được chuyển hoá thành axetat đều có thể đóng góp cacbon vào chu trình và giúp cho sinh trưởng của vi sinh vật. 18.7. TỐNG HỢP CÁC PURIN, PYRIMIDIN VÀ NƯCLEOTIT Sinh tổng hợp của purin và pyrimidin là sống còn cho mọi tế bào vì các phân từ này được dùng để tổng hợp ATP, một so cofactor, axit ribonucleic [ARN], axit deoxyribonucleic [ADN] và các thành phần quan trọng khác của tế bào, Hầu hết vi sinh vật có thể tổng hợp các Purin và pyrimiđin cho bản thân vỉ các chất này có vai trò quyết định đổi với chức năng của tế bào.

Glycine

Vy gj

Nhỏm format từ acid folic

Nittf amide của glutamine Hình 18.21: Sinh tổng hợp Purin.

Chú ỷ: Sự chỉ dẫn các nguồn N và c của bộ khung Puriti. [Theo: Prescott và cs, 2005].

Purin và pyrímiđin là các bazơ nitơ vòng chứa một số nối đôi và có các đặc tính tham rõ rệt. Purin gồm 2 vòng nối với nhau, còn pyrimidin chỉ có một vòng {hình ĩ 8.21 và ĩ 8.23]. Trong vi sinh vật thường gặp các purin adenin và guanin và các pyrimidin uracyl, xitozin và thymine. Một bazơ purin hoặc pyrimidin nối với một đường pentoz [riboz hoặc deoxyriboz] là một nucleozit. Một nucleotit là một nucleozit nối với một hoặc trên một nhóm photphat liên kết với đường.

18.7.1. Sinh tổng hợp Purin Con đường sinh tổng hợp các purin là một thứ tự phức tạp gồm 11 bước trong đó 7 phân tử khác nhau góp phần vào bộ khung purin cuổi cùng [hình Ỉ8.2Ỉ]. Vì con đường mở đầu với ribo-5-photphat và bộ khung purin được kiến trúc trên đường này nên sản phẩm purin đầu tiên của con đường là nucleotit axit inosinic chứ không phải là một bazơ purin tự do. Trong sinh tổng hợp của purin cofactor axit folic đóng vai trò rất quan trọng. Các dẫn xuất của axit folic đóng góp cacbon 2 vả 8 vào bộ khung purin. Trên thực tế, thuốc sulfonamit kìm hãm sinh trưởng của vi khuẩn là do ửc chế tổng hợp axit folic. Điều này sẽ ảnh hưởng đến sinh tổng hợp của purin vả các quá trình khác cần axit folic. Một khi axit inosinic đã được tạo thành, các con đường tương đối ngắn sẽ tổng hợp adenosine monophotphat và guanozin monophotphat [hình 18.22] và sản ra nucleozit diphotphat và triphotphat bàng cách chuyển photphat từ ATP. ADN chứa deoxyrìbonucleotit [riboz thiếu một nhỏm hydroxyl trên C2] thay cho ribonucleotit gặp trong ARN. Các deoxyribonucleotit xuất hiện từ sự khử của các nucleozit diphotphat hoặc nucleozit triphotphat qua hai con đường khác nhau. Một số vi sinh vật khử triphotphat nhờ hệ thống cần cofactor vitamin B 12. số khác, như E. coli, lại khử riboz trong nucleozit diphotphat. Cả hai hệ thống đều sử dụng một protein nhỏ chứa s gọi là thioredoxin làm tác íihân khử. Hỉnh ĩ 8.22. Sinh tổng hợp adenosine monophosoahíe và Guanozin Monophotphat. 228

18.7.2. Sinh tổng họp pyrimidin Sinh tổng hợp pyrimidin mở đầu với axit aspartic và cacbamoyl-photphat [một phân từ cao năng được tổng hợp từ C 0 2 và amoni] [hình 18.23]. Aspatat e-cacbamoyltransferaz xúc tác việc ngưng tụ hai cơ chất này để tạo thành cacbamoyl-aspatat, sau đỏ chất này được chuyển thành sản phẩm pyrimiđìn đầu tiên đó là axit orotic. Sau khi bộ khung pyrimidin được tổng hợp, một nucleotit sẽ được tạo thành bằng cách thêm vào ribo-5-photphat nhở tác dụng của chất trung gian cao năng 5photphorusribosyl-l-pyrophotphat. Do đó việc kiến trúc vòng pyrimidin được hoàn thành trước khi riboz được thêm vào trái với việc tổng hợp vòng Purin bát đầu với ribo-5photphat. Việc loại carboxyl hoá của orotiđin monophotphat sản ra uridin monophotphat và cuối cùng uridin triphotphat và cytidin triphotphat.

Hình ỉ 8.23: Tổng hợppyrimìdin.

229

PRPP ỉà axit 5-photphorusriboz I- pyrophotphorusric, chẩt cung cắp chuôi ribo-5'photphat. Phần dẫn xuất từ cacbamoyỉphotphat được in đậm. [Theo: Prescott và cs, 2005]. Pyrimiđin thứ ba phổ biến là thymine - một thành phần cùa ADN. Riboz trong các nucleotit pyrimidin bị khử theo cùng cách như trong các nucleotit purin. Sau đó deoxyuriđin monophotphat được metyl hoá với dẫn xuất của axit folic đế tạo thành deoxithymidin monophotphat {hình 18.24].

Hình 18.24: Tổng hợp deoxithymìdin monophotphat. Chú ý: deoxìthymidỉn khác với deoxyuridirt ở chỗ có thêm nhóm metyl [Theo: Prescott và cs, 2005]. 18.8. TỎNG HỢP LIPIT Vi sinh vật chứa nhiều lipit đặc biệt là ở màng tế bào. Lipit thường chứa các axit béo hoặc dẫn xuất cùa axìt béo. Axit béo là các axỉt monocacbonxylic với các chuỗi alkyl dài thường có một số chẵn cacbon [chiều dài trung bỉnh là 18 cacbon]. Một số có thể là chưa bão hoà nghĩa là có một hoặc ữên một nối đôi. Hầu hết axit béo của vi sinh vật là chuỗi thẳng nhưng có một số phân nhánh. Các vi khuẩn gram âm thường có các axit béo cyclopropan [tức là các axit béo chửa một hoặc trên một các vòng cyclopropan trong chuỗi]. Việc tổng hợp các axit béo được xúc tác bởi phức hệ syntetaz axit béo với Acetyl' CoA và malonyl-CoA như cơ chất và NADPH như chất cho electron. Malonyỉ-CoA dẫn xuất từ sự carboxyl hoá của Acetyl-CoA với sự tiêu thụ ATP. Việc tổng hợp diễn ra ‘sau khi axetat và malonat đã được chuyển từ CoA đến nhỏm sulíĩhidril của protein mang acyl [ACP, acyl carrier] là một protein nhỏ mang chuỗi axit béo đang sinh trưởng trong tổng hợp. Ờ mỗi thời điêm syntetaz lại thêm 2 cacbon vào đầu carboxyl của chuỗi axit béo đang sinh trưởng ừong một quá ưình gồm hai chặng {hình ] 8.25]. Trước hết, maìonyl-ACP phản ứng với acyl-ACP axit béo để sản ra C 0 2 và một acyl-ACP axit béo có 2 cacbon dài hom. Việc mất đi CƠ2 hướng cho phản ứng hoàn thành. Ở đây ATP được dùng để bổ sung CO2 vào Acetyl-CoA tạo thanh malonyl-CoA. Cũng CO2 như vậy mất đi khi malonyl-ACP chuyền các cacbon cho chuỗi. Do đó CO2 là cần thiết cho tổng hợp axit béo nhưng không

230

phải luôn luôn được cố định. Trên thực tể, một số vi sinh vật cẩn CO2 để sinh trưởng tốt nhưng chúng vẫn có thể sinh trường thuận lợi khi không có CO2 mà có mặt một axit béo như axit oleic [một axit béo 18 cacbon không bão hoà]. Trong chặng thứ hai của tổng hợp nhóm a-keto xuất hiện từ phản ứng ngưng tụ ban đầu bị loại đi trong một quá trình ba bước bao gồm hai sự khử và một sự loại nước. Sau đó axií béo sẵn sàng cho việc bổ sung thêm 2 nguyên tử cacbon nữa.

Hình 18.25: Tổng hợp axit béo. Chu trình được lặp lại cho tới khi chiều dài chuỗi thực sự đã đạt đtrợc. ACP = acyl carrier protein [protein mang acyl]. [Theo: Prescott và cs, 2005]. Các axit béo không bão hoà được tổng hợp theo hai con đường. Các tế bào nhân thật và vi khuẩn hiếu khí như Bacillus megaterium sử dụng con đường hiếu khí với sự tham gia của cả NADPH và O 2: o

n II

R—[CfỈ2 ] 9 —ế —SCoA + NADPH + H+ 0 2— R - C H =CH-[CH2]7 - C — SCoA + NADPH+ + 2H20

Một nối đôi tạo thành giữa các cacbon 9 và 10 và 0 2 bị khử thành nước nhờ các electron do cả axit béo và NADPH cung cấp. Các vi khuẩn kỵ khí và một so vi khuẩn hiếu

231

khí tạo Fa các nối đôi trong quả trình tổng hợp axit béo bàng cách loại nước các axit béo hydroxy. Oxy không càn cho việc tổng hợp nối đôi theo cách này. Con đường kỵ khí hoạt động ở một số vi khuẩn gram âm quen thuộc [ví dụ: E. coỉi vả Salmonella typhimurium], vi khuẩn gram dương [ví dụ: Lactobacillus plantarum vả Clostridium pasteurianum] và vi khuẩn lam. c h 2o h

i=0 y-

Dihydroxyacetona phosphate '

C H ,0 ® MADH + hf

NAD‘ CH.OH

HO— CH

Glycwol 3-phosphate

9H.O® 0

2 R— C - C o A 0

Í Ị H .- O - C - R ,

^ “ C - 0 -ỌH

1 CHtO ®

Ỹ . lỉ —o —

c~ R 1

Rj — c — o - C H

Phosphatldic acid C TP

Q II

C H ,- 0 “ C - R , CH,

II ĩĩ R4—c —o —CH ỉ _ _ c Hj—0 —[g] [g]

COP-diaeyiglycerot

0 —cytiổinB

CH.OH

Sarina

R.COOH

Q II

CH, i

R — c ~ 0 ~ CH

q [I c R,

ỷ^CMP Phosphatidyl sarl riB

Ị - co,

Ọ

ìí

CH, — o — c — R,

THacylgỉycerol

ịỊ

CH,— 0 — C — R.

II I R, —c - 0 ~ CH I CH - 0 -

o II p — o - CH2— C H ,-

Phospíiaíldylâthanolamin# Hình 18.26: Tồng hợp trỉacylglyxerol và photpholipit. [Theo: Prescott và cs, 2005].

232

Các vi sinh vật nhân thật thường dự trữ cacbon và năng lượng ở dạng triacylglyxerol, glyxerol được este hoá vói 3 axit béo. Glyxerol xuất hiện từ sự khử dihydroxyaceton photphat [là chất trung gian của đường phân] thành glyxerol-3-photphat, sau đỏ glyxerol-3photphat được este hoá vói 2 axit béo để cho axit photphatidic {hình 18.26]. Photphat bị thuỷ phân khỏi axit photphatidic tạo thành diacylglyxerol và axit béo thứ ba được gắn vào để sản ra một triacylglyxerol. Photpholipit là thành phần chủ yểu của màng tế bào nhân thật và hầu hết tế bào nhân nguyên thuỷ. Tổng hợp photpholipit cũng thường diễn ra theo con đường của axit photphatidic. Một chất mang đặc biệt-cytidin diphotphat [XDP]-đóng vai trò tương tự vai trò của các chất mang của uridin và adenosine diphotphat trong sinh tổng hợp hidrat cacbon. Chẳng hạn, vi khuẩn tổng họp photphatidintanolamin [một thành phần chù yếu của màng tể bào] qua việc tạo thành XDP - diacylglyxerol đầu tiên [hình 18.26]. Sau đó dẫn xuất XDP này phản ứng với serin để tạo thành photpholipit photphatidilserin và qua việc loại carboxyl sẽ xuất hiện photphatidintanolamin. Theo cách này, một lipit màng, phức tạp được tạo nên từ các sản phẩm của đường phân, sình tổng hợp axit béo và sinh tổng hợp axit amin. 18.9. TỎNG HỢP PEPTIDOGLYCAN Hầu hết thành tế bào vi khuẩn chứa một phân tử lớn, phức tạp bao gồm các chuỗi polixaccarite đài tạo thành bởi các nhánh luân phiên axit N-Acetylmuramic [NAM] và NAcetylglucoz semin [NAG]. Gắn vào các nhánh NAM là các chuỗi pentapeptit. Các chuỗi polixaccarite được liên kết với nhau bởi các pentapeptit hay bởi các cầu nối gian - peptit phức tạp cùa peptidoglycan, dĩ nhiên, càng đòi hỏi một quá trình sinh tổng hợp phức tạp, đặc biệt còn vì các phản ứng tổng hợp diễn ra ở cả bên trong và bên ngoài màng tế bào. Tổng hợp peptidoglycan là một quá ừình nhiều bước và đã được nghiên cứu chi tiết ờ vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus. Ở đây cỏ sự tham gia cùa hai chất mang là uridin điphotphat [UDP] và bactoprenoỉ [hình 18.27]. Bactoprenol là một alcohol 55 cacbon gắn vào NAM bởi một nhóm pyrophotphat và vận chuyển các thành phần của peptidoglycan qua màng kỵ nước.

ò-

Hình 18.27: Bactoprenolpyrophotphat. Chú ý: Chẩt này được gắn vào NAM [Theo: Prescott và cs, 2005]. 233

Tổng hợp peptidoglycan [hình 18.28 và 18.29] diễn ra qua 8 bước: 1. Các dẫn xuất UDP của axit N. Acetyỉmuramic và N-Acetylglucozsamin được tổng hợp trong tế bào chất. 2. Các axit amin lần lượt được thêm vào UDP-NAM tạo thành chuỗi pentapeptit [2 D-Alanin tận cùng được thêm vào ở dạng dipeptit]. Năng lượng cùa ATP được dùng để sản ra các liên kết peptit nhưng không có sự tham gia của tARN và riboxom.

C ytoplasm

UDP -

NAM

j r L-Aìa

ầ r D'GIu

» ^

O-AI*

L-Lys [DAP]

ý * n -A is— B-Ai*

UDP —NAM —p s n ta p s p tid a

__-^CyclOMrln*

P srrta p ep tiđ t

\ €]

P ín ta p e p tid *

l o 0*1* [ỆKễ>-NAM-NAG • i 1! .

* - 4'■■. lv'.. V- > VTí, ■ ■„

■v> fV'if •»rt ^ ừV .

h ’ ỷ-

V r

Virion có kích thước nhỏ [20-30 nm]. Capsid dạng khối đa điện, không cỏ vỏ ngoài, chứa các protein VP1, VP2, VP3 nằm trên mặt virion, VP4 nằm bên ưong liên kểt với ARN.

276

Lõi chứa genome ARN đơn, [+] cuộn chặt trong capsid. Ở virut bại liệt đầu 5’ liên kết với peptit vpg [thay cho mũ], đầu 3’ gán đuôi poly [A]. Phần mã hoá của genome được chia làm 3 phần PI, P2 và P3. P1 mã hoá cho protein cấu trúc VP1, VP2, VP3 và VP4. P2 mã hoá cho các protein 2A, 2B và 2C. 2A ià proteaz ngăn cản dịch mã của tế bào chủ. 2B và 2C cần cho sự sao chép, trong đó 2C gắn với ARN, có hoạt tính ATP-az và GTP-az. Polymeaz chính của virut là C3Dpro tham gia phân cắt polyprotein nhưng có điểm cắt khác 2a. b- Hấp phụ và xâm nhập - Virut gắn vào thụ thể CD 155 trên bề mặt tế bào, vị trí bám là một “hèm” [canyon] trên bề mặt capsid. - Virut xâm nhập theo cơ chế thực bào, tạo endoxom. - Bơm proton trong endoxom tạo pH khoảng 5, gây biến tính protein capsid, làm thay đổi cẩu hình, lộ ra axit amin kỵ nước [không phân cực]. - Các axit amin này tương tác với lớp lipit của màng enđoxom , giải phóng ARN vào tế bào chất. c- Phiên ma, sao chép và dịch mã - Phiên mã và sao chép là cùng 1 quả trinh và sử dụng enzym như nhau. - VPg có chức năng mồi trong sao chép. - ARN genome có chức năng mARN, tham gia dịch mã tạo polyprotein. Polyprotein lại được proteaz phân cắt thành các phân tử đơn lẻ, có chức năng khác nhau. - Protein 3Dpo1 là ARN polymeaz tiến hành tổng hợp sợi ADN [-]. Sợi này sau đó được dùng làm khuôn để tổng hợp genome. - Nằm trước vùng mấ hoá ở đầu 5’ là cấu trúc bậc 2 IRES là “bến đỗ của riboxom” nhờ vậy mà quá trinh dịch mã không cần mũ. d- Lắp ráp và giải phỏng. - Trước hết tạo protome 5S gồm VPO, VP1 và VP3 . - 5 protome tạo pentame J2-M S. 12 pentame tạp procapsid 73S, chứa 60 protome. - ARN kết hợp với vỏ capsid tạo provirion 155S. - Khi VPO phân cắt thành VP2 và VP4 thì provừion sẽ trở thành virion hoàn chinh 155S.

277

- Virut được giải phóng do tan bào, đó là hệ quả của việc virut tạo enzym ức chế các quá trình phiên mã, địch mà của tế bào. Virut được phóng thích tiếp tục lây nhiễm vào các tế bàữ khác. 19.2.2. ì .4. Reíroviridae Gồm các chi: ỉ. Avian-ỉeukosis-sarcoma - Virut sarcoma Rous [RSV] gây ung thư ờ gia cầm. - Virut gây bệnh nguyên hồng cầu ở chim [AEV - avian erythroblasttosis vìrut]. - Virut gây bệnh bạch cầu tuỷ bào [MC - myelocytomatosis]. 2. Mammalian typ-C - Virut gây ung thư bạch cầu chuột Moloney [M oM LV-Moloney murine leukema]. 3. ViruttypB - Virut gây ung thư vú chuột [MMTV - Mouse mammary tumor virut], 4. Virut typ D - Virut nhiễm ở khỉ Mason-Pfizer [MPMV - Mason - Pfizer Monkey virut]. Virut gây ung thư bạch cầu tể bào T ở người [HTLV - Human T-cell leukemia virut] hoặc ở bò [BLV - borine leukemia virut]. 5. Lentivirut - Virut gây suy giảm miễn dịch ở người [HIV-1, HIV-2], Visna/Msedi. 6. Spumavirut - Virut tạo bọt ở người. a- Cấu trúc

- v ỏ ngoài có nguồn gốc từ màng sinh chất với các protein: + Protein gai gp 120. + Protein gai gp 41. Hai glycoprotein này gắn với nhau nhờ liên kết s - s để tạo gp 160. + Protein vỏ ngoài P17 - P18. - Capsid dạng khổi trụ, chứa protein capsid P24 - P25. - Lõi: + Genome lả 2 sợi ARN đơn. [+] giống nhau. + Chứa protein nucleocapsid P9 - P7 gắn quanh genome. + Chứa enzym phiên mã ngược [RT], integraz, Proteaz. b- Hẩp phụ và xâm nhập của HỈV - Protein gai gp 120 gắn vào thụ thề đặc hiệu trên bề mặt té bào, ví dụ CD4 của tế bào T. - Tiến hành dung hợp thông qua trung gian là vùng kị nước của protein màng TM. - Tuỳ thuộc vào loại virut và tế bào chủ, sự dung họp cũng xảy ra sau khi virut vào tế bào theo con đường nhập bào. - Virut cởi vỏ và nucleocapsiđ vào tể bào chất. c~ Phiên mã ngược - Phiên mã ngược xảy ra bên trong nucleoprotein trong tế bào chất. - Sơ đồ ARN [+]. Mũ-R-Ư 5 -PB s -gag-pol-env-U3 -R-AA AA

mARN có mũ và đuôi poỉy A. -1 phân tử tARN cùa tể bào đặc hiệu cho mồi loại virut gán. vào trinh tự tương bù tại vị trí gắn mồi [PBS] và tiến hành phiên mă ngược tạo cADN. - Enzym RT hoạt động nhu một ADN polymeaz phụ thuộc ARN và cũng có hoạt tính ribonucleaz H. + Bước nhảy ỉ: Trình tự R của cADN nhày sang bắt cặp với trình tự R của ARN và tổng hợp cADN. + Ribonucleaz H phân huỷ toàn bộ genome ARN cũ chỉ còn để lại một mẫu ngán [trình tự p+] tại vùng env để làm mồi. + Enzym RT bát đầu tổng hợp sợi ADN [+] về phía U5 để tổng hợp U3 R U5. + Bước nhảy 2: đoạn Ư3-R-Ư5-PBS nhảy để PBS của ADN [+] bắt cặp với PBS của ADN [-].

279

+ Cả 2 sợi đều được kéo dài tạo phân tử ADN kép provirut với 2 đâu là 2 đoạn lặp đảo chiều LTR [long terminal repeats] gồm U3-R-U5. d- Gắn vào nhiễm sắc thể - Protein nền matrix có vai trò vận chuyển ADN vào nhân. - Provirut trong nhân khép vòng. - Intergraz tạo điểm đứt sole trong ADN tế bào chủ tại trình tự nhận diện provirut [att]. - ADN virut được cài xen vào ADN vật chủ tạo phân tử lai. - Các bazơơ không bắt cặp sẽ bị ỉoại bỏ và một đoạn khuyết ngắn sệ được lấp đầy nhờ ADN polymeaz. Kết quả là loại ra 4 cặp bazơơ khỏi ADN provirat. e- Sao chép genome và dịch mã - Một khi được cài xen, genome virut nằm dưới sự kiểm soát của tế bào chủ và được phiên mã nhờ ARN polymeaz II của tế bào. - Đoạn U3 chứa promoter và enhancer. Phiên mã [cũng là sao chép] bắt đầu từ vị trí +] của trình tự R tạo bản sao mARN 35S giống với genome virut, được gẳn mũ và đuôi poly [A], vừa dùng để dịch mã tạo protein dùng làm genome. - Nhờ dịch khung [frameshift] mà tạo thành poly protein gag-pol. - Proteaz của virut phân cat polyprotein thành các protein cấu trúc và không cấu trúc riêng lè. - Sự cắt nối tạo mARN 24 s, gắn mũ, đuôi để mã hoá cho protein env [protein vỏ ngoài]. - Gen gag được ưu tiên dịch mã nên protein cấu trúc vượt trội protein không cấu trúc. Cáe protein tích luỹ trong tế bào chất trong đó 1 sổ bị cắt trong quá trình chế biến sau lắp ráp. f- Lắp ráp và giải phỏng - Các thành phân khác nhau của virut liên kêt với nhau cả trước khí polyprotein bị căt thành các protein riêng lẻ. - Hai sợi ARN [+] liên kết cộng hoá trị với nhau tại đầu 5’ và gắn với nucleoprotein. - Protein capsid gắn với protein nền M và với nucleoprotein, - Protein vỏ ngoài cài sẵn vào màng sinh chất. Nucleocapsid nảy chồi ra ngoài.

280

ỉ 9.2.2. ỉ .5, Togaviridae Gồm các chi: - Aỉphavirut có các virut viêm não ngựa Miền Tây, viêm não ngựa Miền Đông, viêm não ngựa Venezuela, virut rừng Semliki, virut Sindbis và gây nhiễm ở động vật không xương sống. - Rubivirut: virut Rubella [sởi Đức]. - Pestivirut: virut gây tiêu chảy bò, tả lợn. - Arterìvirut: virut viêm động mạch ngựa, a- Cấu trúc

Virut có kích thước trung bình [50-70nm]. v ỏ ngoài rất dầy với các gai cấu tạo từ

các protein E l, E2, E3.

+ Capsid: dạng khối đa diện cấu tạo từ các protein c. Đầu c hình thành giá đỡ cứng ở phía ngoài của capsid lõi. + Lõi: ARN đom, [+] đầu 3’ và 5’ cỏ các đoạn tương bù nên bắt cặp với nhau.

281

ố- Hấp phụ và xâm nhập - Gai glycoprotein gắn vào protein thụ thể bề mặt của tế bào mà bản chat còn chưa rõ. Dùng kháng thể gắn E2 thì virut không vào tế bào được. - Virut vào tế bào theo cách nhập bào, tạo endoxom. - Endoxom dung hợp với lyzoxom. pH thấp trong endoxom làm thay đổi cấu hình protein El và E2 dẫn đến đung hợp màng, giúp virut thoát ra tế bào chất. - Riboxom gắn trên protein c dẫn đến cởi vỏ. c- Phiên mã và dịch mã sớm

- Dịch mã từ bộ 3 AUG tạo protein pl234, là do đọc mã vượt qua cođon đừng. - Enzym cắt protein pl234 để được 4 protein: + NSpl cỏ hoạt tính polymeaz cho cARN và ARN mũ của virut. + NSP2 là protein dùng cắt polypeptit, có hoạt tính polymeaz cARN và tổng hợp ARN 26s dưới genome. + NSP3 là protein được photphoryl hoá, chưa rõ chức năng. + NSP4 là ARN polymeaz phụ thuộc ARN, protein 123 cắt thành 3 protein, trong đó protein thứ 2 là proteaz dùng để cẳt polypeptit. d- Sao chép genome - Dịch mã tạo protein NS [không cấu trúc]. - Protein NS hình thành phức hợp với ARN polymeaz để tạo ARN [-] từ sợi ARN kép trung gian, tiến hành phiên mã tạo vARN và mARN [gán mũ và đuôi] để tổng hợp protein. - Phiên mã mARN 26S e- Phiên mã và dịch mã muộn - Từ V-ARN phiên mã tạo sợi ARN kép trung gian để phiên mã tạo mARN, gắn mù và đuôi. - Dịch mã tạo các protein E l, P62,E2 và3], gắn vào màng mạng lưới nội chất, El, P62, E2 và E3 kết hợp với nhau tạo gai bề mặt dạng trime.

282

f- Lắp ráp và giải phóng: - Protein cấu trúc [C] gán với vARN để tạo provirion, xâm nhập vào mạng lưới nội chất, theo kiểu thực bào, sau đó hoàn thiện tạo virion, ra khỏi mạng lưới nội chẩt tạo bọng rồi ra khỏi tế bào nhờ dung hợp màng bọng với màng sinh chất. Ỉ9.2.2.2. VirutARNđơn, âm Ba họ đại điện là Rhabdoviridae, Orthomyxoviridae và Paramyxoviridae. ỉ 9.2.2.2. Ị- Rhabdovỉridae Có 2 chi là: [1] Vesiculoviriit gây bệnh chốc mép và ở động vật không xương sống. [2] Lyssavirut gây bệnh đại, ngoài ra virut này cũng gây bệnh ở thực vật. a- Cẩu trúc Virut có hình viên đạn, kích thước 70x170nm. 'V ỏ ngoài là lipoprotein. Trên bề mặt có protein G, tạo gai glycoprotein. Bên trong vỏ ngoài là ỉớp protein nền [M]. - Nucleocapsid xoắn, gồm các protein: Protein nucleocapsiđ [N] gắn với genome, Photphoprotein [P], protein L. - Lõi chứa ARN đơn, [-] với đầu lặp đảo chiều cho phép bắt cặp với nhau tạo cấu trúc cán chảo. - ARN polymeaz phụ thuộc ARN gắn vào cấu trúc lõi. b- Hấp phụ và xâm nhập - Virut gắn protein G vào thụ thể bề mặt, chua rõ bản chất, của tế bào, có thể là photohatidyl serin. - Khi gắn không cần năng lượng nhưng khi xâm nhập cần 37°c. Nếu ở 10°c thì không xâm nhập được. - Virut vào theo iối nhập bào tạo endoxom. Endoxom dung hợp với lyzoxom. - pH thấp trong endoxom cảm ứng để vỏ ngoài virut dung hợp với màng endoxom và giải phóng nucleocapsid vào tế bào chất.

283

- Phiên mã và sao chép genome tiến hành trong cấu trúc nucleocapsid lối. c- Phiên mã mARN - Trong tế bào chất gARN kháng enzym ribonucleaz khi tạo phức với protein N.

- Protein L cùng với protein p và các yếu tố của tế bào tạo phức hợp gắn vào đầu 3’ phức hợp tự photphoryl hoá. - Phiên mã bắt đầu từ đầu 3’ và kết thúc sau khi gắn đuôi poỉy [A] vào gen đầu tiên, tạo ra nhiều loại mARN để tổng hợp protein N, p, M, G và L. - Tổng hợp protein: + Từ các mARN tương ứng tổng hợp các protein N, p, M, G, L. + Protein G cài vào màng mạng lưới nội chất, tạo bọng rồi mang ra gắn vào màng tế bào chất. + Protein M sắp xếp sát màng tế bào và gắn với protein G. d- Sao chép genome - Khi lượng protein N tăng lên sẽ phong bế vị trí khởi đàu phiên mã trên genome [vARN]. - Sợi mARN có chiều dài đủ [bằng genome] được tổng hợp nhờ phức hợp polymeaz. + Các yếu tố của tế bào chủ có vai ứò quan trọng trong sao chép genome virut. + Lượng protein p tăng lên là cần thiết đối với quá trình sao chép. + Hầu hết gARN nhanh chóng tạo cấu trúc ribonucleoprotein. Một sổ gARN dùng để phiên mã mARN. e- Lẳp ráp vỏ giải phóng - Phức hợp ribonucleoprotein lỏng lẻo liên kết với protein M, ngăn cản sự sao chép và phiên mã của virut. - Khi cỏ nhiều protein M hơn, nó sỗ gán vào ribonucleoprotein xoắn chặt, ngăn cản sự phiên mã và đưa chúng tới màng sinh chất để nảy chồi ra ngoài. 19.2.2.2.2. Orthomyxoviridae Gồm 1 chi Orthomyxovirrus với các virut cúm A, B, c , cúm gia cầm H5N1,... a- Cẩu trúc

Virut đa hình thái, đường kính 80-120nm - Vỏ ngoài có các protein sau: + Protein heamagglutinin [HA] hay gai H, gồm 2 tiểu đom vị HAI và HA2. Virut cúm A có 16 gai H. + Protein neuraminidaz [NA] hay gai N. Virut cúm A có 9 loại gai N. + Protein kênh ion M2. + Protein nền M l. - Capsid dạng xoắn gồm phức hợp ribonucleoprotein [RNP], chứa các protein: Protein nucleocapsid [NP], protein polymeaz [PA], protein polymeaz [PB1], protein polymeaz [PB2]. Genome là ARN đon, âm, phân đoạn. Cúm A và B gồm 8 đoạn, cúm c có 7 đoạn ARN. b- Hấp thụ và xâm nhập - Gai H bám vào thụ thể là axit sialic ừên màng tế bào, rồi xâm nhập vào tể bào theo lối nhập bào, tạo endoxom rồi dung hợp với lyzoxom. - pH thấp trong endoxom giúp protein dung hợp [protein F] nằm ẩn phía trong gai H chồi lên, cắm vào màng endoxom để đẩy nucleocapsid vào tể bào chất. Enzym từ lyzoxom cũng có thể phân giải màng endoxom. - Nucleocapsid vào nhân, tỉển hành phiên mã và sao chép trong nhân. c- Phiên mã Phức hợp polymeaz gồm PA, PB1 và PB2. - ARN virut gắn vào các vị trí gắn đầu 3’ và 5’ trên PB1, ARN của tế bào gắn vào PB2.

285

- Virut chiếm đoạt mũ ở đầu 5’ của mARN của tế bào để làm mồi cho mARN của mình nhờ enzym exonucleaz, vì thế nên mới phải chui vào nhân. - Tạo raARN rồi ra khỏi nhân. d- Tồng hợp protein - Tiến hành tổng hợp các loại protein của virut ở ngoài tế bào chất sau đó chui vào nhân để tạo nucleocapsid. e- Sao chép genome Khi protein NP tích luỹ nhiều, chúng sẽ bám và phong bế mũ ở đầu 5’ và các gốc 4-7 A trên ARN của virut, ngăn chặn sự lặp lại của các gốc u của vARN và tạo thành cARN [tức sợi ARN + bổ sung]. - cADN được protein NP bao quanh dẫn đến việc phức hợp polymeaz mất đi protein PA và tiến hành sao chép vARN từ khuôn cARN mới tổng hợp. - vARN được bao bởi protein Np để tạo nucleocapsid. f- Lắp ráp và giải phóng - Phửc hợp RNP hình thành ữong nhân, cùng với protein MI được khuếch tán thụ động vào nhân đồng thòi cũng có sự gắn protein bề mặt virut vào màng sinh chất của tê bào. - MI gắn với RNP dẫn đến vận chuyển ra khỏi nhân. - Protein NA cắt gốc axit sialic để giúp virut nảy chồi thoát khỏi tế bào. 19.2.2.2.3. Paramyxoviriđa Gồm các chi: - Paramyxovirut gồm virut Sendai [á cúm typ 1 ở chuột], á cúm typ lvà 3 ở người. - Rubeỉavừut gồm virut quai bị, Newcastle, á cúm typ 2, 4a, 4b ờ người. Có protein HN. - Morbiỉỉìvirut gồm sỏi, dịch sốt chó [canine distemper]. Có gai H nhưng không có gai N. - Pneumovirut, virut hợp bào hô hấp ở người [HR.SV - Human respiratory syncytial virut]. Không có gai H và N.

286

a- Cẩu trúc Virut có kích thước 125-250 nm. - Vỏ ngoài gồm các protein: + Protein F [dung hợp]. + Protein heamagglutinin neuraminidaz [HN] có hoạt tính gắn và cắt axit nucleic. + Protein nền [M] nằm ngay dưới vỏ ngoài. - Nucleocapsid dạng xoắn gồm: + Genome là một phân tử ARN đơn, [-]. + Protein nucleocapsid [NP] bao quanh genome, liên kết với protein M và các protein L và p. + Protein lớn [L] cỏ hoạt tính polymeaz. + Photphoprotein [P]. b- Hẩp thụ và xâm nhập - Virut gắn gai HN vào thụ thể bề mặt là axit sialic của tế bào ở pH trung tính. - Protein F được proteaz của tế bào chủ cắt và cho phép dung hợp vói màng tế bào để đưa nucleocapsid vào tế bào chất. - Protein M gắn vào protein NP, ức chế tổng hợp mARN và điều này phải được thực hiện trước khi phiên mã sớm. c- Phiên mã mARN - Các gen trên gARN tách biệt nhau nhờ trình tự gắn nằm giữa các gen gọi tát là -ICS [short intercisừonic nucleotit sequences]. Đây ỉà ARN đa gen [polycisữon].

- Các sàn phẩm của các gen chồng lởp và tiếp đỏ là các sản phẩm của các gen p/c/v /D dùng ừong điều hoà chu trinh nhân lên. - Phiên mã tiến hành trong cấu trúc RNP lõi, bắt đầu tại đầu 3’ và kết thúc khỉ thêm đuôi poly [A] vào gen đầu tiên. 287

- số lượng bản sao mARN nhiều hay ít tuỳ thuộc vào sự tái khởi động phiên mã. Phiên mã hết gen này rồi đến gen khác rồi quay lại tái khởi đầu phiên mã để được các protein NP, p, M, F, HN và L. d- Tổng hợp protein - Tiến hành tổng hợp protein từ mARN trong tế bào chất. - Protein F và Hn cài vào màng mạng lưới nội chất, hỉnh thành bọng rồichuyển đến gắn vào màng tế bào. - Protein M liên kết với protein gai trong màng tế bào chất. - Protein NP phong bế vị trí khỏi đầu và ICS cho phép bắt đầu phiên mãsợi cARN [ARN tương bù]. e- Sao chép genome - Từ sợi gARN [-] làm khuôn tổng hợp sợi tương bù cARN [+], rồi đến lượt cARN mới sinh ra làm khuôn để tổng hợp genome ARN. - gARN mới sinh lại làm khuôn để tổng hợp mARN và thêm nhiều cARN. - gARN liên kết với các protein NPt p và L để tạo cấu trúc lôi. /- Lẳp ráp vờ gỉảì phỏng - Protein NP gắn vào vị trí đặc hiệu bao quanh ARN tạo nucleocapsid nảy chồi ra ngoài. - Các protein heamagglutinin - neuraminidaz [HN] cắt axit sialic năm trên bề mặt tế bào cho phép virut thoát khỏi tế bào. ĩ 9.2,2.2.4- Reoviridae Bao gồm các chi: - Orthoreovirut. Virut reo typ 1 ở người. - Rotavìrut. Virut rota gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em. - Orbỉvirut. Virut gây bệnh lưỡi xanh ở gia súc, virut gây bệnh sốt Colorado do ve - Phytoreovirut. Virut bệnh lúa lùn, virut khối u ờ thực vật. a- Cẩu trúc Virut có đường kích trung bình [60-80nm] không có vỏ ngoài, capsid gồm 2 lớp vỏ: - Vỏ capsid ngoài cấu tạo gồm các capxom và các tiểu đơn vị:

288

61 - protein hấp phụ.

Ịil và [J.16 - protein capsid ngoài.

53 - protein capsid ngoài.

- v ỏ capsid trong chứa các protein: s

Ằ.1 - protein capsid ừong [nằm ở bề mặt trong của capsid trong].

a2 - protein capsid trong.

ịx2 - protein lõi.

a4 - protein không cấu trúc.

•S ịj.3 —protein không cấu trúc. ■S Xi - ARN polymeaz. - Genome gồm 10-11 phân tử ARN kép: ✓ LI, L2 và L3: ARN kép dài. s

M l, M2 và M3: ARN kép trung bình.

✓ SI, S2, S3 và S4: ARN kép ngắn. b- Hấp phụ và xâm nhập - Gai VP4 của virut bám vào thụ thể bề mặt glycophorin - A của tế bào lông ruột. - Virut vào tế bào theo cỏ chế nhập bào qua trung gian thụ thể, tạo endoxom. - Màng endoxom dung hợp với màng lyzoxom. Enzym lyzoxom phân giải vỏ capsid ngoài, giữ lại vỏ capsid ừong và tìm cách thoát vào tế bào chất. c- Phiên mã và sao chép - ARN polymeaz phụ thuộc ARN do virut mang theo được hoạt hoá khi vỏ ngoài bị phân huỷ bởi enzym proteaz. - ARN tiến hành phiên mã tạo mARN ứên khuôn sợi ARN [-]. Quá trình thực hiện bên trong vỏ capsid. - mARN có 2 chức năng: mARN và ARN khuôn để tổng hợp sợi tương bù cho genome. - mARN được đẩy qua kênh nằm ở đỉnh capsid vào tế bào chất. d- Dịch mã - mARN tổng hợp trên riboxom các loại protein cấu trúc và không cấu trúc [enzym]. - Protein cấu trúc lắp ráp tạo vỏ capsid trong, bao quanh 11 đoạn ARN [+]. Tiếp đó sợi ARN [+] đuợc dùng làm khuôn tạo sợi ARN [-] tương bù đẻ được genome ARN kép.

289

e- Lap ráp và giải phóng ~ Protein cấu trúc lắp ráp tạo vỏ capsid ngoài bao quanh capsid trong, tạo virion hoàn chỉnh, phá vỡ tế bào ra ngoài. Tế bào lông ruột bị phá huỷ, gây tiêu chảy. 19.2.3. Bacteriophage Bacteriophage [Bacterriophage], viết tắt phage [phage], là virut kí sinh ở vi khuẩn. Genome của chúng cỏ thể lả ADN hoặc ARN, với kích thước nằm trong khoảng từ 2,5 đến 150kb. Phage có thể có chu ưình sống đcm giản - chu trình tan hoặc phức tạp - chu trình tiềm tan, ở đó genome của chúng được cài vào NST của tế bào hoặc hoạt động theo phương thức chuyển vị. Phage được phát hiện từ đầu thế kỷ XX, một cách độc lập, bởi hai nhà khoa học là Twort [1915] và d’Herelle [1917]. Phage được nghiên cứu rất sâu rộng như là một mô hình về virut và như một công cụ để phát hiện những kiến thức cơ bản đầu tiên về ADN [ADN là vật chất di truyền, xác định mật mã di truyền, sự tồn tại cùa mARN và nhiều khía cạnh sinh học phân tử cơ bản khác].

Vì phage kí sinh ở Prokaryota nên chúng thường có trinh tự quan trọng giống như tế bào chủ. Do vậy, chúng còn được sử dụng như là mô hình đơn giản cho nhiều khía cạnh sinh học phân tử khác nhau của Prokaryota. Phage được sử dụng phổ biến như là vectơ tách dòng, liệu pháp gen, sản xuat vacxin. Nhiều enzym do phage mã hóa được dùng trong kỹ thuật đỉ truyên đe noi các đoạn gen và biểu hiện gen trong tế bào Prokaryota...

* Các quả tìn h nhãn lên ở bacteriophage

v ề cơ bản, các bước nhân lên của các bacteriophage trong tế bào vi khuẩn là giống nhau. Tuy nhiên, cũng có những khác biệt ở từng loại. Một số nhân lên theo chu trình tan, số khác lại nhân lên theo chu trình tiềm tan. a. Hẩpphụ'. Trong môi trường địch thể, phage ờ trạng thái chuyển động tự do. Do va chạm ngẫu nhiên, phân tử protein ở đầu mút sợi lông đuôi gắn đặc hiệu vào thụ thể - phân tó polysaccharit, trên bề mặt màng ngoài của E.coỉi. Mỗi loại phage gắn vào một loại thụ thể, có thể là polysaccharit trên bề mặt tế bào Gram [-] hoặc axit teichoic của vi khuẩn Gram [+], số khác chỉ gắn được vào đầu mút của pilì F. b. Xâm nhập: Phage tíểt lyzozim phá hủy peptídoglycan. Bao đuôi co lại, ổng trục đâm xuyên qua thành tế bào, đẩy axií nucleic vào trong tế bào. c. Tổng hợp các thành phần: Sau khi axit nucleic vào tế bào là thời kỳ ẩn [eclipse period]. Không có bất kỳ một virion nguyên vẹn nào được tạo thành. Genome của virut kiểm soát bộ máy tổng hợp của tế bào, ngân chặn sự tổng hợp bình thường của tế bào để chuyển sang tổng hợp các thành phần của phage bao gồm tổng hợp genome và protein [y như kẻ xâm lược trong một quốc gia không phòng thủ]. d. Lắp ráp: Các bộ phận đầu, đuôi, lông, v.v. được tạo thành ờ các nơi khác nhau như trong phân xưởng, sau đó lắp ráp ngẫu nhiên với nhau. Genome ADN được tạo thành nhờ ADN polymeaz mới tổng hợp sau đó chui vào lõi để tạo virion hoàn chỉnh. e. Phỏng thích: Lyzozim do phage tổng hợp phá hủy peptidoglycan thành tế bào. Khi thành tế bào bị phá hủy, sự thẩm thấu sẽ làm cho tế bào trương lên và vỡ ra. Phage giải phóng ra môi trường xung quanh để lặp lại chu trình nhân lên ở tế bào mới. Sau đây là một sổ phage có tầm quan ừọng trong thực tiễn.

[1] Phage M13 Phage cỏ dạng sợi, chứa genome ADN [+] đơn, khép vòng, với kích thước 6,4Kb. MI 3 gắn đặc hiệu vào pili F [pili được mã hóa bời plasmit, gọi Jà yếu to F, chi có ở tế bào “đực”] của E.coỉi thông qua protein phụ [g3p] nằm ữên vỏ ở đầu sợi phage. Sự gắn này cảm ứng làm thay đổi cấu trúc của protein chính tạo nên vỏ capsid khiến toàn hạt co ngắn lại tạo động lực bơm ADN vào tế bào chất. ADN polymeaz của tế bào tổng hợp một sợi bổ sung tạo ADN kép dạng sao chép [RF]. Genome gồm 10 gen nằm sát nhau, có một vùng xen nhỏ [intergenic region] ở đó chứa điểm khởi đầu sao chép [ori]. Phiên mã xảy ra [vẫn nhờ enzym cùa tế bào chủ] tại bất kỳ một ứong số vài promoter, cho đến khi gặp một trong hai điểm kết thúc [terminator]. Quá trình này dẫn đến những gen nằm gần điểm kết thúc được phiên mã nhiều hơn so với các gen nàm xa, và đây cũng là phương thức chủ yếu

291

trong việc điều hòa sự b ểu hiện gen của phage M I3. Tất cả RF đều được tổng hợp như tổng hợp ADN kép bình thường, nhưng sự khởi đầu sao chép cần phải cắt đứt sợi [+] nhờ enzym endonucleaz [sản phẩm của gen 2] để hở đầu 3’-OH, mà không cần mồi. Từ mỗi RF liên tục tạo ra các sợi ADN [+] dành cho đóng gói tạo virion. Các sợi này không dùng được làm khuôn tạo sợi ADN [-] vì ngay sau khi được tồng họp, chúng đã được bao bọc bời protein, sản phẩm của gen 5. cấu trúc này được chuyển ra màng tế bào, ở đó ADN bám vào protein chính của capsid trên màng tế bào rồi chui ra theo loi nảy chồi mà không phá vỡ tế bào. Vi khuẩn nhiễm M I3 vẫn tiếp tục sinh trưởng và phân chia, cho dù với tốc độ thấp hon, tạo ra thế hệ tế bảo mới và giải phóng MI 3. Lượng ADN được chui ra là khác nhau, nên các hạt có kích thước khác nhau. Trong quần thể luôn có những hạt mang nhiều genome và những hạt mang một phần genome. Nhờ cách nhân lên kỳ lạ và cấu tạo genome đặc biệt mà M I3 được sử dụng có hiệu quà trong công nghệ sinh học: - Genome là chuỗi đơn nên được dùng trong giải trình tự. - Dạng trung gian RF [ADN kép khép vòng] như ỉà một plasmit nên được dùng làm vectơ tách dòng. - Không có sự hạn chế về kích thước genome nên có thể gắn một đoạn ADN ngoại lai lớn. - Do không làm tan tế bào, nên có thể duy trì và liên tục tách chiết một lượng lớn ADN tách dòng.

[2] Phage T7 Cũng như các phage khác, T7 cũng có đầu hình khối đa điện gắn với một đuôi ngắn với 6 sợi lông đuôi. Phage T7 có kích thước nhỏ, có genome là ADN kép [khoảng 40 Kb] dạng thẳng. Trước hết đầu mút sợi lông đuôi gắn vào thụ thể LPS trên màng sinh chất. Khi xâm nhập, một đau của genome [gọi là đâu trái] bao giờ cũng đi vào trước, do vậy bản đồ genome đuợc chia theo phần trăm tính từ đầu trái. Ngay sau khi genome vào tế bào chất, ARNpolymeaz phụ thuộc ADN bình thường của E.coli nhận ra 3 promoter của các gen sởm ngay, nằm giữa vị trí 1% và 2%, ở đầu 3’ của genome. Tất cả các sàn phẩm của các gen sớm đều tham gia vào sự điều khiển làm dừng phiên mã của tế bào chủ, chuẩn bị cho sao chép và biểu hiện genome virut.

292

Bản phiên mã sớm được ribonucleaz III của tế bào chù phân cắt thành các mARN, trong đó có mARN mã hóa cho protein kinaz [gp0,7] dùng để photphoryl hóa và làm bất hoạt ARN polymeaz của vật chủ, ngăn cản sự phiên mã của các gen sớm khác. Và tổng hợp một ARN polymeaz [gpl] dùng để phiên mã các gen nằm ở giữa, tham gia vào sao chép ADN T7 và các gen muộn tham gia vào lắp ráp và làm tan bào để giải phóng virut. Các sản phẩm khác, gp2, cũng gắn vào ARN polymeaz của tế bào để làm bẩt hoạt enzym này. ARN polymeaz của T7 có tính đặc hiệu cao với promoter T7, nên ức chế ARN polymeaz của tế bào và dành toàn bộ hoạt động phiên mã cho T7. Sự sao chép genome T7 gồm 3 giai đoạn: a. Khởi đầu diễn ra tại một vị trí nằm ở đầu trái của genome. ARN polymeaz [gpl] của T7 tổng hợp một mồi ngắn từ các protomer tại vùng khởi đầu dùng cho bước khởi đầu. b. Kéo dài từ mồi theo 2 hướng, do 2 enzym gp5 và gp7 của T7 xúc tác. Protein gp5 gắn với thioredoxin để tạo một ADN polymeaz dùng cho tổng hợp ADN từ mồi, theo hưởng 5’ - 3’, do đó tạo thành sợi muộn. Protein gp4 là enzym đa chức năng, có hoạt tính pimaz, helicaz và NTP-az, nó gắn vào mạch ADN đơn duỗi xoắn của phân tử ADN mẹ và chuyển dịch theo hướng 5’ - 3' của ADN nhợ thuỷ phân NTP. Sự mờ xoăn của chuỗi ADN mẹ theo hướng chạc sao chép. Khi gặp vị trí đặc hiệu nhận biết primaz, gp4 sẽ tổng hợp các mồi tetraribonucleotit [pppApCpCpC hoặc pppApCpCpA]. Các mồi này cung cấp đầu 3’-OH để khởi đầu tổng hợp sợi muộn nhờ ADN polymeaz của T7. Protein gp3 là một endonucleaz vả gp6 là một exonucleaz tiến hành phân giải ADN vật chủ để cung cấp các nucleotit làm nguyên liệu cho tổng hợp ADN T7. Gp6 vả ADN polymeaz I của vật chủ tham gia vào loại bỏ mồi mARN. c. Sự tạo thành phân íửADN trùng lặp [concatemer] Do phân tử ARN mồi ở đầu 5’ bị loại bỏ trước khi hoàn thành sao chép, nên mỗi phân tử ADN kép mới tạo thành, cỏ một đoạn ở đầu 5’ không được sao chép và tương ứng với nỏ ờ đầu 3’ của mạch tương bù là đoạn đơn. Các đoạn đcm này của hai chuỗi có trình tự lặp lại cùng chiều, nên có thể gắn với nhau, tạo phân tử ADN đúp [bimolecule]. Những chỗ hở được tổng hợp bổ sung và nối với nhau nhờ ligaz. Concateme được endonucleaz T7 [gp3] cắt tại các vị ừí đặc hiệu ờ cả hai phía tạo thành các đoạn đầu sole, sau đó ADN polymeaz hoàn tất đầu mạch đom [sole] thành phân tử kép đầu bằng, có kích thước của genome J l . Phage trưởng thành thoát khỏi tế bào nhờ lyzozim [gp3,5] làm tan bào. Đáng chú ý là ARN polymeaz rất đặc hiệu với promoter T7, cho nên cỏ thể tiến hành phiên mã bất kỳ trình tự ADN nào nếu có promoter T7. ARN polymeaz của T7 có khả năng phiên mã mạnh gấp 5 lần ARN polymeaz của £ coỉi, do đó thường được đùng để biểu hiện gen trong E. coỉi.

293

[3] Phage T4 T4 là một phage T chăn, có kích thước lớn. Genome là ADN kép, dạng thẳng, chứa khoảng 100 gen với kích thước 1,7x1 o8 bp. Chu trình nhân lên bắt đầu khi lông đuôi bám vào thụ thể bề mặt của E. coỉi, tiết lyzozim phân giải peptidoglycan thành tế bào, rồi bơm ADN vào trong tế bào. Mặc đù genome là dạng thẳng nhưng trong quần thể, các virion chứa genome có ưình tự thay đổi theo kiểu vòng tròn, tức là đổi đầu quay vòng [circular permutation] và có hai đầu lặp lại cùng chiều. Do vậy đề dễ hình dung, người ta thường biểu diễn bản đồ gen của T4 là một vòng ừòn. Ví dụ các virion có thể chứa các genome cỏ trình tự sau đây: ABCDEFGAB. CDEFGABCD, EFGABCDEF, GABCDEFGA,... Một trong những gen được dịch mã đầu tiên là enzym dùng để chặt nhò ADN của tế bào chủ, nhưng không động chạm đến ADN của phage, bởi vì bazơơ cytosin thông thường trong ADN đã được thay thế bởi một bazơơ c cải biến, 5-hydroxy metylcytosin [HMC]. HMC bắt cặp với guanin nên không làm thay đổi chức năng khuôn cùa virut, nhưng sự có mặt cùa nó giúp cho enzym virut phân biệt được axit nucleic của viruí với của tế bào chù. Sự cải biến này làm cho ADN cùa phage kháng lại nhiều enzym giới hạn của tế bào chủ. Tuy nhiên, các nhóm hydroxyl của 5-HMC được cải biến bằng cách thêm gốc glucozơ, ADN đã glucozyl hoá này kháng lại hầu như tất cà các endonucleaz của tế bào chủ. Toàn bộ cho trình từ lúc bắt đầu tiếp xúc với bề mặt tế bào đến khi làm tan tế bào kéo dài 20-30 phút ở 3°c, trong đỏ tổng hợp ADN bắt đầu khoảng 5 phút sau khi nhiễm. Genome T4 gồm 3 nhóm gen sớm ngay, gen sớm sau và gen muộn. - Gen sớm ngay được phiên mã nhờ ARN polymeaz [bỉnh thường otapp’ và §] đã được cải biến cùa tế bào để tạo cảc protein điều hoà. Khi xâm nhập, một protein [sản phẩm của gen alt [alteARNtion] của T4] được đưa vào tế bào chủ cùng với ADN để cải biến trình tự ARN polymeaz E. coli, làm giảm ái lực của yếu tố 6 với enzym lõi [a a ịỉp ’] khiến yếu tố nảy không nhận diện được promoter của E. coỉỉ dẫn đến cản trở phiên mã của tế bào, nhưng lại nhận diện được promoter gen sớm của T4 để tiến hành phiên mã. - Gen sớm sau mã hoá cho enzym ADN polymeaz tham gia và sao chép và phiên mã của virut. - Gen muộn mã hoá cho các protein cẩu trúc [đầu, đuôi, lông] và enzym dùng để giải phỏng phage khỏi tế bào. Sự sao chép ADN diễn ra tương tự như ở phage T7. Phân tử mới được sao chép có đâu thừa tận cùng tại đau 5’ của cả hai phân tử con. ARN mồi không được thay thế bởi ADN, do đó ở đầu 3’ đối diện là đoạn ADN đơn. Các bazơơ bổ sung ở đầu 3’ của 2 phân

294

tử trùng lặp [concateme]. ADN ligaz hàn các chỗ đứt. Enzym giới hạn cắt phân tử ADN concateme thành các đoạn bằng nhau tạo genome đổi đầu quay vỏng. Phiên mã genome muộn hoàn toàn phụ thuộc vào sự có mặt của ADN mới tổng hợp, là dạng có cấu trúc lỏng lẻo thuận lợi cho phiên mã. Ba peptit, sàn phẩm của các gen T4 [33,45 và 55] gắn vào ARN polymeaz với các chức năng là các chất hoạt hoá gen [gen activators] giúp nhận diện promoter gen muộn. Quá trình lắp ráp và giải phóng diễn ra như ở các phage T khác. Tể bào bị phá võ, giải phóng 100-200 hạt phage. ADN-ligaz của T4 là enzym xúc tác cho phản ứng tạo liên kết photphodieste giữa 3’OH và 5’-P liền kề của phân tử ADN và ARN sợi đôi. Do enzym này có khả năng nối các đoạn ADN có đầu so le hoặc đầu bằng, nên được sử dụng rộng rãi trong tách dòng và cải biến ADN.

[4] Phage lamda Phage lamda là virut ôn hoà có cấu tạo giống T4, nhưng đuôi của nó chỉ có một sợi lông ngắn. Đầu chứa ADN kép, dạng thẳng. Sự lây nhiễm bắt đầu khi sợi lông đuôi gắn vào thụ thể bề mặt của E. coỉi, sau đó tiêm ADN vào tế bào chất. ADN của viron là sợi kép, dạng thẳng nhưng 2 đầu là mạch đơn và bổ sung cho nhau, gọi là đàu dính [cohesive end], viết tắ là COS. Ở trong tế bào chủ, hai đầu genome nhanh chóng gắn vào nhau tạo phân tử dạng vòng. Điều gì xảy ra tiếp theo là tuỳ thuộc phương thức sinh sản, chu trình tan hay chu trình tiềm tan. Chu trình tan về cơ bàn giống với T4, nhưng ở đây chia làm giai đoạn. - Gioi đoạn /: Từ điểm khởi đầu Ori, tiến hành sao chép theo hai hướng đối diện nhau, theo kiểu theta và kết thúc khi 2 chạc ba gặp nhau, để tạo nhiều khuôn cho phiên mã và khuôn cho sao chép. - Giai đoạn //: Từ khuôn ADN kép dạng vòng mới được tổng hợp, tiến hành sao chép theo cơ chế vòng tròn xoay [giống như xl74]. Enzym cắt làm đứt sợi [+] ngoài để lộ đầu 3’-OH, sợi [-] nguyên vẹn bên trong dùng làm khuôn. Sợi [-] xoay, trong khi các nucleotit gắn vào đầu 3’-OH để nối dài mạch mà không cần mồi, thường sau khi tổng hợp một đoạn ADN mạch đơn dài sẽ gắn mồi để tổng hợp mạch bổ sung, tạo phân tử ADN kép. Enzym cắt đo phage Ấ mã hoá sẽ cắt ở vị trí chuyên biệt trên cả hai mạch để tạo đoạn cỏ kích thước genome. Điểm cát là đầu dính COS. Sau sao chép genome là phiên mã gen muộn để tạo protein cấu trúc, tiếp đó là các giai đoạn lắp ráp và giải phóng.

295

Điều đáng chú ý là trên ADN của X có một đoạn [nằm giữa gen J và gen att] không đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân lên của X. Do đó trong kỹ thuật di truyền, phage X được đùng làm vectơ chuyển gen. Người ta cắt bỏ đoạn này và thay vào đó đoạn gen mong muốn để tách dòng. Chu trình tiềm tan ngược với chu trình tan là chu trình tiềm tan, theo đó không một thành phần nào của phage được tổng hợp và tế bào không bị tan. Genome khép vòng được cài xem vào NST của tế bào. ADN ờ trạng thái này gọi là prophage. Một protein ức chế do phage mã hoá ngăn cản sự phiên mã của các gen muộn, do đó duy trì trạng thái tiềm tan. Khi tế bào phân chia, prophage cũng được phân chia theo. Trạng thái này sẽ bị mất khi chất ức chế bị bất hoạt. Ở trạng thái prophage, một vài gen của phage [ngoài gen mã hoá cho chất ức chế] vẫn có thể được biểu hiện, đôi khi làm thay đổi phenotyp của tế bào chủ, ví dụ làm thay đổi hình dạng khuẩn lạc. Các vỉ dụ đáng chú khác là độc tổ của vỉ khuẩn Corynebacterium diphteriae, gây bệnh bạch cầu, được mã hoá bởi prophage. Độc tố thần kinh do Clostridium botulỉnum có trong các hộp thịt phồng, cũng do prophage mã hoá. Tê bào tiềm tan có thể sinh trưởng, phân chia và hình thành tể bào mới giống như tể bào mẹ. Trong thực tế, hầu hết trong nuôi cấy, vi khuẩn đều có thể mang một hoặc vài prophage, nhưng chỉ một tỷ lệ rất nhỏ 1/10000 hoặc 1/100000 prophage có thể tách khỏi nhiễm sắc thể để tiến hành chu ừình tan, tạo virion mới và gải phóng ra môi trường. Các virion được giải phỏng không ảnh hướng tới các tế bào tiềm tan khác, bởi vì protein ức chế luôn duy trì prophage ờ trạng thái tiềm tan, giúp tế bào tiềm tan “miễn dịch” trước sự xâm nhập của virut cùng loại. Do có sự “miễn dịch” nên các phage ôn hoà chỉ tạo vệt tan khi cho xâm nhiễm vào các chủng không phải tiềm tan. Cảc vệt tan xuất hiện rất đặc trưng. Các virut độc tạo vệt tan rất rõ trong khi virut tiềm tan chỉ tạo vệt tan mờ. Các vệt tan nhìn thấy được vì nhiều tế bào bị tan do các phage tiên hành chu trỉnh tan. Vệt tan mờ là vì một số tế bào tiềm tan vẫn sống sót, sinh sản trong vệt tan,

[5] Phage chuyển vị [TP] Phage chuyển vị [ưansposable phage] chủ yếu gặp ở các vi khuẩn Gram âm, nhất là Pseudomonas. Một ừong các ví dụ điển hình nhất là phage Mu. Phage chuyển vị có vòng đòi theo cả chu trình tan và tiềm tan, giống như phage X, nhưng klhác ở phương thức sao chép genome. Ở pha tan sớm, một số quá trình phức tạp liên quan đển enzym transposaz của virut, ADN polymeaz của ví khuẩn và một số enzym khác [của virut và vi khuần] tiến hành sao chép ADN và cài bản sao genome mới tạo thành cùa virut vào tế một vị trí nào đó ừên NST của tế bào và do đỏ cỏ thể làm bất hoạt các gen tại Vị.trí gắn đẫn đến đột biến. Không có genome nguyên vẹn của virut rời khỏi NST tế bào chủ. Chỉ sau một sổ vòng

296

chuyển vị sao chép [replicative transposition], genome virut cùng với một phần ADN liền kề của tế bào được tách ra khỏi tế bào để thực hiện chu trình tan. Phage chuyển vị được dùng phổ biến trong công nghệ sinh học để đưa gen mong muốn vào các tế bào nhân sơ. 19.3. NUÔI CẨY VIRƯT ĐỘNG VẬT 19.3.1. Phát triển phương pháp nuôi cấy Trước kia nếu muốn nuôi cấy virut thì người ta phải nuôi cấy trên cơ thể động vật. Như vậy rất khó quan sát được các hiệu ứng đặc thù của virut ờ mức độ tế bào. Vào những năm 30 của thế kỷ 20 các nhà virut học đã phát hiện thấy trứng gà mang phôi [đã thụ tinh hay chưa thụ tinh] có thể được dùng để nuôi cấy virut herpes, virut đậu mùa và virut cúm. Mặc dù phôi gà có kết cấu giản đơn hơn nhiều so với cơ thể thỏ hay chuột thí nghiệm nhưng phôi gà vẫn là một cơ thể phức tạp. Sử dụng phôi gà không giải quyết được triệt để những vấn đề gặp trong hiệu ứng tế bào học do virut gây ra. Mặt khác, vi khuẩn cũng phát triển tốt trên phôi gà, trên các phôi nhiễm vi khuẩn rất khó đánh giá chính xác được các hiệu ứng do virut. Vì vậy ngành virut học đã phát triển chậm chạp khi chưa cài tiến được phương pháp nuôi cấy virut. Có hai phát hiện mới đã làm triển khai được phưcmg pháp nuôi cấy tế bào giúp cho các nhà virut học và các nhà khoa học khác. Một là, việc phát hiện và sử dụng chất kháng sinh để ngăn ngừa sự cảm nhiễm vi khuẩn. Hai là, các nhà sình học phát hiện thấy các enzym thủy phân protein [proteolytic], nhất là trypsin, có thể làm tách riêng các tế bào ra khỏi các mô xung quanh mà không làm tổn hại đến các tế bào này. Rửa các tế bào và đếm số lượng chúng, pha loãng rồi chuyển vào các bình, các ống nghiệm hay hộp Petri bằng nhựa [plastic]. Các tế bào trong dịch huyền phù sẽ hấp phụ trên bề mặt lớp thành nhựa, cúng sinh sôi nẩy nở và lan ra thành một tầng tế bào gọi là tầng tể bào đơn [monolayer]. Tầng tế bào đon này có thể truyền thế hệ [subcultured]. Nuôi cấy truyền thế hệ [subculturing] là đem các tế bào nuôi cấy được đi nuôi cấy ừong các môi trường nuôi cấy mởi. Một lượng lớn các tế bào truyền thế hệ [subcultures] được tạo thành từ một mẫu tổ chức đơn sẽ là mẫu tế bào nuôi cấy đồng nhất cần thiết cho hàng loạt các nghiên cứu hiệu ứng của virut. Thuật ngữ nuôi cấy mô [tissue culture] đã được sử dụng rộng rãi nhưng nuôi cấy tế bào [cell culture] cần sử dụng chính xác hơn. Hiện nay, phần lớn các tế bào nuồi cấy đều là tầng tế bào đơn sinh trường ra từ các tế bào phân tán đã được xử lý nhờ enzym. Nhờ sử dụng nhiều loại hình nuôi cấy tế bào vận dụng chất kháng sinh để ức chế can nhiễm mà Virut học đã bước vào thời đại vàng [Golden Age]. Từ thập kỷ 50 đến thập kỷ 60 cùa thế kỷ 20 đã có ừên 400 virut được phân lập và giám định [characterized]. Mặc dù các virut 297

mới đã được phát hiện nhưng trọng tâm hiện nay là cần giám định kỹ hơn các đặc tính cùa vimt, xác định các bước cảm nhiễm [infection] và nhân lên [replication] của virut. Các thí nghiệm vệt tan [plaque] dùng trong nghiên cứu phage [phages] có thể dùng cho cà các virut động vật. Chẳng hạn, nuôi cấy tầng tế bào đơn các tế bào người, sau đó cấy virut, nếu virut làm tan tế bào thì rất nhiều vòng xâm nhiễm sẽ sản sinh vệt tan. 19.3.2. Các loại hình nuôi cẩy tế bào Trong Virut học lâm sàng và Virut học thực nghiệm thường sử dụng rộng rãi 3 kiểu cơ bản nuôi cấy tế bào: - Nuôi cấy tế bào nguyên đại [primery cell culture]. - Các chủng nguyên bào sợi nhị bội thể [diploid fibroblast strains]. - Các dòng tế bào liên tục [contínous cell lines]. Vật nuôi cấy tể bào nguyên đại là lẩy trực tiếp từ động vật, không qua truyền thể hệ [not subcultured]. Các động vật lấy mẫu càng non thì thời gian sống của tế bào nuôi cấy càng kéo dài. Điển hình của các tế bào này là thể hỗn hợp của nhiều loại hình tế bào như tế bào cơ bắp [muscle], tế bào thượng bì [epithelial]. Tuy vậy số lần phân cắt của các tế bào này thường không nhiều, nhưng cũng đủ để hỗ trợ cho nhiều chủng virut sinh trưởng Nếu việc nuôi cấy tế bào nguyên dại có thể truyền thế hệ một cách lặp lại thì một tip [typ] tế bào sẽ chiếm ưu thế và vật nuôi cấy các tế bào này được gọi là chủng tế bào [cell strain]. Trong chủng tế bào tất cả các tế bào loại hình gen giống nhau. Chúng có thể truyền thế hệ nhiều lần, mỗi thế hệ giữa các tế bào khả năng xuất hiện cảc khác biệt là rất nhỏ. Các khác biệt này có thể can thiệp vào kết quả xác định hiệu ứng của virut. Các chủng nguyên bào sợi nhị bội thể lả cảc chủng tế bào thường dùng nhất. Nguyên bào sợi [fibroblasts] là một loại tể bào chưa thành thục. Chúng có thể sản sinh ra collagen và các sợi khác như lả cơ chất của mô liên kết giống như chân bì [dermis of the skin] Các chủng tế bào này là lấy từ mô cùa phôi, giữ tổc độ phát ừiển nhanh và phân cắt liên tiếp của phôi. Chủng tể bào này hỗ ừợ cho sự phát triển của các loại virut và thường không mang các virut ô nhiễm như các chủng tế bào thu được từ các động vật trưởng thành. Chính vì vậy mà các chủng tế bào này thường được sử dụng để sản xuất các loại vaccin virut. Tip thứ ba nuôi cấy tế bào được sử dụng rộng rãi là đòng tế bào liên tục. Một dòng tế bào liên tục chứa các tể bào có thể sinh sản ra rất nhiều thế hệ. Dòng tế bào liên tục nổi tiếng nhất là đòng tể bào HeLa. Dòng tế bào này sau khi được phát hiện từ năm ỉ 951 đã được nuôi cấy liên tục và được các nhà nghiên cứu khẳp thế giới sử dụng rộng rãi. Nguồn gốc của dòng tế bào HeLa là lấy từ một phụ nữ bị ung thư tử cung và chữ HeLa là lấy từ các chữ đầu của tên người này. Trên thực tể rất nhiều dòng tế bào liên tục thời kỳ đầu đều

298

là dùng các tế bào ung thư ác tính, vì chúng có năng lực sinh trưởng rất nhanh. Các dòng tế bào vĩnh sinh [immortal cell lines] được nuôi cấy trong các phòng thí nghiệm không bị lão hóa, phân chia nhanh chóng, nhu cầu dinh dưỡng thường đom giản hơn các tể bào thông thưcmg. Ví dụ đòng tế bào HeLa có chứa 2 gen virut càn thiết cho năng lực vĩnh sinh hóa [immortality] của chúng. Dòng tế bào vĩnh sinh này là dị bội thể [heteroploid] -chứa sổ lượng khác nhau các nhiễm sắc thể, vì vậy mà có tính đa dạng đi truyền. Việc nuôi cấy tế bào đã thay thế trên mức độ rất lớn các động vật thực nghiệm và trứng chửa phôi khi nghiên cứu Virut học động vật. Tuy vậy trứng gà mang phôi vẫn là hệ thống vật chủ tốt nhất đối với virut cúm A.

Ngoài ra chuột nhỏ loại Albino Swiss vẫn được dùng để nuôi cấy Arbovirrus [j4rthropod-ốome virutes], có lúc cũng dùng những đòng tế bào động vật có vú khác hoặc các dòng tế bào muỗi.

19.3.3. Hiệu úng bệnh biến tế bào [The cytopathic effect] Hiệu ứng thấy được của virut đối với tế bào cảm nhiễm được gọi là hiệu ứng bệnh biến [cytopathic effect,CPE].Các tế bàó trong nuôi cấy biểu hiện các loại hiệu ứng chung, bao gồm sự biến đổi hình dạng tể bào và sự tách ra khỏi các tế bào phụ cận hoặc vật dụng nuôi cấy.

299

Tuy nhiên CPE có thể cũng cỏ những biểu hiện đặc biệt mà các nhà nghiên cứu virut học thực nghiệm có thể dùng để giám định sơ bộ virut xâm nhiễm. Chẳng hạn, adeno virut và herpes virut ở người có thể làm cho tế bào cảm nhiễm trương phồng lên do bị tích lũy dịch thể. Còn picoARN virut lúc xâm nhập tế bảo có thể ngăn chặn tế bào và làm tan vỡ tế bào khi chúng thoát ra. Paramyxo virut có thể làm dung hợp [fuse] các tế bào đứng gần nhau, tạo nên các thể hợp bào [syncytia, số nhiều là syncytium]. Thể hợp bào có thể chứa từ 4 tới 100 nhân trong một tế bào chất chung. Ngoài ra có một dạng CPE khác là sự biến nạp [transformation]: từ tể bào bình thường biến thành tế bào ác tính. 19.4. VIRUT VÀ UNG THƯ Ưng thư được biết là loại bệnh mà có sự rối loạn về hoạt động và chức năng của những tế bào bình thường. Có thể định nghĩa Ung thư [cancer] như là sự tăng trưởng không thể khống chế được của các tế bào dị thường, nói cách khác là các tế bào không ngừng phân chia. Rất nhiều trường hợp không thể đình chỉ được sự phân cắt của chúng, kết quà là tạo thành các Mô ung thư [Neoplasm] hoặc Khối u [Tumor]. Mô ung thư cỏ thể là lành tính [benign] - tăng trưởng phi ung thư [noncancerous]. Nhưng nếu các tế bào xâm nhập và can thiệp vào chức năng của các mô bình thường chung quanh thì sẽ ứở thành ác tính [malignant]. Ung thư ác tính và các tế bào cùa chúng có thể di căn [metastasize] hoặc khuếch tán [spread] tới các mô khác của cơ thể. Năm 1911, F.Peyton Rous đã phát hiện thấy một số virut có thể gây ra ung thư ở động vật ông xác định một số sarcomas [neoplasm ở mô liên kết] ở gà là do một loại virut được gọi là Rous sarcoma virut, RSV- gây ra. Vì vậy không có gì đáng ngạc nhiên với cảc phát hiện virut có liên quan đến bệnh ung thư ờ người. Mặc dù phần lớn ung thư ở người là đo các đột biến di truyền [gentic mutation] hay do các hóa chất gây ô nhiễm môi trường, hoặc do cả hai gây ra ung thư. Các nhà nghiên cứu dịch tễ cho rằng có khoảng 15% các ung thư ờ người do cỏ sự xâm nhiễm của virut.

300

19.4.1. Các virut gây ung thư ở người Qua nhiều năm nghiên cứu và thực nghiệm hiện nay đã biết ít ra là đã có 6 loại virut liên quan đến ung thư ở người. Có thể còn có nhiều hom nữa sẽ được xác định. Virut Epstein-Barr, EBV hay thường gọi là virut EB: là loại virut gây ung thư ở người được hiểu biết nhiều nhất. Loại virut ADN này là một Herpes virut làn đầu tiên phát hiện trên trẻ em Châu Phi bị ung thư lympho Burkitt. Loại ung thư ác tỉnh này gây ra xưng phồng rồi dẫn đến hoại tử hàm dưới. Trên thực tế đã chứng minh được là có 3 loại ung thư khác liên quan đến virut EB. Một số virut Papilloma ở nguời [human papillomavirut, HPV] có liên quan đến mật thiết đến ung thư ở người. Mặc dù một số virut ADN này chỉ gây ra các mụn cơm [warts] lành tính nhưng có những tip khác [HPV-8, HPV-16] đã gây ra ung thư tử cung [ung thư mô thượng bì]. Có thể nói 99,7% ung thư tử cung là do HPV gây nên. Một số virut ADN khác gây ung thư là virut viêm gan B [HBV]. Chúng gây ra bệnh viêm gan và 80% cảc trường hợp ung thư gan là do chúng gây nên. Ung thư Sarcoma Kaposi là loại ung thư tế bào nội bì ừong mạch máu và hệ thống lympho, loại ung thư này có liên quan đến virut Herpes-8 ở người [human herpesvirut 8]. Hiện nay đã phát hiện thấy các virut gây ung thư ở người chủ yếu là các virut hai chuỗi ADN [dsADN]. Tuy nhiên một số virut ARN sợi thẳng, hay[+] sense ARN, nhất là các Retrovirut cũng có thể liên quan đến ung thư, Chẳng hạn HTLV-I gây nên bệnh máu trắng tế bào T ở người lớn hoặc ung thư lympho [aldult T cell leukemia/lymphoma].

19.4.2. Virut ung thư gây bệnh như thế nào? Giống như phage [thực khuẩn thể, phage], các virut động vật thường thông qua việc làm tan để gây chết tế bào. Một số virut động vật khác có thể xâm nhiễm tế bào và tạo thành các Tiền virut [provirutes]. Trong một số trường hợp sự xâm nhiễm này có thể làm cải biến về sinh lý và di truyền của các tế bào vật chủ [host cells] - tức là các CPE đã nói tới ở phần trên. Ví dụ các virut RSV đã làm cho các tế bào tách khỏi dụng cụ nuôi cấy và biến thành hình cầu. Trong trường hợp virut ung thư ADN có thể tồn tại dưới dạng tiền virut. Các CPE chủ yếu của chúng là sự phân cắt không kiểm soát được ở các tế bào xâm nhiễm. Quá trình này được gọi là sự biến nạp gây u [neoplastic transformation], là đặc trưng điển hình cửa các virut ADN. Nhiều virut đã đưa toàn bộ hay một phần ADN xâm nhập vào vị trí ngẫu nhiên trong ADN của vật chủ. Tuy nhiên, chỉ có một ít gen virut là cần thiết cho biến nạp. Virut Papilloma [thuộc họ Papovaviridae] có thể gây ra các tế bào ung thư ở người, nhưng AĐN của chúng lại tồn tại tự do trong tế bào chất của vật chủ. Một ít gen của virut Papilloma là có hoạt tính và dẫn đến virut được sao chép [replicate] mỗi khi phân cát tế

301

bào. Nếu ADN virut ngẫu nhiên kết hợp với ADN trong tế bào vật chủ thì sẽ xảy ra sự tổng hợp protein virut không khống chế được. Các protein này có thể làm cho tế bào mất đi khả năng khống chế phân cắt. Một số protein virut này đã ngăn chặn hiệu ứng cùa các gen ngăn chặn ung thư [tumor-suppressor gens], các gen có thể ngăn chặn sự phân căt không khống chế được của tế bào. Không có sản phẩm cùa các gen này, vật chủ sẽ không khống chế được sự phân cắt tế bào và phát triển thành một khối u. Nhiều virut Retro là các Virut ung thư ARN. Trên thực tể chúng duy nhất là những virut ARN gây ung thư đã biết, cần nhắc lại, các virut Retro đx dùng enzym transcriptaz ngược để phiên mã sợi ARN [+] vào ADN, sau đó trở nên một tiền virut [provirut] xâm nhập vào nhiễm sắc thể của vật chủ. Protein phiên mã bởi Tiền virut HTLV-I sẽ chuyển hóa tế bào vật chù thành khối u. Sự xâm nhiễm cũng dẫn đến sự phát sình các hạt virut [virion] mới bằng nẩy chồi, chúng không làm gây chết tế bào bị xâm nhiễm. Do đó, virut ung thư ARN có thể tiếp tục xâm nhiễm vào các tế bào chưa bị xâm nhiễm khác hoặc các tế bào sinh sản [sex cells]. Nếu là tế bào sinh sản sự tồn tại của các hạt virut sẽ làm cho thế hệ sau của vật chủ cũng sẽ bị virut xàm nhiễm.

19.4.3. Cácgen gây ung thư [Oncogens] Các protein sinh ra bởi các virut ung thư làm cho các tể bào vật chủ phân chia không khống chế được là được phiên mã từ các đoạn ADN được gọi là các Gen ung thư [oncogens], theo tiếng Hy Lạp thì onco là tích thành khối, Trong các virut AĐN gây ung thư. các gen ung thư không chỉ gây ra khối u mà chúng còn chứa các thông tin để tổng hợp protein virut cần thiết cho sự sao chép virut. Gen gây ung thư ở virut ARN gây ung thư thi hoàn toàn khác. Các nhà virut học và tế bào học đều đã phát hiện thấy một số virut ARN gây ung thư có thể sinh ra các gen độc biệt [extra gens] từ các tế bào vật chủ bình thường khi sao chép virut. Các gen này rất giống với gen gây ung thư và được gọi là gen Nguyên u [Proto-oncogens]. Một gen Nguyên u là một gen bình thường, sau khi bị virut khổng chế nó có thể đẫn đến việc tế bào mất khả nămg khống chế sự phân chia, tức là nó biến thành gen gây ung thư. Nhiều gen gây ung thư đã được tìm thấy trong các virut gây ung thư và phần lớn mang thông tin đi truyền có thể làm cho tế bào phân chia không hạn chế. Các gen gây ung thư này là các gen đột biến chứa sự mất đoạn [deletions] hoặc sự thay thế [substitution]. Các đột biển này gây ra sự biến đổi cấu trúc trong protein mà gen đã phiên mã. Gen gây ung thư hoạt dộng theo một trong hai phương thức sau đây: Một là, sản phẩm của gen gây ung thư có thể gây ra sự gián đoạn chức năng của tế bào bình thường đẫn đên sự phân cắt tế bào. Hai là, gen gây ung thư bị khổng chế bời các gen điều hòa của virut [viral regulators] nằm gần vị trí gắn kết [intergration] chúng vào nhiễm sắc thề của vật chủ, gen điều hòa này ”mờ ra” [’’turn on”] gen tạo ra các protein bình

thường, nhưng là sự tổng hợp quá mức hoặc là tồng hợp không phù hợp với chu kỳ sống của tế bào vật chủ; ngoài ra còn xuất hiện sự phân chia quá mức tế bào. Sự phát hiện ra gen gây ung thư ở virut có ý nghĩa quan trọng trong việc giúp hiểu biết về ung thư. v ề ung thư ở người còn. rất nhiều vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu, nhưng các thuốc đặc hiệu chống virut trong tương lai có thể ngăn ngừa được các bệnh ung thư do virut gây nên.

19.4.4. Hy vọng phòng chống ung thư Ung thư là một trong những nguyên nhân chính gây tử vong trên thế giới. Năm 2005, người ta ước tính có khoảng 7,6 triệu nạn nhân chết vì bệnh này và trong mười năm sắp tới, số người chết sẽ là 84 triệu nếu như không phòng chổng. Tổ chức Y tế thể giới [WHO: World Health Organization] đã thống kê trong 20 năm qua số người mới mắc ung thư hàng năm đã tăng từ 10 triệu ỉên đến 15 triệu, số người chết vì ung thư mỗi năm đã tăng từ 6 triệu lên đến 10 triệu. Phòng chống ung thư là một sự nghiệp hểt sức to lớn đối với cả thế giới. WHO đã đề nghị mục tiêu toàn cầu là làm giảm mức tử vong xuống 2% mỗi năm, từ 2006 đến 20] 5 để có thể tránh hơn 8 triệu người chết trong số 84 triệu người 9ẽ chết vì ung thư đự tính cho mười năm sắp tới và WHO cố gắng đạt mục tiêu này .Những nước nghèo có hơn 70% sổ người chểt do bệnh ung thư vì thiếu tiền để chẩn đoán lẫn trị bệnh. Chí mỗi chửng nhiễm độc thuốc lá mà cũng đã gây khoảng 1,5 triệu cái chết mỗi năm. WHO nỗ lực tích cực. Người ta ước tính có khoảng 40% bệnh ung thư có thể ừánh được. Tuy nhiên nguy cơ sẽ tăng rất nhiều khi bệnh nhân mập phì hay bị nhiễm độc thuốc ỉá. Người ta nhận xét thấy nguy cơ bệnh ung thư và những bệnh mạn tính trên phương điện toàn cầu tâng nhanh khi trong thức ăn hiện nay có quá nhiều mõ, đường và muối, còn rau quả thi ít đi. WHO họp lần thứ nhất tại Genève từ 6-17/2/2006 để thỏa thuận với nhau về một phương cách giảm tiêu thụ thuốc lá. Các đại biểu cho biết quỹ có 8 ừiệu USD cho những sinh hoạt chổng thuốc lá trong thòi gian hai năm. Chiến lược toàn cầu cũng chú trọng việc tránh tiêu dùng các thực phẩm cỏ chứa hóa chất gây ung thư, chương trình chủng ngừa các bệnh nhiễm virut viêm gan ưên bình điện quốc tế. Để cải thiện việc phát hiện sớm, điểu trị vả chăm sóc người bị ung thư, Trung tâm Nghiên cứu Ưng thư [IARC: InteARNtional Agency for Research on Cancer] của WHO đã tìm ra nhuyên nhân gây bệnh ung thư và các cơ chế cùa sự xuẩt hiện ung thư đồng thời tìm những pbưcmg cách phát hiện sớm. WHO còn kết hợp với những cơ quan ngoài hệ thống Liên hiệp quốc như Cơ quan năng lượng nguyên tử quốc tế, Hội chống ung thư quốc tế và nhiều Viện ung thư quốc gia. Cho đến nay chưa có nổi vaccin chổng ung thu ngoại trừ vaccin Gardasil phòng tránh ung thư cổ tử cung. Mục tiêu cùa vaccin phòng tránh ưng thư là sử dụng kháng nguyên ung thư biểu đạt đặc hiệu để kích hoạt, phục hồi và tăng cường các phản ứng miễn dịch kháng ung thư, nhằm cỏ thể sát hại, thanh lọc tế bào ung thư. Vì vậy có thể đem vaccin ung thư

303

chia thành 3 loại: loại Dự phòng, loại Chữa trị, và loại vừa Dự phòng và Chữa trị. Cục quản lý Thực phẩm và Thuốc Hoa Kỳ [FDA] đã phê chuẩn vaccin Gardasil để phòng tránh virut HPV- gây ra ung thư cổ tử cung. Vaccin này chống lại 4 nhóm HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18. HPV-16 và HPV'18 được coi là thủ phạm của 70% các trương hợp ung thư cổ tử cung, còn HPV-6 và HPV-11 là thủ phạm của 90% các trường hợp mụn cơm ờ bộ phận sinh dục [cả nam lẫn nữ]. Vaccin này cũng được khẳng định là sẽ giúp phòng ngừa ung thư âm đạo và tử cung đo virut HPV. HPV lây truyền qua đường tinh dục là một loại virut rất phổ biến. Khoảng 20 triệu người Mỹ bị nhiễm loại virut này, và ở lứa tuổi 50, ít nhất 80% phụ nữ đã từng bị nhiễm các chủng của virut HPV. Không phải phụ nữ nào bị nhiễm virut này cũng sẽ bị ung thư. Tỉ lệ bị bệnh ung thư cổ tử cung do HPV là rất nhỏ.

Virut Humanpapilỉomavirut [HPV] thuộc nhóm ADN.

304

Mặc dù vaccin Gardasil có khả năng bảo vệ tránh khỏi một trong nhũng nguyên nhân hàng đầu dẫn đến căn bệnh ung thư cổ tử cung nhưng vẫn còn có những nguyên nhân khác không phải đo virut HPV gây ra căn bệnh ung thư đáng sợ này.

Chính vì vậy việc thường xuyên kiểm tra vẫn là rất cần thiết. Những đợt kiểm tra định kỳ sẽ giúp phát hiện ra những thể ung thư khác cũng như nguy cơ có thể bị ung thư do chủng virut HPV nhóm khác. Những nghiên cứu đã cho thấy hiệu quả 100% của vaccin này trong việc chống lại sự lây nhiễm virut HPV-16 và HPV-18 ở người. Các thử nghiệm cho thấy vaccin có hiệu quà tối ưu trong ít nhất 4 năm. Thời gian lâu hơn hiện vẫn chưa được kiểm chứng. Gardasil chỉ chứa cấu trúc phân tử của loại virut này chứ không phải là virut được làm yếu đi như một số loại vaccin khác. Cơ quan FDA Hoa Kỳ thừa nhận Gardasil tốt nhất cho nữ giới trong độ tuổi từ 9-26 và khồng đưa vào lịch tiêm chủng quốc gia. Công ty Merk & Co có nhiệm vụ tiếp tục nghiên cứu đưa vào sử dụng loại vaccin phòng chống virut HPV gây mụn rộp ở nam giới.Gardasil là thế hệ vaccin đầu tiên phòng ung thư cổ tử cung được cấp phép. Trên thực tế, đây là loại vaccin đầu tiên chống lại một nhân tổ gây ung thư. Tháng 4/2007 vaccin chống ung thư cổ tử cung Cervaríx cũng xin phép được đưa ra sử dụng tại Mỹ.

Chương 20

DI TRUYỀN HỌC VI SINH VẬT

20.1. MỞ ĐÀU Mãi đến những năm 40 của thể kỷ trước, các đối tượng vi sinh vật mới bắt đầu được sử dụng vào nghiên cứu di truyền học. Tuy ra đời chậm, nhưng các phát minh quan ừọng cỏ tính cách mạng trong sinh học như chứng minh trực tiếp ÂDN là vật chất di truyền, sao chép ADN, sinh tổng hợp protein, kỹ thuật di truyền,... đều thực hiện trên các đối tượng vi sinh vật. Do vậy, có thể nói di truyền học vi sinh vật đã đóng vai trò “cách mạng hóa ”, tạo ra những bước tiến nhảy vọt cho di truyền học nói riêng, hình thành Sinh học phân tử và sự phát triển Sinh học hiện đại nói chung cả về phương điện lí thuyết cũng như ứng dụng thực tiễn. Di truyền học của vi sinh vật đã góp phần chủ yếu cho sự phát triển di truyền học phân tử, mà đỉnh cao chói lọi là sự ra đời kỹ thuật tái tể hợp A D N hay kỹ thuật di truyền [KTDT], làm bùng nổ Cách mạng Công nghệ sinh học.

20.1.Ỉ. Tính cách mạng của Dí truyền học vỉ sinh vật Nhân loại đang sổng ở cuối thập niên đầu tiên của thế kỉ 21 - thế ki Công nghệ sinh học. Di truyền học đi sâu vào các vấn đề cơ bản của sự tồn tại và ỉưu truyền sự sống nên nó giữ một vị trí đặc biệt quan trọng, cỏ người ví "Di truyền học là trải tim của Sinh học”, vl không ít thì nhiều, nó liên quan và chi phối bất kì lĩnh vực nào của sinh học, từ các cơ chế phân tử của sự sổng cho đến sự tiến hóa của toàn bộ thế giới sinh vật trên hành tinh của chúng ta. Những phát minh ĩớn với số lượng tăng vọt của di truyền học đã có tác dụng cách mạng hóa sinh học, biến sinh học từ mô tả thành thực nghiệm chính xác. Hội nghị Di truyền học thế giới ở Toronto [Canada] năm 1988 đã nêu phương châm "Di truyền học hóa" Sinh học.

Suốt thế ki XX, các nghiên cứu tập trung giải quyết vấn đề gen dẫn đến Thời đại gen, Cách mạng di truyền, mà đinh cao là việc hoàn tất Bộ gen người vào năm 2003 và mở ra Thời đại sau Bộ gen [Post-Genomeics Era]. Các đối tượng vi sinh vật đã góp phần chủ yếu vào các phát mình nền tảng không những cùa di truyền học phân tử, mà cùa sinh học phân tử và sinh học hiện đại nói chung. Điểm qua lịch sử các phát minh của sinh học phân tử sẽ thấy rõ vai trò cách mạng hóa của các đổi tượng này. 20.1.1.1. Giả th iế t m ột gen - m ột enzym

Vào năm 1941, G. Beadle và E. Tatum tiến hành thí nghiệm trên vi nấm Neurospora crassa. Công trình chứng minh mối liên hệ giữa gen và tính trạng thông qua việc kiểm soáĩ các enzym - protein và qua đó kiểm soát các phản ứng sinh hóa trong tế bào. Giả thuyết này mờ ra một trang mới về mối quan hệ chức năng giữa gen và enzym trong con đường trao đổi chất của cơ thể. Phát minh này có ý nghĩa quan ừọng: đó là bước chuyển tiếp từ di truyền học cổ điển sang đi truyền phân tử. Chính vì vậy, hai ông đã được nhận giải thưởng Nobel vào năm 1958. 20.1.1.2. Các chứng minh trực tiểp rằng ÁDN là vật chẩt di truyền Ngay sau khi các định luật của Menđel được phát hiện lại vào năm 1900, di truyền học đã phát triển rất nhanh với thuyết di truyền NST và nhiều thành tựu khác như gây đột biến nhân tạo... Tuy nhiên cho đến 1940, vẫn chưa có một bước tiến triển nào ữong hiểu biết bản chát hoá học của vật ỉiệu di truyền và chua hiểu được bằng cách nào gen trên nhiễm sắc thể biểu hiện ra tỉnh trạng. Trong một thời gian dài, mặc dù cỏ nhiều số liệu giản tiếp cho tháy ADN ỉà vật chất di truyền, nhưng protein vẫn được coi là thành phàn chù yếu của vật liệu di truyền vì nó có cấu trúc phân tử khá phức tạp. Do vậy, các chứng mình trực tiếp trên các Vi sinh vật có ý nghĩa quyết định trong xác nhận vai trò cùa ADN. a. Biến nạpĩ truyền thông tin di truyền nhờ ADN. Năm 1928, Griffith phát hiện hiện tượng biến nạp [ừansíbrmation] ở vi khuẩn Diplococus pneumoniae [nay gọi là Streptococus pneumoniae]. Năm 1944, T.Avery, Mc Leod và Mc Carty đã xác định rõ tác nhân gây biến nạp là ADN. Hiện tượng biển nạp là bằng chứng trực tiếp đầu tiên xác nhận rầng ADN mang thông tin đi truyền. b. Sự xâm nhập của ADN virut vào vi khuẩn Năm 1952, A.Hershey và M.Chaz đã tiến hành thí nghiệm với bacteriophage T2 [virut của vi khuẩn hay gọi tắt là phage] xâm nhập vi khuẩn E. coli, chứng minh trực tiếp ràng ADN cùa phage T 2 đã xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và sinh sản tạo ra thế hệ phage

307

mới mang tính di truyền có khả năng tiếp tục lây nhiễm các vi khuẩn khác. Kết luận: Vật chất di truyền của phage T2 là ADN. Năm 1952 đă diễn ra nhiều cuộc tranh luận sôi nổi về vai ừò của ADN: là vật chất di truyền. Sau đó, năm 1953 mô hình Waston và Crick đã đặt dấu chấm kết cho giai đoạn nghi ngờ ràng ADN có là vật liệu di truyền hay không. Các chứng minh trực tiếp nêu trên là những tiền đề quan ừọng cho phát minh ra mô hình cấu trúc chuỗi xoắn kép ADN của Waston và Crick. Nó đã tạo nên bước phát triển mới cho sinh học dẫn đến sự hình thành sinh học phân tử hiện đại, 20.1.1.3.Chi tiết hóa “học thuyết trung tâm„ cửa sinh học phân tử: ADN -ỳ ARN -ỳ Protein a. Sao chép ADN - Trong năm 1955, A. Komberg và đồng sự đã phân lập ADN polymeaz I từ vi khuẩn E. coli. Sau khi cho enzym này vào ống nghiệm muối chứa ADN và 4 loại nucleotit triphotphat, hỗn hợp này có thể tổng hợp mạch ADN mới. - Năm 1958, ừên đối tượng E. coli, M.Meselson và F. Stahl đã chứng minh ADN sao chép theo cơ chế “bán bảo tồn”: mỗi mạch bố mẹ sẽ làm khuôn cho sự tổng hợp mạch ADN mới. Cho đến nay, toàn bộ chi tiết về sao chép ADN đều được thực hiện ưên E. coli. b. Các quá trình phiên mã, dịch mã vã điều hòa sinh tổng hợp protein Trên đối tượng E. coli: - Năm 1961: s. Brenner, Fr. Jacob và M. Meselson đã khám phá mARN là phân tử mang thông tin di truyền của ADN từ nhân đến bộ máy sản xuất protein nằm trong tế bào

chất. Điều này bác bỏ già thuyết của Fr. Crick nêu ra năm 1958 cho ràng ARN của riboxom là phân tử trung gian mang thông tin di truyền từ nhân sang tế bào chất. - 1961 - 1966: Mã di truyền được khám phá. [Giải Nobel] - Ngoài 2 phát minh trên, toàn bộ các quá trình phiên m3, dịch mã, cấu trúc của riboxom đều thực hiện trước tiên ừên E. coli. - 1962: Phát hiện cơ ché điều hòa sinh tổng hợp protein ở Operon lactoz.[Giải Nobel] - 1970: Phát hiện enzym Reverse ừanscriptaz. [Giải Nobel]

308

20.1.1.4. Những đóng góp cạ thể của các đối tượng làm mô hình chủ yếu Việc tỉm hiểu những đóng góp cụ thể của các đối tượng làm mô hình chủ yếu sẽ giúp hiểu rõ một cách hệ thống và cụ thể hơn về vai trò "cách mạng trong cách mạng” của di truyền Vi sinh vật. a. Vi khuẩn Escherichia coli [E. coỉỉ] -

Các đóng góp chủ yếu: Đối tượng chủ yếu được dùng cho các nghiên cứu: •

Sao chép, phiên mã, dịch mã và tái tẻ hợp.

•

Đột biến.

•

Điều hòa biểu hiện gen [Gen regulation].

•

Kỹ thuật ADN tái tổ hợp [recmbinant ADN technology].

- Đóng góp cho nghiên cứu các lĩnh vực khác: Trao đổi chất của tế bào [Cell metabolism], gen ức chế vô nghĩa [Nonsense suppressors], sự tuyến tính [Colinearity] giữa gen và polypeptit, các Operon, sự kháng thuổc dựa vào plasmid [plasmid-bazơđ đrug resistance] và sự vận chuyển tích cực [Active transport]. b. Nấm men Sơccharomyces cerevisìae [S. cerevisiae] - Vai trò chủ yếu cho các nghiên cứu: •

Chu trình tế bào [Cell cycle]: Sự xác định các gen kiểm soát phân bào nhở các đột biển nhạy cảm nhiệt [temperature-sensible mutants [cdc mutants]] dẫn đến mô hình rất tốt cho nghiên cứu sự phân bào.

•

Tương tác gen [Gen interaction]: nghiên cứu sự ức chế gen [suppression]. Hệ thống plasmid lai kép [two-hybrid plasmid system] giúp tìm các tươngtác giữa các protein ở nấm men đã dẫn đến các bản đồ tương tác phức tạp, mà là khởi đầu cho sinh học các hệ thống [systems biology].

•

Di truyền học ty thể: nhờ các đột biến “petite” mất khả năng hô hấp mà phát hiện các gen của ty thể. Nhờ chúng và các đột biến khác của ty thể mà phân tích chi tiết cấu trúc và chức năng bộ gen ty thể.

309

•

Di truyền học kiểu bắt cặp [Gentics of mating typ]: Các alen MA T ở nấm men là các gen kiểu bắt cặp đầu tiên được xác định các đặc tính ở mức phân từ.

Những đóng góp khác: Di truyền cùa khóa đóng mờ [switching] giữa sự tăng trưcmg kiểu nấm men [yeast-like] và sợi [filamentous]; di truyền học sự thoái hỏa [senescense].

Nẩm sợi Neurospora crassa: -

Các đỏng gỏp chủ yếu: •

Di truyền sinh hóa và trao đổi chất.

•

Di truyền học của giảm phân.

•

Di truyền ty thể.

Các đóng gỏp khác: sự đa dạng các loài nấm và thích nghi [adaptation], di truyền tế bào [cytogentics], các gen kiểu bắt cặp, các gen dung hợp thể dị nhân [heterokaryoncompatibility gens]. 20.ỉ. 1.5. Kỹ thuật di truyền và sự mở đầu cách mạng Công nghệ sình học a. Enzym giới hạn [restriction endonucleaz]: Năm 1962, W.Arber lần đầu tiên chứng minh rằng có những enzym đặc biệt hạn chế [restriction] sinh sản của phage ứong tế bào E. coil Năm 1968: Enzym cắt giới hạn đầu tiên được khám phá: EcoR 1. Đến năm 1970, Hamilton Smith và cộng sự đã tách được một loại enzym cát giới hạn mới từ vi khuần Haemophilus influenzae, gọi là Hind II.

Hammihon Smith, Nobel 1978 cùng D.Nathans và W.Arber.

Enzym này là công cụ đầu tiên trong kỹ thuật di truyền. [Giải Nobel]

Kỹ thuật ADN tái [ổ hợp: Năm 1972, nhóm của Paul Berg tạo nên phân tử ADN [ái tổ hợp if7 vitro đầu tiên từ ba nguồn khác nhau: nguyên bộ gen virut s v 40 gây ung thư ở khỉ, một phần bộ gen của phage và các gen của operon lactoz của E. coỉi. Năm 1973, nhóm Cohen, Helenski, Boyer đã lần đàu tiên thu nhận được các sản phẩm có hoạt tinh từ ADN tủi tể hợp ờ E. coỉi [Giải Nobel] Stanley Cohert, Nobeỉ ỉ 986 cùng c. Sản xuất protein tái tổ hợp: Năm 1977 Rita Levi-Montaỉcini. được xem là năm mở màn cho kỳ nguyên của công nghệ sinh học khi lẩn đầu tiên hormon tăng trưởng ở ngựờì xomatostatin đuợc sản xuất thành công bằng con đường tái tổ hợp gen vào vi khuẩn.£. coỉi. Năm 1978, đã sản xuất insulin người lần đầu tiên nhờ công nghệ gen. d. Genomeics: Sự xác định chính xác trình tự [sequencing] từng nucỉeotit cùa ADN hay gọi ngắn là giảitrình tự chuỗi [sequencing] thành công ở các vi sinh vật và bộ gen người đã tạo nên khoa học về bộ gen gọi là genomeics [genome - bộ gen] hay bộ gen học. Genomeics giúp xác định nhanh chóng trình tự nucleotit của ADN bộ gen và các chức năng của chúng. Những sinh vật đầu tiên được hoàn tất giải trình tự chuỗi đầu tiên cũng là các Vi sinh vật. Vi khuân Haemophilus influenza. - 1995: Hai vi khuẩn, cũng là hai sinh vật cỏ cấu tạo tể bào đầu tiên được hoàn tất giải trình tự chuỗi [sequencing] bộ gen là Haemophilus influenza vả Mycoplasma gemtaỉlum. ~ Thảng 5/1996, nấm men Saccharomyces cerevisiae, sinh vật Nhân thực Eukaryota đầu tiên được giải trình tự chuỗi hoàn tất. - Tháng 9/1997: đăng tải trình tự bộ gen hoàn chỉnh của E. coỉỉ. Toàn bộ việc giải trình tự chuỗi ADN ở tất cả các sinh vật, kể cả bộ gen người đều sử dụng các công cụ từ các đối tượng Vi sinh vật như enzym cắt giới hạn, vector plasmid tạo dòng, NST nhân tạo của nấm men [YAC] và vi khuẩn [BAC]. 20.1.1.6.

Sự hấp đẫn đối với cảc nhà vật lỷ và hỏa học

Di truyền học hiện đại đã hình thành những phương pháp phân tích di truyền [methodes of gentic analysis] cho phép phát hiện các quá trình sinh học của tính di truyền

311

và biến dị đến cấp độ phân tử và nguyên tử, tức những phạm trù nghiên cứu chủ yếu của vật lý và hỏa học. Các vi sinh vật như vi nấm, vi khuẩn và phage đã đóng vai trò quyết định trong vẩn đề nảy. Dĩ nhiên, sự nhận thức các quá trình di truyền ở cấp độ phân tử chỉ trở thành hiện thực sau phát minh chuỗi xoắn kép ADN. Nhiều người cho rằng vai trò hàng đầu trong sự hình thành di truyền học phân tử là việc sử dụng rộng rãi các phương pháp vật lý và hỏa học. Vật lý và hóa học đã và đang đỏng vai trò quyết định trong các nghiên cứu những cơ chế phức tạp và mối quan hệ của bộ gen với các quá trình sinh tổng hợp trong tế bào. Tuy nhiên ý nghĩa căn bản của các quan niệm di truyền phân tử là sự tăng vọt năng lực phân giải di truyền [gentic resolving power] nhờ việc sử dụng các vi sinh vật. Vì thế cỏ thể nói rằng sự phát triển các quan niệm di truyền phân tử trở thành hiện thực nhờ di truyền học vi sinh vật. Đánh giá vai trò của các nhà vật lý học ừong sự phát triển của đì truyền học phần tử, có thể phân họ thành 2 nhóm. Một nhóm tham gia trực tiếp vào các thí nghiệm di truyền vi khuẩn và bacteriophage [Delbruck, Benzer, Fris, Leventaỉ,...] và họ đã thực hiện những công trình rất thú vị, tuy nhiên họ không tạo ra phương pháp nào mới trong phân tích di truyền [gentic analysis]. Sự tham gia của họ vào di truyền học rất có lợi nhờ nguồn sáng tạo của tư duy vật lý. Nhóm các nhà vật lý khác tham gia vào di truyền học bằng các “suy diễn trí tuệ” và ít có đóng góp cho di truyền học phân tử. Trên thực tế, mầm mống của di truyền học phân tử đã chứa đựng ngay trong học thuyết về gen cua Mendel, trong các nguyên lý di truyền nhiễm sắc thể của Morgan. Trong những năm 1940, một giai đoạn mới của đi truyền học bắt đầu. Vào thòi điểm này cỏ một nhóm các nhà khoa học quan tâm đến bàn chất của gen. Phần lớn họ ỉà các nhà vật ]ý học, họ khác các nhà đi truyền học cổ điển cả về tư duy lẫn định hướng. Đa số các “tân binh„ này rất ít biết về những thành tựu đi truyền học trong vài thập niên trước đó, thậm chí cả sinh học nói chung. Sự quan tâm của họ đến sinh học chỉ giới hạn chủ yếu vào vấn đề thông tin dì truyền có cơ sờ vật lý như thể nào? Việc các nhà vật lý học tham gia giài quyểt các vấn đề sinh học thỉ không phải điều lạ, vì ngay Mendel xuất thân cũng là một nhà vật lý học. Tuy nhiên sự cuốn hút các nhà vật lý học đén với di truyền học vào những năm 1940 còn có nguyên nhân đặc biệt. Đúng vào thời điểm này, khi mà giới khoa học ngừng phổ biến 'sinh ỉực luận thì nhà vật lý học nổi tiếng Niels Bohr, được giải Nobel về thuyểt cơ ỉượng tử [Quantic Mechanics], nêu ra quan điểm rằng một sổ qua trình sinh học cỏ thể không giải thích trọn vẹn bằng các khải niệm vật lý cổ điển. Sau khi xây dựng thuyết cơ lượng tử, Bohr phát triển các khái niệm tổng quát hơn. Năm 1932, tại hội nghị quốc tế về quang học, Bohr đã phát biểu rằng:“Sự công nhận tầm quan trọng rất lớn của các nguyên tử căn bàn trong các chức năng của các sinh vật tự nó không đủ đê giải thích một cách toàn diện các hiện tượng sinh học. vấn đề là ờ

312

chỗ làm thế nào khi phân tích các hiện tượng tự nhiên không bỏ sót một số đặc điểm rất quan trọng để hiểu về sự sống trên cơ sờ thí nghiệm vật lý”. Năm 1935, Max Delbrtick, học trò của Bohr, trong bài báo “'Về bản chất các đột biển gen và cấu trúc gerT đã giải thích ràng, chính Di tuyền học là lĩnh vực sinh học, mà trong đó những giải thích từ các quan điểm vật lý và hóa học dường như “không đủ” theo quan niệm mà Bohr nêu ra. Ông chỉ ra ràng “nếu như trong vật lý các số đo, về căn bản, dẫn đến đo không gian và thời gian, còn khái niệm căn bản của di truyền học - sự khác nhau trong tính trạng - chẳng lẽ có thể biểu thị trong những đơn vị tuyệt đối”. Theo Delbrùck, di truyền học có tính độc lập và gen ìà phân tử có tỉnh ổn định cao trong một thời gian dài không phụ thuộc tác động của môi trường. Năm 1945, ngay sau thế chiến thứ II, quyển sách nhỏ “Thế nào ỉà sự sống ?” [What is the life ?] đã được xuất bản. Tác giả của cuốn sách là E. Schrodinger, một trong những nhà vật lý học nổi tiếng xây dựng thuyết cơ học lượng từ. Quyển sách đã thu hút được sự chú ý của công chúng, đặc biệt là các nhà vật lý học, vì trong đó Schrodinger cổ vũ cho nghiên cứu sinh học tìm các quy luật vật lý mới. Bắt đầu quyển sách, Schrõdinger cho rằng “việc vật lý và hóa học hiện đại chưa có khả năng giải thích các quá trinh sống không có nghĩa là không thể giải thích nhờ các khoa học này”. Ông cho rẳng chính tính di truyền là chủ đề cần được giải thích. Điều làm cho Schrodinger ngạc nhiên là làm thế nào các gen nhỏ bé có thể kháng lại những dao động của môi trường diễn ra liên tục mà như hình dạng môì của dòng họ Gabsburg được truyền qua nhiều thế kỳ. ông cho rằng nhiễm sẳc thể là một tinh thể ả chu kỳ [aperiodic crystall], trên đỏ có sự sắp xếp các mã di truyền [gnetic code] theo một thứ tự chính xác. Schrốdinger cho rằng trong chất sống có “những quy luật vật lý chưa biết đến”. Các quan điểm của Bohr và Schrodinger đã cổ vũ nhiều nhà vật lý học chuyển sang nghiên cứu di truyền học với hoài bão ỉãng mạn là tìm ra các quy ỉuật vật lý mới trong bản chất câu trúc gen. Đến năm 1965, kỷ niệm 100 năm công trinh của Menđel, bản chất của gen đã được sáng tỏ, nhưng không tìm ra quy luật vật lý mới, ngoải chuyện đứt và nổi các liên kểt hydro. Tuy nhiên, cỏ thể nói di truyền học được tiếp thêm một nguồn sinh lực mới đó là các nhà vật lý, hóa học với các công cụ và tư duy chinh xác thực hiện thí nghiệm trên những đổi tượng Vi sinh vật có nhiều ưu thế. Họ bắt đầu các nghiên cứu từ những sinh vật đơn giàn nhất đỏ là các phage, vi khuần - là các sinh vật nhân sơ. M. Delbruck, một nhà vật lý học đã chuyển hoàn toàn sang nghiên cứu sinh học, đã phát biểu ràng lĩnh vực nghiên cứu virut cùa vi khuẩn ỉà săn chơi tuyệt vời, nơi mà nhiều câu hỏi sâu xa cỏ thể nảy sinh, Thêm vào đó hóa học trên đà phát triển của mình đã cung cấp nhiều phương pháp tinh vi mởỉ để xác định đánh giá các kết quả thí nghiệm.

313

20.2. ƯU TH É CỦA CÁC Đ Ớ I TƯỢNG VI SINH VẶT Trong nghiên cứu di truyền học, các đối tượng vi sinh vật có nhiều ưu thế hơn hẳn các động vật thực vật bậc cao.

20.2.1. Thòi gian thế hệ ngắn, tốc độ sinh sản nhanh Trong điều kiện thuận lợi, tế bào E.coỉi có thể phân chia một lần trong 20 phút, còn bacteriophage có thể trong 30 - 40 phút tạo ra hảng trăm cá thể, nấm men có thể phân chia tế bào trong 2 giờ. Đặc điểm của nghiên cứu di truyền học là theo dõi qua nhiều thế hệ nên các đối tượng vi sinh giúp rút ngắn đáng kể thòi gian thí nghiệm. Nếu so thời gian thể hệ của ruồi giấm 2 tuần, của chuột 2 tháng, của người 20 năm thì các vi sinh vật hơn hẳn. Nếu nhà di truyền học phải chờ 2 tuần để có một thế hệ ruồi giấm, thì đối vói E.coỉi, thí nghiệm hôm trước, qua ngày sau đã có thể đánh giá kết quà.

20.2.2. Tăng vọt số lượng cá thể Các vi sinh vật đơn bào, mỗi tế bào là một cá thể. Nếu đủ dinh dưỡng các vi sinh vật sinh sản nhanh tạo quần thể cỏ sổ lượng cá thể lởn có thể khoảng 1010 - 1012 tế bào/ml. Tê bào E.coỉi cỏ đường kính 1 [im [micromet] nếu đủ dinh dưỡng và mọi điều kiện thuận lợi khác thì sau 44 giờ có thể tạo ra một lượng sinh khối nặng bằng quả đất. Ruồi giấm là đối tượng thuận tiện cho di truyền học quần thể cũng chỉ có thể đạt tới 105-106 cá thể. Nhờ số lượng lớn cá thể của vi sinh vật, có thể phát hiện các sụ kiện di truyền hiếm hoi [như đột biến hay các dạng tái tổ hợp] với tần số 10“8 “ 10-11.

Ruôi giâm. Như vậy, sổ lượng cá thể lớn giúp nâng cao năng suất phân giải [resolving power] di truyền, tức khả năng phát hiện các đột biến và tái tổ hợp có tần số xuất hiện rất nhỏ. Ưu thế này lại được tăng thêm nhờ môi trường nuôi đơn giản, dễ nuôi cấy, dễ nhân giống, mà điều kiện nuôi cây không cồng kềnh, ít tốn diện tích hơn so với nuôi ruồi, nuôi chuột và ữồng cây. Môi trường nuôi cấy dễ kiểm soát theo công thức chặt chẽ như khi làm thí nghiệm hóa học.

20.2.3. Cấu tạo bộ gen đơn giản Vi khuẩn và virut có bộ gen là-ADN trần dễ tiến hành thí nghiệm trực tiếp trên ADN cũng như chiết tách tinh sạch, số locus cũng ít hơn so với các sinh vật khác. Các vi nấm và vi tảo có thể tồn tại ở dạng đơn bội [n] với thời gian đài, nên các gen ỉặn có thể biểu hiện ngay, mà khỏi phải tiến hành lai phân tích hay đưa về dạng đồng hợp tử lặn. Tuy nhiên, các vi sinh vật kể trên có trạng thái ỉưỡnp, bội [2n] nên cũng dễ dàng thực hiện phân tích tái tổ hợp. Các tính trạng ở vi sinh vật cũng đơn giản hơn, xác định di truyền các tính trạng này ít phức tạp hơn, nên dễ nghiên cứu. Đối với các tính trạng sinh hóa hay tính đề kháng thì có thể dễ dàng sử dụng môi trường chọn ỉọc để phát hiện.

20.2.4. Dề thu nhận các đột biến Các phân tích di truyền học phần lớn dựa vào những khác biệt của dạng bình thường so với đột biến. Tần số đột biến ở thực vật và động vật khoảng 10“5 - 10”7, khó thu nhận và cần thời gian dài khoảng vài thế hệ để khẳng định đúng là dạng đột biến. Nhiều đột biến ở động vật dễ gây chết nên số lượng đột biến thu nhận được ở động vật rất hạn chế. Các đột biến ở vi sinh vật có thể thu nhận dễ dàng, thậm chi cỏ tần số xuất hiện thấp 10-10, mà việc xác nhận dạng đột biến cũng rất nhanh. Nhờ ưu thế này mà di truyền học vi sinh vật phát triển rấtnhanhhình thành nên di truyền học phân tử và sinh học phân tử.

20.2.5. Dễ nghiên cứu bằng các kỹ thuật vật lý hóa học Đa sô các vi sinh vật có cẩu tạo đơn bào nên quần thể của chúngcỏ độ đằng nhất cao hơn so với các tế bào sinh vật đa bào bậc cao bắt nguồn từ nhiều loại mô khác nhau. Cấu tạo tế bào vi sinh vật đom giản, dễ chiết tách, tinh sạch ADN. Có thể nuôi vì sinh vật đồng nhất [synchronous culture] tức là đa số các tế bào ở những giai đoạn phát triển gần giống nhau. Độ đồng nhất cao của vật liệu thí nghiệm tạo thuận lợi cho việc sử dụng các phương pháp vật lý hỏa học trong nghiên cứu di truyền. Do những ưu điểm kể trên, với việc sử dụng các đối tượng vi sinh vật, di truyền học đã bước vào giai đoạn nghiên cứu di truyền “trong ống nghiệm” [in vitro]. Mặc dù các vi sinh vật có những đặc điểm riêng nhưng chúng vẫn tuân theo các quy luật di truyền chung, các kết quả thu được có thể đối chiếu áp dụng cho các vi sinh vật bậc cao.

315

20.3. CÁC ĐẶC ĐIẺM CỦA DI TRUYỀN HỌC VI SINH VẬT

20.3.1. Nghiên cứu trực tiếp ở cấp độ tế bào và cấp độ phân tử Di truyền học cổ điển sử dụng các mô hình đối tượng như đậu Hà Lan Pisum sativum, cây bắp [ngô] Zea mais, ruồi giấm Drosophila melanogaster và chuột nhắt Mus muscuỉus, là những sinh vật đa bào mà sự biểu hiện tính trạng phải trải qua một quả trình phát triển phức tạp và kèm theo biệt hóa. Ví dụ, tế bào hồng cầu ở động vật có vú chi chuyên sản xuất hemoglobin. Dĩ nhiên mọi biểu hiện sống đều liên quan đến tế bào, nhưng các quan sát ở những đối tượng trên là gián tiếp. Trong khi đó, nhiều đối tượng vi sinh vật như vi khuẩn Escherichia colì, nấm men Saccharomyces cerevisiae là sinh vật đơn bào nên các quan sát thực hiện trực tiếp hơn ở mức tế bào. Ví dụ, trên môi trường tối thiểu với ỉượng muối hữu cơ và glucoz cho trước, một ìế bào E. coỉi có thể tổng hợp tất cả các hợp chất cần thiết cho sự tăng trưởng, sống sót và sinh sản. Nếu tế bào bị đột biến mất khả năng tổng hợp một chất nào đó như một loại axit amin thì nó không mọc được trên môi trưcmg tối thiểu. Trên môi trường cỏ bổ sung thuốc kháng sinh thì chỉ có các tế bào đề kháng mới mọc được. Hơn nữa, các tế bào vi sinh vật có nhu cầu dinh dưỡng đơn giản dễ kiểm soát thành phần môi trường nuôi, dễ nuôi cấy, dễ nhân giống, dễ dàng thu nhận nhiều loại đột biến phục vụ cho nghiên cứu trực tiếp và nhanh chóng ở cấp độ tế bào, phân từ. Do vậy, chúng là những đối tượng lý tưởng cho nghiên cứu di truyền học phân tử.

20.3.2. Dòng tế bào Đặc điểm của các tế bào vi sinh vật là rẩt nhỏ bé, phải nhìn dưới kính hiển vi mới thấy được. Do vậy khó cỏ thể quan sát từng tế bào riêng lẻ, hơn nữa, bằng cách này cũng không ghi nhận được cảc tính trạng biến dưỡng, tính đề kháng và nhiều tính trạng khác. Do vậy, di truyền vi sinh vật không nghiên cứu từng tế bào riêng lẻ mà là đòng của tể bào, tức tập hợp của nhiều tế bào bắt nguồn từ một tế bào ban đàu nhở sính sản vô tính. Thông thường, tế bào vi sinh vật được cấy lên môi trường thạch đặc, rồi trải đều để các tế bào nằm rời xa ra thì mỗi tế bào mọc lên thành một cụm ròi gọi là khuẩn lạc [colony]. Mỗi khuẩn lạc cũng là một đòng tể bào [clone] gồm các tế bào bắt nguồn tự sự phân chia của một tế bào ban đầu.

Khuẩn ỉạc [colony] của vi sinh vật

Mỗi khuẩn lạc dễ nhìn thấy bàng mát thường, có tối thiểu 1o7 [mười triệu] tế bào. Như vậy, các tính trạng ở vỉ sinh vật được ghi nhận qua một quần thể gồm hàng trăm triệu, hàng tỉ tế bào. Dòng tế bào mang một đặc tính di truyền nào đỏ gọi là chủng [strain]. Ví dụ: chủng vi khuẩn tạo nhiều vitamin B 12 hay chủng vi khuẩn mất khả năng tổng hợp một axit amin nào đó.

20.3.3. Các tính trạng Các đột biến ở vi sinh vật thuờng được phát hiện theo sự biển đổi các tính trạng sau: a. Hình thái: kích thước, hỉnh dạng tế bào hay khuẩn lạc, có màng nhân hay không, khả năng di động... b. Sinh hóa: sự hiện diện của các sắc tố, màu sắc đặc trưng. c. Nuôi cấy: như kiểu hô hấp, kiểu dinh dưỡng [khuyết dưỡng - auxotroph] hoặc nhu cầu đòi hỏi các nhân tố tăng trưởng. d. Tinh đề kháng: như kháng thuốc, kháng phage, chịu nhiệt... e. Miễn dịch: như các phản ứng kháng thể, kháng nguyên... Các đột biển cỏ thể xuất hiện ngẫu nhiên hay do gây tạo ra nhờ các tác nhân gây đột biến. Mỗi gen có tần sổ đột biển đặc trưng. Các tính trạng ờ vi sinh vật được kí hiệu bàng 3 chữ tắt tiếng Anh hoặc đôi khi chữ hoa đầu tiên. Kèm theo kí hiệu còn thêm dấu + hoặc - hoặc chữ tắt để giải thích rõ thêm tính trạng. Ví dụ: lac để chỉ mất khả năng tổng hợp lactoz; his*' - tổng hợp histidin; strs nhạy cảm [Sensible] với Streptomycin, strR- đề kháng [Resistant] với Streptomycin. Để chi hai giới tính khác nhau không dùng hai kí hiệu 5 và s thay vào đó là các chữ như mỉ [+], mt [-] [mating typ] [ở Chỉamydomonas reỉnhardi], hoặc A, a [ở Neurospora crassa] hay a v à ữ [vi nấm].

Tảo đom bào Chỉamydomonas

317

20.3.4. Cấu trúc bộ gen ADN hiện diện trong bộ gen [Genome] của tất cả các loại tế bào từ vi khuân đên người. Giữa các sinh vật nhân sơ Prokaryota và nhân chuân Eukaryota có sự khác nhau đáng kể về kích thước, thành phần cấu tạo và tổ chức của ADN trong tế bào. Bộ gen của vi khuẩn E. coỉi và đa số các sinh vật nhân sơ là mội phân tử ADN có dạng vòng tròn kín. Khái niệm nhiễm sắc thể hiện nay được dùng cho cả vi khuẩn, nên nói nhiễm sắc thể vi khuẩn ta hiểu đó là sợi ADN. Ty thể và lục lạp cũng cỏ ADN riêng, mà cấu trúc bộ gen cũng tương tự vi khuẩn. Đa phần ADN của Eukaryota như nấm sợi, nấm men, vi tảo được tổ chức thành nhiều nhiễm sắc thể trong nhân tế bào. Mỗi nhiễm sắc thể chứa 1 phân tử ADN thăng mạch kép kèm theo một số protein nhu histon. Các nhiễm sắc thể có số lượng và hình dạng đặc trưng cho tế bào của mỗi loài sinh vật nhân chuẩn. Các virut có bộ gen rất đa dạng: ADN mạch đơn hoặc kép, ARN mạch đơn hoặc kép, nhưng chỉ một loại phân tử.

20.3.5. Kiểu sinh sản Các nấm sợi, nấm men, vi tảo có các quá trình sinh sản vổ tỉnh và hữu tính về căn bản giống các sinh vật bậc cao, thực hiện qua nguyên phân và giảm phần. Các vi khuẩn không có các cơ chế nguyên phân và giảm phân, phân chia tế bào theo cơ chế trực phân, nhưng cũng có sinh sản vô tính và sự trao đổi thông tin di truyền tương tự sinh sản hữu tính được gọi là quá trình cận hữu tỉnh. Các virut chỉ sinh sản ừong tế bào chủ sổng với nhiều cơ chế khác nhau phụ thuộc kiểu virut.

20.3.6. Vấn đề biến dị ở vỉ sinh vật Mãi đến năm 40, G. Beadle và E.Tatum lần đầu tiên sử dụng vi nấm Neurospora crassa vào nghiên cứu đi truyền học. Việc sử dụng chậm ừễ các đối tượng vi sinh vật vào nghiên cứu di truyền, một phần lớn do vấn đề biển dị. Trong khi ờ thực vật, động vật sự di truyền ở các tính tập nhiễm [do luyện tập hay bị nhiễm trong đời sống cá thể] đã được khẳng đjnh là không có thì ờ vi sinh vật vấn đề được hiểu ngược lại: chúng biển đôi trực tiếp dưới tác động môi trường. Nhiều hiện tượng thực tế tạo cảm giác các vi sinh vật biển đổi dưới tác động trực tiếp của môi trường. Ví dụ, hiện tượng các vi sinh vật nhòm thuốc hay các chất độc. Lúc đầu thuốc kháng sinh sử đụng với liều thấp, đần dần các vi sinh vật nhờn thuốc nên phải sử đụng liều cao. Trước đây một quan niệm phổ biến là các vi sinh vật biến đổi theo những quy luật đi truyền khác. Có thể nói vấn đề biến dị ở vi sinh vật là thành trì cuổi cùng của chù nghĩa Lamack [công nhận sự di truyền tỉnh tập nhiễm].

318

Tuy nhiên một số nhà di truyền học cho ràng biến dị ở vi sinh vật cũng tuân theo quy luật di truyền chung. Hiện tượng quen thuốc được giải thích là phẩn lớn tế bào nhạy cảm bị diệt, một số ít bị đột biến kháng thuốc còn sống sót nhờ sinh sản nhanh đã tạo quần thể mới vói kiểu gen kháng thuốc nên gây cảm giác “nhờn thuốc”. Tiếp theo nhiều thí nghiệm xác đáng chứng minh rằng biến dị ở vi sinh vật cũng xuất hiện do các đột biến ngẫu nhiên. Đó là thử nghiệm dao động [fluctuation test] của P.Luria vả M.Delbruck [1943] và đặc biệt là phương pháp in hay đóng dẩu của E. Lederberg [1952]. Max Deỉbruck, Nobel 1969 cùng với Cho đến nay, thực tế cho thấy các dữ liệu A.D.Hershey vàS. Lurìỉa. nghiên cứu di truyền phân tử từ ADN, ARN, protein và các quá trình khác thu được từ các đối tượng vi sinh vật hoàn toàn có thể áp dụng cho sinh vật bậc cao. Hơn thế nừa, nếu thiếu những nghiên cứu ở mức độ đơn giản hơn ừên các đối tượng này thì khó hiểu được những cơ chế phức tạp hơn rẩt nhiều ở sinh vật bậc cao. 20.4. CÁC ỦTVG DỤNG T H ựC TÉ Di truyền học là cơ sở khoa học của chọn giống. Các thành tựu của đi truyền học được ứng đụng sớm, nhanh và nhiều hơn cả cho đến nay là trong chọn giống. Bước đầu, chọn giống đột biển đuợc ứng dụng và đã được những thành tựu ngoạn mục làm cơ sờ cho sự phát triển của công nghiệp lên men. Bước phát triển tiếp theo có tính chất cách mạng là ứng dụng công nghệ gen dẫn đến sự bùng nổ của Công nghệ sinh học, mà thế kỳ 21 được mang danh.

20.4.1. Chọn giống đột biến Các thành tựu của Công nghiệp vi sinh vật không thể tầch ròi với những tiến bộ nhảy vọt trong chọn ỉọc các chủng có năng suẩt cao. Các phương pháp chọn lọc đột biến được ứng dụng vào chọn giống làm tăng năng suất tạo các sản phẩm, làm biển đổi bản chất hoả học các chất và khắc phục một sổ nhược điểm của chủng được đùng trong sản xuất công nghiệp. Phương pháp chọn giống này có các đặc điểm: - Thu nhận kết quả rất nhanh.

319

- C h ỉ đánh g iá sàn phẩm th u được, kh ôn g quan tâm các b iế n đ ổ i sin h lí, sin h hoá.

Vi nấm Penoiciỉỉium chrysogenum Quá trình chọn giống các chủng Penỉcỉỉlium chrysogenum ở Mỹ có thể lây làm ví dụ điển hình cho phương pháp này. Từ dòng ban đầu có sản lượng 60mg/l, chọn các đột biến ngẫu nhiên được dòng 150mg/l, và sau đó sử dụng các đột biến nhận được do tác động tia X và u v . Việc chọn lọc theo nguyên tắc: lấy dòng có sản lượng cao nhất đem gây đột biến rồi chọn chủng có năng suất cao hen. Qua nhĩều bước trung gian cuối cùng cho đến nay nhận được dòng E.15.1 có sản lượng 7000mg/l. Trong bảng 20.2 không nêu một thành tựu quan ữọng là tạo chủng không sản sinh ra sẳc tổ độc, phải tốn kém nhiều cho việc loại bỏ sắc tố. Việc nhận các đột biển không tổng hợp sắc tố đã làm giảm đáng kể chi phí sản xuất và các dòng này được sử dụng để nâng cao năng suất trong quá trình chọn giống tiêp theo. Phưcmg pháp chọn giống đột biến đuợc sử dụng để tạo các chủng sản sinh ra nhiêu axit amin [như glutamic axit] hay các nucleotit. Ngoài ra còn có thể nhận các đột biến liên quan đến cơ chế điều hoà trao đổi chất: - Các đột biển cơ cấu [constitutive mutants]: tạo sản phẩm không cần chất cảm ứng [inducer]. - Các đột biển kháng ức chể ngược là các đột biến tạo sản phẩm nhiều mà không bị ức chế bởi sản phẩm cuối [end product repression]. Phương pháp này đã đem lại những thành tích ngoạn mục, góp phần tích cực cho sự phát triển của công nghiệp lên men vị sinh như: - Chủng Penicillium chtysogenum ban đầu có năng suất 60 mg/1 và nay đạt 60000 mg/1, hom chủng ban đầu đến 1.000 lần. Chủng Corynebacterium glutamicum tạo glutamic axit đạt hom 200g/l [ban đầu 20g/l].

Vi khuẩn Corynebacterium gỉutamìcum.

- Chủng Serratia marcescens sinh ra biotin đạt 600mg/l.

Vi khuẩn Serratia marcescens

Riboflavin [vitamin B2] là sản phẩm thương mại được tổng hợp bằng phương pháp lên men và phương pháp hoá học. Siêu sản xuất riboflavin do 2 chùng vi nấm Eremothecium ashbyii vả Ashbya gossypii với sản lượng hom 20 g/1, gấp 40000 lần nhu cầu của nỏ.

Eremothecium ashbyỉi sinh vitamin B2ngay írên môi trỉtờng yy\

Sàn xuất vitamin B 12 ừong công nghiệp đo các chủng vi khuẩn Propionibacterium shermanii hoặc Pseudomonas denitrificans. Các chủng đột biến sản sinh một lượng sản phẩm lớn hơn rất nhiều so với nhu cầu của tế bào, thậm chí lớn hơn nhiều làn khối lượng khô cùa nó. Pseudomonas denitrificans sinh ra vitamin B ]2 gấp 100000 lần nhu cẩu của nó. Cấu trúc cùa vitamin B ỉ2.

20.4.2. Cuộc Cách mạng công nghệ sinh học Công nghệ sinh học [Biotechnology, CNSH] là một thuật ngữ khoa học do kỹ sư người Hungary là Karl Ereky nêu ra vào năm 1917 để chi quả trình nuôi lợn với quy mô lớn bằng thức ăn là củ cải đường lên men nhờ các vi sinh vật. Sau đó vào năm 1961, tạp chí khoa học “JouARNl of Microbiological and Biochemical Engineering and Technology” [Tạp chí kĩ thuật và công nghệ vi sinh sinh hóa] được đỗi tên thành “Biotechnology and Bioengineering” [“Công nghệ sinh học và kĩ thuật sinh học”]. Tuy nhiên, thuật ngữ này ít được nhắc đến ưong hơn 50 năm và chỉ được sử đụng rộng rãi sau phát minh ra Kĩ thuật đi truyền-Gentỉc engineering [KTDT] vào đầu những năm 70 của thế kỷ trước, cho nên có lúc người ta coi đó là sự "bùng nổ" của CNSH. Trước thập kỷ 70, CNSH được hiểu là sự lên men công nghiệp [industrial fermentation] vi sinh vật để tạo thương phẩm. Trong những thập kỷ 60 và 70, công nghệ lên men đã phát triển thành một ngành công nghiệp lớn ừên thế giới với doanh số gần ữăm tỉ USD/năm. Sự hoàn thiện các trang thiết bị ờ tất cả các khâu và sự kiểm soát, điều khiển phản ứng của tế bào ờ trinh độ cao làm tăng sân lượng đáng kể. Tuy nhiên, khâu quyết định lảm giảm đáng kể giá thành là năng suất chủng giống. Phương pháp chọn giống cổ điển được thực hiện với những chủng phân lập từ thiên nhiên và sau đó gây đột biển bằng tia tử ngoại, tia phóng xạ hay bẳng hóa chất.

322

CNSH thuở khởi đau.

Đẩu thập niên 1970, CNSH đã chuyển sang một giai đoạn mới cao hơn hẳn về chất nhờ KTDT. Các kĩ thuật mới cho phép tạo giống trực tiếp nhanh hơn, tận dụng nguồn gen từ nhiều sinh vật khác nhau để tạo các chủng sản lượng cao, mà ít tốn công sức để phân lập và gây đột biến như trước đây. Nhờ khả nãng vượt giới hạn tiến hóa của KTDT, các vi sinh vật, các tế bào động thực vật có thể được sử dụng như các “nhà máy sình học” [biological factories] để sàn xuất hàng loạt các protein người như insulin, hormone tăng trưởng, interferon,... Các động vật và thực vật có thể trở thành bioreactor tự nhiên tạo các sản phẩm từ gen lạ đưa vào, không cần lai tạo và chọn lọc các biến đị bằng lai trong loài như trước đây. Ngoài ra, KTDT đồng thời cung cấp các phương pháp ưị liệu và chẩn đoán mới để chữa trị bệnh ở người, cần nhấn mạnh răng, KTDT là công nghệ cao, gồm nhiều công đoạn phức tạp và nó thực sự đã tạo nên một cuộc cách mạng. Sự ra đời của Cách mạng sinh học mới làm cho thuật ngữ Công nghệ sinh học trở nên thông dụng vào nửa sau những năm 70. Trước 1973, người ta thường dùng các từ “Vi sình công nghiệp, Công nghệ lẽn men, Kĩ thuật sinh ho ả”.,. Công nghệ sinh học là một thuật ngữ rất đạt, đã bao hàm trong nó tất cả những tên đã gọi về các lĩnh vực ứng đụng trước đây và với nội dung mới. Nó phản ánh những thành tựu hết sức to lớn của sự phát ứiển sinh học ừong nhiều thập niên trước đó. Cách mạng sinh học mới cao hơn hẳn về chất so với “Cách mạng xanh” vào những năm 60. Từ thuở sơ khai thời cổ La Mã-Hi Lạp, khoa học là một hệ thổng nhất. Đên thời Phục hưng, sự phát ừiển khoa học dẫn đến sự tách biệt thành các ngành và chuyên ngành. Điều này cũng thể hiện rõ trong sinh học cho đến nay. Sự xuất hiện của cách mạng mới đã tạo ra các lĩnh vực đa ngành và hợp nhất các ứng dụng sinh học ở cấp độ tế bào VÀphân tử, đồng thòi gắn liền với công nghệ, dưới tên gọi chung là CNSH và được coi như "quyền lực ghê gớm nhất mà loài người giành đuợc kể từ sau thành tựu phân hạch nguyên tử " hay" Chúa tể của thế kỉ 21 Khó kể hết những thành tựu vô cùng to lớn của CNSH đến mức mà thế kỷ 21 được mang danh là thế kỷ công nghệ sinh học. Ở đây chỉ nêu tiếp một sổ ứng dụng chủ yếu liên quan đến các đối tượng vi sinh vật.

20.4.3. Giải mã các bộ gen của vi sinh vật Ngay từ năm 1995, Cr. Venter đã hoàn tất việc giải kí tự chuỗi của 2 loài vi khuẩn Haemophilus influenzae [1830121 bp] và Mycoplasma genitatum [0,58Mb]. Hiện nay, sổ vi sinh vật được giải kí tự ehuỗi bộ gen đã xong là hơn 200 loài. Ngoài ra, nhiều loài quan trọng khác gồm: Streptomyces coeỉicoỉor [9,05Mb - 1996], Bacillus subtilis [4,21Mb 1997], Agrobacterium tumefaciens [,67Mb - 2001], Xanthomonas campestrìs [5,08Mb 2002] và Corynebacterium gỉutamicum [3,31Mb - 2003] đã biết được chi tiết về bộ gen.

323

Sự hiểu biết genomeics vi sinh vật có ỷ nghĩa hết sức quan trọng về mặt khoa học cơ bản cũng như ứng dụng, mà dự án nêu sau là một ví dụ về nghiên cứu đi sâu vào bản chất sự sống. Từ năm 2001, dự án tế bào vỉ sinh vật [Microbial Cell Project - MCP] được thực hiện với bốn mục tiêu: 1] Xác định các protein vi sinh tổ hợp thành các bộ máy protein để thực hiện nhiều qũá trình nội bào quan ừọng cho sự sống ; 2] Đánh giá đặc tính môi trường nội bào và các hiệu quà của nỏ lên các protein và bộ máy protein đến thực hiện các chức năng ; 3] Đánh giá đặc tính phân bố, số lượng, các luồng protein và bộ máy protein nội bào ; 4] Dùng điện toán xây dựng các mô hình gen - gen, gen - protein, các tương tác protein protein và hoá sinh nội bào. 20.4.4. Công nghệ protein tái tổ họp Những thí nghiệm tạo dòng gen đầu tiên được thực hiện ở vi sinh vật. Nhờ thao tác dễ dàng lại có công nghệ lên men phát triển mạnh, các vi sinh vật đã cung cấp rất nhiều sàn phẩm ở quy mô công nghiệp do KTDT, từ các protein, ADN, ARN đến các phân tử nhỏ. Từ lâu, các nhà khoa học mong muốn sản xuất các protein với số lượng lớn. Công nghệ gen cho phép sản xuất nhiều loại protein tải tồ hợp [recombinant protein - r-protein] khác nhau không những với sổ ỉượng lởn mà còn có chất lượng protein tốt hơn. Công nghệ r-protein thật sự đang phát triển với nhiều thành tựu rất ngoạn mục. Nhiều protein trị bệnh được biểu hiện ở các hệ thống vi khuẩn, nấm men. Chúng cần cho chữa trị một số bệnh, nhưng chiết tách từ cơ thể thì số lượng ít. Các r-protein đầu tiên được sản xuẩt nhờ các vi sinh vật chù như E. coỉi hay nấm men s. cerevisiae. Cụ thể là sáu trong bảy loại protein trị liệu với tổng doanh sổ không dưới 15 tỉ USD, mà bằng sáng chế [patent] đã hết hạn [thường khoảng 15 - 20 năm], được nêu trên bảng 20.1. Các protein tái tổ hợp được sản xuất gồm các nhóm chủ yểu: Bảng 20.1: Sáu loại r-protein trị liệu do E. coli hay s. cerevỉsiae tạo ra STT ] 2

Tên sản phẩm Insulin Interferon alpha

3 Interferon beta 4 Hormone tăng tnrờng người 5 -1 Erythropoetin 6 G-CSF [Granulocyte- Colony Stimulating Factor]

Các bệnh được điều trị Tiểu đường Viêm gan siêu vi c, mụn cóc qua đường tình dục, ung thư Xơ cứng [Multiple sclerosis] Thiểu năng tăng trưởng [Growth defiency] Thiếu máu Hóa tri liệu giảm bạch cầu trung tính [Chemotherapy-induced neutropenia]

Năm hết hạn patent 2001 2002 2003 2003 2004 2006

- Các protein trị liệu như một số nêu ưên bảng 20.1. - Các enzym: ADNz I, alginat lyaz, phenylalanin amoni lyaz, alpha-1-antitrypsin. - Các kháng thể dùng trong chẩn đoán và chữa trị nhiều bệnh. 20.4.5. Tạo các giếng vi sinh vật nhờ kĩ thuật di truyền E. coìi, Saccharomyces cerevisiae là những đối tượng đầu tiên được sử dụng KTDT để tạo ra các chủng sản xuất các r-protein người, tiếp đó là nhiều vi sinh vật khác. Sau đây là vài ví dụ cụ thể. a. Thiết kế trao đổi chất [Metabolic Design] KTDT đã can thiệp vào quá trình trao đổi chẩt ở cấp độ gen để sản xuất các chất phân tử nhỏ. Các ứng dụng đầu tiên của metaboỉomỉcs, công nghệ gen điều khiển trao đỏi chất, thực hiện ờ vi sinh vật. Hai ví dụ điển hình đầu tiên là tạo đòng tể bào E. coỉi sinh tổng hợp các chất, mà vốn nó không có khả năng này, như xanh indìgo và sắc tố đen melanin. Sự tạo dòng một gen từ Pseudomonas putìda vào E.coỉì làm nó có khả năng tổng hợp indigo xanh trong môi truờng có tryptophan. Sự tạo dòng gen tyrosinaz cho E. coỉi làm nó biến tyrozin thành dopaquìnom và chất này ngẫu biến thành melanin khi có không khí. Tiếp theo, các sàn phẩm trao đổi chất sơ cấp và thứ cấp được sản xuất từ các dòng thiết kế như các chủng sử đụng lactoz, chuyển hoả xyloz, sản xuất etanol từ pentoz, phân giải các chất dị sinh [xenobiotics],... b. Công nghệ bề mặt tể bào nấm men Các protein trên bề mặt tế bào nấm men cũng được tổng hợp bên trong tế bào, nhưng sau đó chúng được đưa ra gắn lên bề mặt tế bào. Dựa vào sự hiểu biết các gen tương ứng, công nghệ bể một tể bào [cell surface technology] đẫ ra đời, Sử dụng CN gen để cố định protein ngoại lai ừên bề mặt tế bào nhằm thay đổi và cải thiện chức năng của tế bào. Tiềm năng ứng dụng đa dạng của nó gồm: sản xuất các enzym, kháng thể, kháng nguyên, thụ thể.... Bước đầu, các nhà nghiên cứu đã thành công trong biểu hiện các enzym như glycosyl hydrolse, glucozamylaz, lipaz,... PTN Công nghệ sinh học phân tử của Đại học KHTN [TPHCM] đã tạo được chủng nấm men gắn protein GFP [green fluorescense protein protein phát huỳnh quang xanh lục của sứa] và chủng gắn alpha-amylaz. c. Sự can thiệp cùa KTDTvào sản xuất etanoỉ nhiên liệu Nấm men S. cerevisiae và vi khuẩn Zymomonas mobilis là 2 vi sinh vật chủ yếu có khả năng sử dụng ừong lên men etanol nhiên liệu. Nấm men vẫn giữ vai trò chủ yếu, nhưng nó không lên men xyloz, pentoz và một số loại đường khác. Do tầm quan trọng chiến lược cấp thiết, hiện tại và ưong tương lai có rất nhiều nổ lực được tập trung cho cải

325

thiện chủng giống nhằm sử dụng íổí hơn nguồn nguyên liệu đa dạng và thuận tiện cho quy trình công nghiệp. Các nghiên cứu chủ yểu nhằm thiết kế: - Các chùng sử dụng lactoz để tận dụng phụ phẩm công nghiệp sữa. - Các chủng vi sinh có khả năng chuyển hoá xyloz mà nấm men không đồng hoá - Các chủng nấm men phân giải tinh bột để lên men bột khỏi phải qua đường hoá. - Các chủng vi sinh vật để sản xuất etanoỉ từ pentoz. Ngoài ra, vấn đề quan trọng khác là sản xuất enzym cellulaz giá rẻ để giá thành etanoỉ nhiên liệu đủ sức cạnh tranh với xăng dầu. Chuyển hoả sinh khối thực vật thành etanoỉ nhiên liệu là một điểm nóng của CNSH hiện đạỉ. d. Cải biến các chủng vi sinh vật sản xuất vitamin - Riboflavin [Vitamin B2]: Phương pháp mói sử đụng các loài Candida hoặc chủng Bacillus subtiỉus tái tổ hợp cho sản lượng 20 - 30g/l. - Tổng hợp các tiền chất của vitamin: Gần đây [1990] đã thành công trong tạo đòng các gen cho sự sinh tổng hợp carotenoit vòng, chứa p-caroten từ Erwinia uredovora. Sau khi 4 gen sinh tổng hợp P-caroten được chuyển vào z. mobiỉis và Agrobacterium tumefaciens, các khuẩn lạc màu vàng thu được trên các đĩa thạch. Các thể tiếp hợp sản xuất 220 - 350yg p-caroten trên gram khối ĩượng khô ở phaz ổn định trong môi trường nuôi. - Sinh tổng hợp L-ascorbic axit được cải biến nhờ KTDT. L-ascorbic axit [Vitamin C] thực hiện tổng hợp thương mại theo một quy trình đất tiền, bao gồm 1 giai đoạn lên men Vi sinh vật và một số giai đoạn hóa học bắt đầu với D-glucoz. Giai đoạn cuối cùng trong quả trình là sự chuyển hoổ 2-keto~L-gỉucoznìc axìt [2-KLG] thành L-ascorbỉc axit dưới xúc tác là axit. Do đó, cách tốt nhất để chuyển hoá glucoz thành 2-KLG là chế tạo một Vi sinh vật có mang tất cả các enzym cần thiết. Việc chuyển hóa D-glucoz thành 2,5-DKG bằng Erwirtia herbicoỉa bao gồm nhiều bước xúc tác bởi enzym, trong khi đó sự chuyển đổi 2,5DKG thành 2-KLG do Corynebacterium sp. đòi hủi chỉ một bước. Chiến lược đơn giản nhất để thiết kế một sinh vật cỏ khả năng chuyển D-glucoz thành 2-KLG là tách gen 2,5DKG reductaz từ Corynebacterium sp. và cho biểu hiện ừong Erwirtia herbicola. Các tế bào Envỉnỉci được biển nạp gen 2,5-DKG reductaz có khả năng chuyển hoả trực tiểp D-gỉucơz thành 2-KLG, vỉ các enzym nội bào của Envini nằm ở màng trong của vi khuẩn chuyển glucoz thành 2,5-DKG và 2,5-DKG reductctz xúc tác chuyển 2,5-DKG thành 2-KLG. Do đó, bằng thao tác gen, khả năng chuyển hoá của 2 Vi sinh vật rất khác nhau lại được kêt hợp thành một và do đó cỏ khả năng tạo sản phẩm cuối của quá trình chuyển hoả được thiết kế. Sinh vật loại này rất hữu ích như là một nguồn 2-KLG cho sản

xuất L-ascorbic axit, bàng cách đó thay thế 3 công đoạn đầu của quy trình hiện đang được sử dụng. Thông qua đột biến điểm định hướng bàng oligonucleotit đã thu được đột biến 2,5DKG reductaz có hoạt tính cao hơn khoảng 2 lần và bền với nhiệt hơn đạng enzym tự nhiên. Tóm lại, KTDT đã thể hiện quyền lực to lớn trong cài biến sinh giới về nhiều mặt, không những thay đổi các tính trạng khác nhau, mà can thiệp cả đến chi tiết các thành phần và quá trình trao đổi chất. Trên các đối tượng vi sinh vật, công nghệ gen đuợc ứng dụng đầu tiên, kỹ thuật đa dạng, hiệu quả hơn cả và hàng loạt sản phẩm đã xâm nhập thị trường từ năm 1982. 20.5. BIÉN DỊ Ở VI SINH VẬT Biển dị và đột biến có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu đi truyền học. Các đột biến gồm nhiều loại khác nhau và chúng được thu nhận dễ dàng từ các vi sinh vật nhờ các phương pháp phát hiện chuyên biệt. Các đột biến gen bắt nguồn từ những biến đổi phân tử ữên ADN. Con người có thể sử dụng các tác nhân vật lí và hóa học gây nên các đột biến nhân tạo hay cảm ứng. Các nghiên cứu về hồi biến giúp hỉểu rõ hơn về các ức chể trong gen của sự dịch mã Biến dị ở vỉ sinh vật cũng tuân theo các quy luật di truyền như ở sinh vật bậc cao. Nó cỏ nhiều loại và số lượng rất lớn, cung cấp nguyên liệu thường xuyên cho quá trình tiến hóa và nghiên cứu di truyền học. Nhiều phương pháp phát hiện và chọn ỉọc các đột biến khác nhau được sử dụng để thu nhận các đột biến có tần số xuất hiện rất thấp. Chúng góp phần đáng kể cho các nghiên cứu di truyền. Các thay đổi thêm, mất hay thay thế các nucleotit trên phân từ ADN dẫn đến các biến đổi phân tử, gây ra các đột biến gen như: lệch khung, sai hay nhầm nghĩa và im lặng. Phát minh ra các tác nhân gây đột biến vật lí và hóa học làm tăng đáng kể nguồn đột biến phục vụ cho nghiên cứu và chọn giống. Con người có thể tăng nguồn biến dị bằng lai tạo hay sử dụng các tác nhân gây đột biến. 20.5.1. Đại cưomg về biến dị ở vi sinh vật 20.5.L ì. Biển dị ở vi sinh vật cũng tuân theo quy luật di truyền chung Cỏ nhiều phương pháp chứng minh biến dị ở vi sinh vật cùng do các đột biến. Ở đây chỉ nêu 2 phương pháp chủ yếu: thừ nghiệm dao động [fluctuation test] và đặc biệt là phương pháp in hay đỏng dấu của E. Lederberg [1952].

327

Nguyên lý của thử nghiệm dao động [fluctuation test] Năm 1943, Luria và Delbruck tiến hành thí nghiệm như sau. Lấy 20 ống nghiệm cho vào mỗi ống một ít môi trường nuôi [lml] lỏng với một ít tế bào vi khuẩn nhạy cảm với bacteriophage và ủ cho chúng sinh sản đạt 108 tế bào/ml. Lấy dịch nuôi 20 ống nuôi riêng' lẻ và 20 Ống vói số địch nuôi tương tự từ bình lớn nuôi chung và dịch từng ống cấy lên các hộp Petri môi trưởng đặc chứa bacteriophage. Nếu đột biến là sự kiện ngẫu nhiên thì số lượng thể đột biến [mutants] ít [2 ở hình bên ưái] hay nhiều [8 - hình bên phải] do xuất hiện muộn hay sớm như mô tả ừên hình 20.1.

Hình 20. ỉ: Đột biển ỉà sự kiện ngẫu nhiên: số lượng thề đột biến phụ thuộc thời điểm xuất hiện. Sổ lượng thề đột biến [các tể bào tô đậm] ít [2 ở hình bên trái] hay nhiều [8 - hình bên phái] do xuất hiện muộn hay sởm trong dòng tể bào. Kết quả cho thấy có sự dao động [fluctuation] về số lượng khuẩn lạc kháng phage mọc lên từ dịch nuôi của 20 ống nuôi riêng lè. Cụ thể: 11 ống không có khuẩn lạc đề kháng, số còn lại có 1, 1, 3, 5, 5, 6, 35, 64 và 107 khuẩn lạc/hộp Petri. Trong khi đó, dịch nuôi 20 ổng từ bình lớn nuôi chung ít có sự dao động từ hộp Petri này sang hộp khác và trong koảng 1 4 - 2 6 khuẩn lạc/hộp Petri hay thuốc kháng sinh. b. Phương pháp in hay đỏng dẩu Các vi khuẩn được cấy để mọc rời từng khuẩn lạc trên môi trường cỏ dinh dưỡng. Dùng miếng nhung [có nhiều lông mịn] ấn nhẹ lên bề mặt môi trường thường để ghi dấu các khuẩn lạc nhờ các lông mịn, sau in đúng các vị trí khuẩn lạc ừên môi trường có phage hay thuốc kháng sinh. Các khuẩn lạc đột biến kháng phage hay kháng sinh mọc lên được. Căn cứ vị trí khuẩn lạc không mọc ở bản sao tách các đột biến tương ứng [hỉnh 20.2].

ị I-----

---- 1

Hình 20.2: Phiỉơngpháp in dùng phát hiện các đột biển. Như vậy, phưcmg pháp in cho biết phát hiện các đột biến đề kháng các nhân tố bất lợi nào đấy của môi trường trong quần thể vi khuẩn từ trước khi các tế bào của chúng tiếp xúc với tác nhân này. Điều đó có nghĩa răng, ví dụ, streptomycin không phải là nguyên nhân gây biến dị kháng thuốc, mà chỉ là tác nhân chọn ỉọc gìữ lại các ầột biến đã xuất hiện trước khi tiếp xúc với thuốc. Các đột biển này có kiểu hình giúp cho vi khuẩn thích nghi với biến đổi của môi trường và nhờ sình sản nhanh sau một thời gian ngẳn quần thể có kiểu hình mới. Các kết quả nghiên cửu này khẳng định các vi sinh vật cũng tuân theo các quy luật di truyền như các động vật và thực vật. Điều này có ý nghĩa rất lớn cho sự phát triển của di truyền học và sinh học phân tử. Do vậy, giải Nobel Y học năm 1969 được trao P.Luria và M.Delbruck vể đóng góp này. 20.5,1.2. Quả trình đột biến tự nhiên Đột biến theo nghĩa rộng chỉ các biến đổi di truyền xảy ra đột ngột. Từ xa xưa, con người đã nhận thẩy nhiều đột biển tự nhiên. Nhiều giống cây trồng và vật nuôi bắt nguồn từ các đột biến. Đột biển gen là đột biến được hiểu theo nghĩa hẹp, là chỉ những biển đổi xày ra bên trong cấu trúc gen. Mỗi đột biến gen dẫn đến sự thay đổi trình tự nucleotit tạo ra các alen khác nhau. Đột biến có thể xảy ra do biến đổi nhiều nucleotit, có thể do 1 nucleotit. Đột biến gen không phát hiện được khi quan sát tế bào học. Trong tự nhiên, đù giữ trong điều kiện nào, tất cả các gen đều có đột biến, được gọi là đột biển tự nhiên hay ngẫu nhiên [spontanous mutation]. Các đột biến tự nhiên thường xuất hiện rất ít. Khái niệm tần số đột biển được dùng để đánh giá mức độ xuất hiện nhiều hay ít đột biến ở một gen. Có người phân biệt tần số [frequency] với tốc độ [rat] đột biến.

329

Bảng 20.2: Tần số đột biến ngẫu nhiên của một số gen Sình vật

Đột biến

Phage T2

Kim hãm tan r -» r+

E.coli

Lên men iactoz ỉac —> ỉac+ ỉeũ —*■ĩeu' arg+ arg trp+—» trp ara -» arã Kháng Streptomycin Stỉ2 -> StrR

Neurospora crassa

adenin ade' -» ade+

Tần số

Căn cử đánh giá

1.10'® Ị

đột biến/1 sao chép

2.10'7 7.10'10 4.10'9 6.10"8 2AQ-6

các tế bào đột biển / 1 lần phần bào đột biển /1 tế bào đột biển /1 tế bào đột biến /1 tế bào đột biến /1 tế bào

4.10'10

. đột biến /1 tế bào

4.10'8

đột biến/ 1 bào tử vô tính

Các gen khác nhau của cùng 1 sinh vật có thể có tần sổ đột biển khác nhau. Nhưng tần số đột biến tự nhiên đối với mỗi gen lả một số ổn định. Tần số đột biến được đánh giá theo các căn cứ khác nhau như: trên 1 lần sao chép, 1 lần phân bào hay ừên 1 giao tò và trên 1 tế bào /1 thế hệ [bảng 20.2]. Để dễ hiểu các số trên có thể tính đảo ngược lại. Ví dụ: Ở E.coỉi đột biến từ nhạy cảm với streptomycin sang kháng tức Sứ? ->StrR với tần số 4.10"10 đột biến tính trên 1 tế bào/1 thế hệ. Để dễ hiểu ta có thể tính ngược lại tức trong 10 tỉ tế bào của một thế hệ có 4 đột biếnSỈ^ [resistance] kháng streptomycin xuất hiện ngẫu nhiên. Tuy tần số đột biến của từng gen là rất thấp, nhưng tổng các đột biến của nhiều gen là một số đáng kể, có ý nghĩa quan trọng cho tiến hóa. Đột biến ảnh hưởng đến mọi tính trạng khác nhau của sinh vật và tác động theo mọi hướng.

20.5.2: Các loại đột biến thường gặp ở vi sinh vật Vi sinh vật cũng có các loại đột biến như ở sinh vật bậc cao. Ở đây chỉ nêụ các đột biến thường gặp ở vì sinh vật và có ý nghĩa quan trọng đối với đi truyền phân tử. 20.5.2. ĩ. Đột biến gen hay đột biến điểm Biến đổi rất nhỏ trên một đoạn ADN, thường liên quan đến 1 nucleotit hay 1 cặp nucleotit.

Đột biến đồng nghĩa [Samesense] còn gọi là trung tỉnh [neutral] hay im lặng [silent], khi codon mã hóa cho một axit amin bị biến đổi, thường ờ bazơ thứ ba nên vẫn mã hóa cho axit amin đó [do tính suy thoái của mã di truyền. b] Đột biến vô nghĩa [Non-sense] khi codon mã hóa cho một axit amin biến thành một trong ba codon UAA, UAG và UGA là các codon kết thúc không mã hóa cho axit amin nào. c] Đột biến sai nghĩa [Mis-sense]: Khi codon của axit amin này biến thành codon mã hóa cho axit atnin khác, làm thay đổi axit amin tương ứng trên phân tử protein. d] Đột biến lệch khung: Sự thêm 1 baza hay làm mất 1 bazơ dẫn đến các cođon sai nghĩa hay vô nghĩa so với codon tương ứng ban đầu từ điểm biến đổi về sau, sự dịch mã bị lệch khung cỏ tính dây chuyền từ bộ ba bị sai. 20.5.2.2- Đột biển nhiễm sắc thể Các đột biến nhiễm sắc thể hay còn gọi là sai hình nhiễm sắc thể xuất hiện ở sinh vật nhân thực. - Biến đổi trên 1 nhiễm sắc thể: mất đoạn, lặp đoạn, đảo đoạn. - Biến đổi giữa các nhiễm sẳc thể: chuyển đoạn. - Đột biến bộ gen [genome mutation] Đa bội thể [Polyploidy] hiểu theo nghĩa rộng là sự thay đổi số lượng nhiễm sắc thể gồm: Đa bội thể nguyên [Polyploidy hay Euploidy] [2n -> 3n, 4n, ...], đa bội thể ỉai còn gọi dị bội thể [AUoploidy][2n A + 2n B] và đa bội ỉệch [Aneuploidy], hay đa nhiễm:[yí dụ: 2n + I hoặc 2n - 1]. 20.5.2.3- Các biển đềi vi cấu trúc Các thay đổi thành phần nucleotit của gen. a] Đột biển thay thể: Thay một nucleotit này bằng nucleotit khác. - Đồng chuyển [Transition] khi pyrimidin được thay thế bời pyrimiđin hay purin bởi purin. Ví dụ: T thay cho c hoặc ngược lại. - Đảo chuyển [Transversion] khi pyrimidin được thay thế bởi purin hay purin bởi pyrimidin.VÍ dụ: T hay c thay cho A hoặc G và ngược lại. b] Mẩt nucỉeotit [Deletion]: Mất một phần nucleotit của gen. c] Đột biến xen nucleotỉt [Insertion mutant]: Thêm 1 hay nhiều nucleotit vào gen.

331

20.5,2.4- Các đột biến kiểu hình à] Các đột biến hình thái: Các biến đổi ảnh hường đến hình dạng, màu sắc và kích thước. Ví dụ: một dạng đột biến khuẩn lạc màu đỏ ở Serratia marcescen.

Hình 20.3. Đột biển khuẩn ỉạc màu đò ở Serratia marcescens.

Đột biến sinh hóa: - Các đột biến khuyết dưỡng [Auxotrophe mutation] làm mất khả năng tổng hợp các chất. - Các đột biến cỏ điều kiện: Các đột biến có thể không có biểu hiện trong những điều kiện giới hạn nhất định [restrictive condition] và có biểu hiện trong các điều kiện cho phép [permissive condition]. Ví dụ, các đột biến nhạy cảm với nhiệt độ cao có biểu hiện ở nhiệt độ tương ứng. - Đột biến đề kháng: Các biến đổi sinh hóa giúp kháng lại được các tác nhân bất lợi. 20.5.2.5.

Đôt biến vờ hồi biển

Đột biển thuận hay trực tiếp [Direct mutation]: Biến đổi từ kiểu hình hoang dại sang khác thường. b] Hồi biến [Reversion]: Đột biến từ kiểu hình đột biến quay về kiểu hình hoang dại. - Hồi biển thật hay đột biển nghịch. Biến đi ừở lại y như ban đầu. Ví dụ: adenin -» guanin t

Đột biến thuận

ađenin t

Đột biến nghịch.

- Đột biến Iậtc chế hay kìm hãm [Supressor]; Đột biến ở một điểm khác. Cả hai cùng tạo kiểu hình gần như hoang dại. - Đột biến kìm hãm ngoài gen: Xảy ra ở gen khác với gen bị đột biển.

Đột biến kìm hãm trong gen: Xảy ra ở nucleotit khác trong gen đưa gen trở về trạn thái tạo kiểu hình hoang dại. Nói chung, các đột biến là các biển đổi rắt đa dạng của vật chất di truyền và có nhiều tác động khác nhau. 20.5.3- Các phương pháp phát hiện đột bỉến Để nghiên cứu chi tiết về các đột biến, cần có các phương pháp phát hiện chúng một cách tương đối đầy đủ và chính xác. Đây là công việc khó khăn vì đa số đột biến ở dạng lặn và nhiều dạng khó phát hiện. Sự hoàn thiện các phương pháp phát hiện đột biến đã góp phần đáng kể cho sự phát triển của di truyền học và sinh học. 20.5.3,1-

Các hệ thống chọn lọc đột biến ở vỉ sinh vật

Muốn phát hiện các đột biến có hiệu quả càn có hệ thổng chọn lọc để tìm thấy các đột biến hiếm hoi trong khối rất lớn các dạng không đột biển. Các hệ thống chọn lọc đột biến có nhiều và phụ thuộc vào các đột biến khác nhau. Bảng 20.3 nêu các cách phát hiện 3 dạng đột biến. Bảng 20.3. Cơ sở phát hiện các kiểu hình đột biến của 3 loại đột biến căn cứ kiểu hình Đột biến có điều kiện [nhạy câm nhiệt độ]

Đột biến khuyết dưSmg

Đột biến đề kháng

Kiểu gen Nhiệt độ thường

Nhiệt độ cao

Kiểu hoang dại

Binh thưcmg Bình thuòmg

Đột biến

Bình thường

Đột biến

Không bổ sung

Có bổ sung

Không tác nhân

Có tác nhân

Tăng trưởng

Tăng trướng

Tăng trưởng

Không

Tăng trưởng

Khái niệm lực phân giải [resolving power] được đùng để chỉ khả năng phát hiện các đột biến rất hiếm. Lực phân giải càng lớn khi phát hiện được các đột biến càng hiếm. Ví dụ, các đột biến đề kháng có độ phân giải cao vì khi cấy sổ lượng rất lớn tế bào lên môi trường chọn lọc có chứa tác nhân đù phần lớn tế bào chết, chỉ số rất ít tế bào có đột biến đề kháng mọc thành khuẩn lạc.

333

20.5.3.2. Phương pháp đề kháng Ở vi khuẩn, các tác nhân chọn lọc thucmg là thuốc và phage. Các đột biến dễ dàng được phát hiện trên môi trường agar có thuốc hay phage ở dạng các khuẩn lạc được mọc lên như trên hình 20.3. 20.5.3.3. Phương pháp làm giàu chậm [Default enrichment method] Việc phát hiện các đột biến khuyết dưỡng khó khăn hơn. Dung dịch vi khuẩn pha loãng được cấy lên bề mặt môi trường agar tối thiểu để mọc rời thành khuẩn lạc. Một lớp môi trường tương tự được đổ lên trên, phủ ỉớp mỏng. Hộp Petri được ủ để các khuẩn lạc bình thường mọc lên. Sau đó, đổ phủ lên thêm một lớp môi trường đinh dưỡng có bổ sung và ủ tiếp cho chất bổ sung khuếch tán. Các đột biến khuyết dưỡng sẽ mọc sau, khi có chất bổ sung, nên khuẩn lạc nhỏ hom do mọc chậm. 20.5.3.4. Phương pháp làm giàu hạn chế [Limited enrichment method] Đây là đạng đơn giản hơn của phương pháp lảm giàu chậm. Các vi khuẩn được cấy trên môi trường tối thiểu có một ít bổ sung. Trong điều kiện đó, các đột biến khuyết dưỡng mọc đến khi hết chất đinh dưỡng bổ sung thì dừng, nên tạo khuẩn lạc nhỏ. Các vi khuẩn bình thường tiếp tục mọc tạo khuẩn lạc to. 20.5.3.5. Phương pháp làm giàu nhờpenỉxilin Phương pháp được áp dụng cho các vi khuẩn. Penixilin có tác động diệt các vi khuẩn bình thường khi phân chia. Các vi khuẩn được cho vào môi trưởng tối thiểu có penixilin. Các vi khuẩn đang tăng trưởng bị diệt, chỉ các tế bào đột biển không tăng trưởng còn sống sót. Sau đó, hỗn hợp được cấy lên môi trưởng không có penixỉlin thỉ các đột biến khuyết dưỡng mọc lên với tỉ lệ tương đối cao hơn [hình 20.4]. Te bào E. coli nuôi trong môi trường đủ được gây đột biển

Tế bào E. coli nuôi trong môi trường có penicillin thiếu leuxin

H ình 20.4. Phương p h á p penicillin chọn lọc âm tính [ví dụ chọn le u ].

334

Các tế bào E. coli được nuôi trên môi trường đủ và gây đột biến. Rửa sạch tế bào khỏi MT đủ và chuyển sang MT có penicillin thiếu leuxin [- leuxin]. Sau đó cấy tế bào lên hộp Petri chứa MT có leuxin [MT + leuxin], các tế bào mọc lên thành khuẩn lạc. In các khuẩn lạc sang hộp Petri chứa MT tối thiểu không có leuxin. So sảnh 2 hộp Petri xác định được dòng tế bào đột biến: mọc trên MT đủ [+ leuxin] và không mọc trên MT thiểu leuxin [- leuxin] 20.5.3.6. Phương pháp lọc Phương pháp được sử dụng để chọn lựa các đột biến khuyết dưỡng ở nấm sợi. Dung dịch các bào tử được nuôi trong môi trường dinh dưỡng thiếu chất bổ sung. Các đột biến thiếu chất bổ sung không mọc được, các dạng bình thường mọc ra nhiều sợi. Khi lọc qua màng lọc sợi thủy tinh, các dạng bình thường nhiều sợi bị giữ lại, các dạng đột biến đi qua màng lọc. Dung dịch có nhiều dạng đột biến được cấy lên môi trường có chất bổ sung và kiểm tra tìm các dạng đột biến. 20.5.3.7- Phương pháp ìn Các vi khuẩn được cấy để mọc rời từng khuẩn lạc trên môi trường có đinh dưỡng. D ù n g m iế n g n h u n g [có n h iều lông m ịn ] in đ ú n g các VỊ trí kh u ẩn lạc trê n m ô i trư ờ n g tối

thiểu. Các khuẩn lạc đột biến không mọc lên được. Căn cứ vị trí khụẩn lạc không mọc ờ bàn sao tách các đột biến khuyết dưỡng [hình 20.5 phía ttên]. a

b e d

1 Khuẩn lạc đột biến mọc trên môi trường âủ

I Khuẩn lạc đột biến không mọc

Môi trường đù

Môi trường tối thiểu

Hình 20.5. Phưcmg pháp in.

335

Khúc gỗ bọc miếng nhung vô trùng, b] Đĩa gốc trên môi trường đầy đù. c] Miếng nhung đã in dính tể bào tương ứng các khuẩn lạc. d] Môi trường đù hoặc có bổ sung chất cần thiết, e] Môi trường tẻi thiểu không có có bỗ sung. Ngoài các phương pháp nêu trên còn có các phương pháp chuyên biệt để phát hiện nhiều loại đột biển khác. 20.5.4- Cơ chế phân tử của đột biến 20.5.4.1- Các biến đổi írênA D N Tất cà các đột biến đểu do những thay đổi trình tự nucleotit ưên ADN. Các đột biến có thể xảy ngẫu nhiên [spontaneously] hay gây tạo [cảm ứng - induced] bởi các tác nhân gây đột biến [mutagens]. Các đột biến có thể do thay đổi từng cặp bazơ hay những trình tự đài hơn. Đột biển điểm [Point mutation] là biến đổi trình tự của một cặp bazơ. Đột biển điểm có thể do chuyển đổi hoá học bazơ này thành bazơ khác hoặc do bắt cặp sai trong sao chép. Sự biến đổi gồm nhiều kiểu: - Sự đồng chuyển: thay cặp G*c bàng A T và ngược lại. - Sự đảo chuyển: thay A-T bằng T-A và ngược lại. - Sự bát cộp sai [Bazơ mispairing] là sự bắt cặp không theo đúng nguyên tắc của mô hình Watson-Crick, mà là adenin vói cytosin, thymine với guanin. - Xen đoạn [Insertion] là sự thêm vào một đoạn cặp bazơ vào ADN. Tăng đôi đoạn [Duplication] là một dạng đặc biệt của xen đoạn. - Mất đoạn [deletion] là sự mất đi một trình tự ADN, mà trình tự hai bên nối lại với nhau trừ trường hợp mất đầu mút nhiễm sắc thể. Transposon hay phần tử di động [transposable element] là trình tự ADN có khả năng tự xen vào [hay bản sao chính nó] ờ vị trí mới ữên bộ gen [genome], mà không cần có quan hệ gì với locus mục tiêu. Xen đoạn là kiểu đột biến phổ biển nhất và do sự di chuyển của các phần tử di động [ch. VI]. Phần lớn đột biến ngẫu nhiên do sự hiện điện của các bazơ bất thường trên ADN. Ngoài ra, một số bazơ bị biển đổi [modified bazơs] như thường gặp hơn cà là 5meíyỉcytosin, được tạo ra do enzym metylaz thêm nhóm metyỉ vào một số cytosin ở những điểm đặc biệt trên ADN. 20.5.4.2- Các sai hỏng trong sao chép AD N Các đột biến có thể xảy ra do sai lầm khi sao chép ADN.

336

Mỗi bazơ tồn tại ở 2 dạng cấu trúc được gọi là tautomer. Ví dụ, adenin bình thường mang nhóm NH2 cung cấp nguyên tà hydro cho sự bắt cặp bổ sung với dạng keto [C = o keto form] cùa thymine. Khi có biến đổi tautomer, adenin chuyển sang cấu trúc hiểm là dạng imino NH sẽ bắt cặp bổ sung với cytosin. Thymine có thể chuyển sang dạng enoỉ [COH] không có trong ADN bình thường và bắt cặp với guanin. Khả năng bắt cặp sai của bazơ với tautomer không đúng đã được Watson và Crick nêu lên. Sự bắt cặp sai này có thể là các đột biến đồng chuyển, trong đó purin thay bằng purin khác và pyrimíđín thay bằng pyrimidin khác. Các biến đổi trên, ngoài việc thay thế các nucleotit ừên mạch ADN còn có thể làm tăng thêm hay khuyết các nucleotỉt gây nên các kiểu đột biến ảnh hường đến sinh tổng hợp protein. 20.5.4.3-

Ảnh hưởng của đột biến gen đến sinh tổng hợp protein

Sau khi tìm hiểu về dịch mã và mã di truyền, cần lưu ý đến biến đổi ảnh hưởng đến nghĩa codon và vị trí biến đổi ở đầu hay cuối mạch polypeptit. a] Đột biến lệch khung Hai kiểu đột biến có hiệu quả nặng là thêm bazơ [addition] và mất bazơ [delection]. Các biến đổi này thường làm enzym mất hoạt tính. Sự thêm 1 bazơ hay làm mất 1 bazơ dẫn đến sự dịch mã ỉệch khung. Từ điểm biến đổi về sau, từ bộ ba bị sai cái sai sẽ kéo đài liên tục đến cuối mạch polypeptit. Ví dụ; - Bình thường: mARN: CCG GGA AGC AAU Polypeptit: Pro Gly Ser

Asn

- Đột biến lệch khung xen đoạn [Frameshift - insertion] mARN: CCG AGG AAG CAA Polypeptit: Pro Arg Lys

Gln

- Đột biến lệch khung mất đoạn [Frameshift - deletion] mARN: CCG GAA GCA AUG Polypeptit: Pro GIu Asp Met Sự tổng hợp mạch polypeptit có thể bị kết thúc sớm néu sự lệch khung dẫn đến codon kết thúc. b] Đột biển thay thể [Bazơ substitution] Đột biến thay thế bazơ nếu là đột biến sai nghĩa [mis-sense] sẽ có hiệu quả thay đổi từ axit amin này thành axit amin khác trong mạch polypeptit, còn nếu là đột biển vô nghĩa

337

[non-sense] hay đột biến trung tính [hay im lặng] sẽ không ảnh hưởng đến mạch polypeptit Ví dụ: - Bình thường: mARN: CCG GGA AGC AAƯ Polypeptit: Pro Gly Ser

Asn

- Sai nghĩa [Missense]: mARN: CCG GCA AGC AAU Polypeptit: Pro Val Ser

Asn

- Vô nghĩa [Nonsense] mARN: CCG UGA AGC AAU Polypeptit: Pro STOP 20.5.4.4.

Sai hỏng ngẫu nhiên

Ngoài các sai hỏng ừong sao chép, phân tà ADN còn chịu các sai hỏng ngẫu nhiên có thể dẫn đến đột biến. Hai kiểu sai hỏng ngẫu nhiên thường gặp là mất purin [depurination] và mất amin [desamination]. Mất purin là kiểu sai hỏng thường hơn, xảy ra khi liên kết glycosidic giữa c 1 của pentoz với baza bị đứt và làm mất A hoặc G. Sự mất amin của cytosin tạo ra uracil. Các gốc Ư không được sửa sai sẽ bát cặp bổ sung với A trong sao chép, gây ra đồng chuyển G-C-»A-T. Trong các enzym sửa sai, uracil ADN-glycosylaz nhận biết đặc hiệu uracil trên ADN và cắt rời tạo lỗ hỏng, sau đó được tổng hợp lại đúng theo mạch bổ sung. Trên phân tử ADN, một sổ cytosin được metyl hóa thành 5-metyl cytosin, chất này mất nhỏm amin biến thành thymine. Sai hỏng này không bị uracil-ADN-glycolaz phát hiện nên không được sửa lại. Sự chuyển c —» T do mất amin thường xảy ra ở các điểm có 5metyl cytosin. Kiểu biến đổi này có ở cà vi khuẩn và tế bào sinh vật bậc cao. 20.5.5. Đột biến nhân tạo hay cảm ứng Các tác nhân làm tăng tần số đột biển cao hcm mức tự nhiên được gọi là các tác nhân gây đột biển [mutagen]. Các tác nhân vật lí như phóng xạ, tia X, tia tử ngoại gây đột biến. Nhiều hóa chất là tác nhân gây đột biến như các đồng đẳng của các bazơ nitric, HNƠ2 [niừous axit], các chất alxyl hỏa mạch...Các đột biến loại này được gọi là đột biển nhân tạo hay đột biến cảm ứng [induced mutation]. Đối với các vi sinh vật, các tác nhân gây đột biến chủ yếu là tia tử ngoại và một sổ hóa chất.

338

20.5.5.1. Tác động của tia tử ngoại Tia từ ngoại có bước sóng dài [10'5 - 10'6 cm] nên khó tạo ion, có lẽ chi tác động đến những chất hấp thu nó trực tiếp. Trong tế bào, các chất hữu cơ’có mạch vòng chủ yếu như purin và pyrimidin hấp thu trực tiếp tia tử ngoại. Mối liên quan chặt chẽ giữa tia tử ngoại và các cấu phần của ADN đã được chứng minh. ADN hấp thu tia tử ngoại mạnh nhất ở bước sóng 2537Ằ, đây chính là bước sóng làm tăng tần số đột biến.

Hĩnh 20.6. Tác động cùa tỉa từ ngoại tạo các dimer thymine. Dưới tác động cùa tia từ ngoại, cytosin gắn thêm phân tử nước vào liên kết c = c của mạch vòng [hình 20.6] và thymine bị đứt liên kết c = c mạch vòng nối 2 phân tử thành thymine dỉmer. Ston và các cộng sự đã nhận thấy tần số đột biến tăng lên ở Staphylococcus aureus khi môi trường nuôi chúng được chiểu tia ƯV trong thời gian ngăn trước khi cẩy vào. Đây là tác động gián tiếp của tia từ ngoại.

339

Có thể khi hiện diện oxy, tia tử ngoại tạo ra nhiều hơn các gốc peroxit: H* + 0 2

HO*2

HO *2 + H*-> H2O2 2HO*2 + H*

H2O2 + O2

Các peroxit là những phân tử có phản ứng mạnh, chúng dễ tạo các đột biến. Hiện tượng quang phục hồi [photoreactivation] là một đặc điểm trong tác động của tia u v . Sau khi chiếu tia tử ngoại lên tế bào, nếu để ngoài ánh sáng, thì các sai hỏng phần lớn được phục hồi. Ánh sáng có tác động hoạt hóa enzym sửa sai, cắt đút các thymine dimer. 20.5.5.2.Các tác nhãn gây đột biến hỏa chất Ngay từ đầu những năm 1930, Xakharov và Lobashov [Liên Xô] đã tiến hành thử nghiệm gây đột biến bằng hóa chất, nhưng hiệu quả chưa rõ. Vào những năm 40, trong thế chiến thứ hai ở Anh, Auerbach và Robson đã chứng minh hơi ngạt nitơ và sulfua có khả năng gây đột biến ở Drosophila [thòi này Đức bắn hcả ngạt sang nước Anh, nên họ phải nghiên cứu tác động sinh học của các chất độc này], v ề sau, nhiều nhóm hóa chất gây đột biến đã được tìm ra. Có nhiều hóa chất gây biến dị dì truyền, đến nay tim ra những hóa chất cho hiệu quả đột biến cao hơn cả phóng xạ. Các hóa chất gây đột biến có đặc điểm lả có thể chỉ gây hiệu quả đột biến đối với một số lượng ít đối tượng. Ví đụ: Streptomycin chỉ gây đột biến ở tảo đơn bào và một sổ vi sinh vật, không gây đột biến trên nhiều đối tượng khác. Các tác nhân gây đột biển hóa học cỏ thể chia thành các nhóm sau: Nhóm 1: Các chất ức chế tổng hợp nitơous bazơ trong cấu trúc ADN như coíĩein, etyl uretan...

H ình 20.7. Thymine

340

vờ 5-Bromuracil [dạng keto].

Hình 20.8. Adenin bẳt cặp với 5-Bromuracìl và Guanin với 5-Bromuracil.

Hình 20.9. Công thức của etyỉ metansuifonat [EMS] - Nhóm 2: Các chất đồng đẳng với nitơous bazơ như coíĩein, 5-bromuracil [hình 20.7 và 20.8], các chất gần giống với nítơous bazơ, nên nó làm ADN gắn nhầm khi tổng hợp. - Nhóm 3: Các chất alkyl hóa làm đứt mạch ADN như etyl metansulfonat [EMS] [hình 20.9], metyl metansulfonat [MMS], etylen imine [EI], niừosoguanidin [NG],... - Nhóm 4: Các chất khác như nhóm oxy hóa, khử,: Ngược với sai hỏng sao chép, các tác nhân gây đột biến như nitrous axit và khí ngạt nitơ [nitơ mustard] cỏ thề gây biến đổi trực tiếp ưên ADN. - Nhóm 5: các chất chêm vào ADN Nhỏm các chất gồm proflavin, màu acridin và cảc chất được gọi là ICR [ICR compound] là những chất có phân tử mặt phẳng tương tự cặp baza. Chúng có thể chêm vào phân tử ADN làm thêm hoặc mất bazơ. Chúng thường gây đột biến lệch khung do thêm hay mất bazơ. Tất cả các tác nhân gây đột biến đều là tác nhân gây ung thư [carcinogen], nhưng các tác nhân gây ung thư không phải đều gây đột biến. Hiện nay nhiều tác nhân gây đột biến được sử dụng trong chọn giống nhằm tăng nguồn biến đị. Bên cạnh đó với nạn ô nhiễm trên thế giới người ta phát hiện nhiều tác nhân đột biến hỏa học mới xuất hiện ưong môi trường.

341

20.5.6. Hồi biển Quá trình đột biến, nói chung, có tính thuận nghịch, nghĩa là nếu một gen A đột biến thành a [.A ~> à] thì, ngược lại alen a cũng có thể đột biến quay lại thành A [a ->A]. Thông thường một dạng được gọi lả đột biến khi nó mang kiểu hình khác với dạng hoang dại. Ví dụ, ruồi giấm hoang dại được bắt từ thiên nhiên vào phòng thí nghiệm có mắt đỏ. Trong quá trình nuôi xuất hiện dạng đột biến mắt trắng. Đột biến từ mắt đỏ hoang dại sang mắt trắng gọi là thuận vì từ hoang dại thành đột biến. Hồi biển là truờng hợp từ trạng thái đột biến do biến dị di truyền quay trở về kiểu hình hoang dại như đột biến từ mắt trắng trở lại thành mắt đỏ. Hồi biến do đột biến nghịch [back mutation] hoặc đo đột biến ức chể hay kìm hãm [supression]. 20.5.6.1.

Các đột biến nghịch

Đột biến nghịch có được khi gen đột biến có sự biến đổi quay ừở lại có y cấu trúc như gen hoang dại ban đầu. Trường hợp này khó xảy ra và khi lai trở lại với dòng hoang dại thì thế hệ con tất cà đều có kiểu hình hoang dại. Ví dụ: - Đột biến nghịch: m" -> m+, khi lai với dạng hoang dại cho thế hệ con đều hoang dại - Đột biến ức chế: m~su+-> nTsu-, khi lai với dạng hoang dại trong thế hệ con sẽ có một ít kiểu hình đột biến. 20.5.6.2-

Đột biến ức chế

Đột biến ức chể [Suppressor mutation] là đột biến có tác động ngược lại hay kìm hãm của một đột biến khác. Các đột biến ức chế có những tính chất sau: * Đột biến ức chế xảy ra ở điểm khác với đột biến bị ức chế. Khi lai thể hồi biến [revertant] với dạng hoang dại sẽ xuất hiện dạng đột biến bị ức ché do tái tổ hợp làm tách rời không bị kìm hãm bởi đột biến ức chế [hình 20.10]. - Đột biển ức ché có thể xảy ra ừong cùng một gen, ngoài gen hoặc ở gen khác. - Các đột biến ức ché có thể thực hiện tác động bằng nhiều cách khác nhau. Ví dụ, các đột biến ức chế có thể tảc động lên sự phiên mã, địch mã hay những biểu hiện sinh lí khác của tế bào. Đột biến kìm hãm thưòmg gặp hơn, nó có được đo 1 đột biến thứ hai làm cho biểu hiện kiểu hình của đột biến không biểu hiện ra được nên có kiểu hình hoang đại. Đột biến kìm hãm có thể xảy ra ngay ứên cấu trúc gen. Ví đụ: đột biến thuận mất một nucleotit, đột biến kìm hãm xảy ra gần chỗ đó thêm vào một nucleotit. Đột biến kìm hãm có thể đo sự bổ sung trong chu trinh trao đổi chất. Sai hỏng do đột biến thứ hai tạo sản phẩm bù trừ được đột biến thứ nhất.

342

Vào năm 1962, S.Benzer và Chemp mô tả đột biến được gọi là đột biến amber ở locus rll của phage T4. Chúng có thể trờ về kiểu hình hoang dại do đột biến khác [đột biến ức chế] ở bộ gen của tế bào chủ. Các đột biến ức chế được phát hiện ở nhiều gen khác của phage T4 và E.coỉi. Các nghiên cứu sử dụng hệ thống gen- enzym cho thấy, các đột biến amber dẫn đến sự kết thúc sớm hơn bình thường sự mọc dài của mạch polypeptit và ở trong các tể bào chỉ các đoạn có đầu NH 2 của các polypeptit tương ứng được tổng hợp. Nhờ đột biến ức chế, tổng hợp mạch polypeptit được hồi phục. A.Haren, khi nghiên cứu sự kiểm soát di truyền đối với tổng hợp enzym photphataz kiềm ở E.colì, đã so sánh thành phần các gốc axit amin trên phân tử enzym của dạng hoang dại và ở các thể hồi biến trong gen mã hóa cho enzym. Kết quả trên hình 20.10 cho thấy các ức chế đối với amber liên quan đến một thay thế nucleotit trong codon. Trên cơ sở các sổ liệu này đã xác định được codon - amber là UAG. Sau đó, 2 codon chấm dứt khác được tìm ra là ochre UAA và opaỉ VGA.

UGG Trp ÁAG Lys' CAG Gly GÀG Glu

Amber UAG

s&r Trn ■^Trp Leu

UCG UÁU UAC UUG

Hình 20.10. Sự thay thể các axit amin do các đột biến ức chế đổì với các đột biển amber ở gen cẩu trúc của enzym photphataz kiềm. Cảc biển đ ị ức chế được đùng để nghiên cứu sâu hơn về cơ chế dịch mã. Ví dụ, các đột biến ảnh hưởng tới anticodon của tARN, làm thay đổi tính đặc hiệu mã hóa của nó, có thể tạo khả năng ức chế đột biến khác ờ mức phiên mã. Các đột biến ức chế đối với cođon vô nghĩa [nonsens-suppressor] thường xảy ra trên các tARN, mà anticođon của nó có thể bị biến thành anticodon bổ sung với codon kết thúc do sự thay thế một nucleotit. Các nonsens - suppressor như vậy thường là ừội. Có thể xảy ra các đột biến ức chế đối với các đột biển nhầm nghĩa. Ví đụ, tARN8ly của axit amin glycine có anticodon CGC thường bắt cặp với GGG [gly] trên mARN. Sự biến đổi đột biến cùa anticodon thành c u c dẫn đến chỗ tARN8ly đột biến bát cặp với GAG [glutamic axit]. Như vậy, néu như đột biến thuận ở một gen cấu trúc nào đỏ biến codon GGG [glycine] thành GAG [glutamic axit] của đột biến nhàm nghĩa [missens mutation], thì sự ức chế đối với đột biến này cỏ thể do đột biển của tARNsly với anticodon c u c sỗ gán glycine vào chỗ bị đột biển [ở đột biến nhầm nghĩa là glutamic axit].

343

Các đột biến xảy ra trên tARN có thể là đột biến ức chế đối với các đột biến lệch khung. Sự ức chế ở mức phiên mã có thể xảy ra do các đột biên trên các gen mã h ó a một sô protein của riboxom. 20.6. DI TRUYÈN HỌC VI KHUÂN Các vi khuẩn có quá trình sinh sản cận hữu tính nên vẫn thực hiện được tái to hợp di truyền. Ở vi khuẩn, thông tin di truyền được truyền một chiều từ thể cho sang thể nhận và tạo ra hợp tử từng phàn. Tái tổ hợp ở vi khuẩn có thể thực hiện bằng các đoạn ADN ưần trong biển nạp, hay phage ừong tài nạp, nhờ giao nạp khi 2 tế bào khác giới tính gắn với nhau. Bản đồ di truyền vi khuẩn được xây dựng nhở các phương phác khác nhau: giao nạp gián đoạn hoặc không gián đoạn, tái tổ hợp hay dùng mất đoạn. Plasmid là những ADN vòng ừòn có thể tồn tại độc lập hoặc chèn vào ADN tế bào chủ có vai trò quan trọng ừong chuyển gen. Transposition là sự chuyển vị gen gồm IS, Tn và phage Mu. Các phàn tử đi động có thể gây biển đổi sự biểu hiện gen. Vào những năm 1940, tái tổ hợp ở vi khuẩn E. coli được chứng minh. Từ đó đến nay, vi khuẩn E. coli ừở thành đối tượng mô hình cho di truyền học và sinh học phân tử. Những nghiên cửu ừên đối tượng này đã phát hiện các cơ chế căn bàn của sự sống ở cấp độ phân tử như sao chép ADN, sinh tổng hợp protein và điều hòa biểu hiện gen. Ngoài ra, các phát hiện về các quá trình di truyền đặc biệt ở vi khuẩn như biến nạp, tải nạp, giao nạp, transposition và plasmid có ý nghĩa quan trọng cho sự phát triển của di truyền học phân tử và góp phần xây dựng nên kĩ thuật di truyền.Trong một thời gian dài, các nghiên cứu di truyền học được tién hành ở các sinh vật nhân thực Eukaryota, còn ở vi khuẩn thì chưa vì cho ràng không cỏ sinh sản hữu tính. Khác với virut, vi khuẩn và cổ vi khuẩn [bacteria and archaea] là những tế bào sống thực hiện các chức năng căn bản của tế bào. Các sinh vật Prokaryota như vi khuẩn, vi khuẩn lam cũng có các quá trình sinh sản tương đương sinh sản hữu tính, được gọi là cận hữu tính [parazxuality]. Sự đi truyền nhờ các quá trình cận hữu tính này ở vi khuẩn có những đặc điểm: - Sự truyền thông tin một chiều từ tế bào cho [donor] sang tế bào nhận [recipient]. - Sự tạo thành hợp tử từng phần [merozygote]. Thể cho [donor] chỉ chuyển một đoạn của bộ gen sang thể nhận [recipient] nên chi lưõng bội ở một phần, các phần khác đom bội.

344

- Bộ gen thường chi là một ADN trần nên chỉ có một nhóm liên kết gen và tái tổ hợp thực chất là giữa hai phân tử ADN. 20.6.1- M ột vài đặc điểm của vi khuẩn 20.6.1.1- Kiểu hỉnh và kiểu gen của vi khuẳtt Các đột biến có thể tác động đến 5 loại kiểu hình: - Biến đổi từ nguyên dưỡng iprototrophy] sang khuyết dưỡng [auxoỉrophy] và ngược lại. Ví dụ: mất khà năng tổng hợp một chất trao đổi của chụ trình và hồi biến để lại có khả năng tổng hợp chất đó. - Sự mất hay cỏ được khả năng sử dụng chất dinh dưỡng khác. Ví dụ: đột biến làm mất khả năng sử dụng đường lactoz. - Tỉnh nhạy cám hay đề kháng thuồc như nhạy cảm streptomycin đột biến thành kháng streptomycin. - Nhạy cảm với phage thảnh kháng phage hoặc ngược lại. Ví dụ: đột biến trên thụ thể ở bề mặt tế bào làm đề kháng với sự nhiễm phage. - Sự mất đi hoặc có lại các thành phần cấu trúc của bề mặt tế bào. Ví dụ,một loại Pneumococcus có vỏ bao poỉyxacarit [polyxacarit capsule], ừong khi đó dòng khác không có vò bao. Các kí hiệu dùng biểu hiện kiểu hình và kiểu gen được thống nhất theo nguyên tắc: - Kỉ hiệu kiểu hình gồm 3 chữ thường [chữ đầu viết hoa] với dấu phía trên góc “+” hay nhằm chỉ sự hiện diện hay thiếu tình trạng tương ứng, và “s” hay “r” tương ứng chỉ tính nhạy cảm [sensitive] hay đề kháng [resistance]. - Kí hiệu kiểu gen được viết chừ nghiêng, chữ đầu khống viết hoa. Ví dụ 1: Tế bào hoang dại tự tổng họp được leuxin thì kiểu hình được viết Leu+. Đột biến khuyết dưỡng mất khả năng tổng hợp leuxin được kí hiệu kiểu hình Lêu". Tương ứng với hai kiểu hình trên kí hiệu kiểu gen là ỉeu hay ỉeu và ỉeũ. Nểu cần nhiều hem một gen để tạo ra một chất nhất định, sau 3 chữ nghiêng kí hiệu gen có thêm chữ nghiêng hoa. Ví dụ: ỉeuA, leuB... là các gen cần thiết cho tổng hợp leuxin khác nhau. Ví dụ 2: Kiểu hinh kháng hoặc nhạy cảm với penixilin được viết là Penr và Pen*. Kiểu gen tương ứng là penr và pens. Nếu lưỡng bội ở một phần thi viểt thêm gạch nghiêng. Ví dụ, \eu ỉleù.

345

20.6.1.2. Vài nét về sinh sản ở vỉ khuẩn Tế bào vi khuẩn phân chia theo lối trực phân. Phân tủ ADN gắn trực tiếp vào màng sinh chất. Sự sao chép ADN tạo ra hai bản sao gắn chung nhau trên màng sinh chất. Khi tế bào kéo dài ra, các bản sao ADN tách xa nhau do phần màng giữ chúng lớn dần ra. Kiểu sinh sàn vô tính này được gọi 1ầ”phân đổi”hay “ngắt đôi” [“binary fission”] [hình 20.11]. Tế bào vi khuẩn chia nhanh [20 phút trong điều kiện tốt] hơn rất nhiều so với tế bào Eukaryota [24-48 giờ]. DNA

Sao chép A £ N

I ị ị

Sepu

Chỗ that dể ngỊằt đôi

i M ội. bế h t ị

Nọật đôi

|LS Hình 20.11. Trực phân ngắt đôi ở vi khuẩn kèm theo tách 2 ẢDNcon về 2 tể bào. Quá trình sao chép ADN được bắt đầu từ điểm xuất phát oriC kéo dài về hai phía song song với quá trình sao chép màng sinh chất, nơi có điểmgắn vào của ADN bộgen, mọc dài tách 2 phân tử ADN về 1 tế bào con. ADN của E.coỉi cần 40 phút cho 1 vòng sao chép tương ứng với tốc độ 50.000 cặp bazơ/phút. Phụ thuôc vào tổc độ tăng trưởng, thời gian phân chia tế bào ừong khoảng từ 18 đến 60 phút. Như vậy ở các tế bào tăng trưởng nhanh, vòng saochép mới phải được bắt đầu sớm hom sự phân bào trước đó như tế bào con đầu tiên.

346

20.6.2. Vi khuẩn E.colỉ là đối tượng mô hình tốt nhất E sc h e ric h ia c o ỉi [E .c o ỉì] là vi k h u ẩ n đư ợ c n g h iên c ứ u k ĩ n h ấ t, Tất n h iề u c h ủ n g k h ác

nhau đã được phân lập. Ba dòng thường gặp ừong các phòng thí nghiệm di truyền là E.coỉi B [tế bào chủ cho các phage dãy T], E. colì c [tế bào chủ cho phage một mạch như ỘX 174] và E.coỉi K ỉ2 [tế bào chủ của phage Ằ]. Do những thuận tiện trong nuôi cấy, nhân giống, thu nhận các đột biến và dễ phân tích các sự kiện di truyền hiếm hoi. Đến nay, nó đuợc coi là đối tượng mô hình sỏ một của Sình học phân tử và công nghệ gen. 20.6.2.1. Các dữ liệu di truyền học của E. coli - Kích thước bộ gen [Genome size]: 4,6 Mb. - Nhiễm sắc thể: 1 phân tử ADN vòng ưòn. - Số lượng gen: 4.000. - Phần trăm gen tương đổng với người: 8%. - Kích thước trung bình của gen: 1 kb, không có intron. - Các transposon: tùy chủng, ~ 60 bản sao/bộ gen. Kết thúc giải ký tự chuỗi: 1997. 20.6.2.2. Các phương pháp phân tích đi truyền Ngoài các phương pháp lai để phân tích tái tổ hợp [recombination] và bổ trợ [complementation], có nhiều kỹ thuật biến đổi di truyền [Techniques of Gentic Modification]: - Gây đột biển [Mutagensìs]: •

Hóa chất và chiếu xạ: đột biến xoma ngẫu nhiên.

•

Dùng transposon: xen đoạn [Insertions] xoma ngẫu nhiên.

- Chuyển gen [Transgensis]: •

Trên vector plasmid: tự do hay chèn vào [integratd].

•

Trên vector phage: tự do hay chèn vào [integratđ].

•

Biến nạp: chèn vào.

- Làm ỉm lặng gen mục tiêu [Targeted gen knockout]: •

Alen không [Null alen] trên vector: thay gen bằng tái tổ hợp.

•

Alen được thiết kế [Engineered alen] trên vector: đột biến điểm định hướng [Site-directed mutagensis] bàng thay gen.

347

20.6.2.3. E.coli là tế bào chủ căn bản của kỹ thuật di truyền Các nghiên cứu trên E. coỉi đã làm cơ sở cho sự ra đời cùa kỹ thuật di truyền. E. coli đóng vai ừò chủ yếu trong chuyển gen đến các sinh vật khác. Nó là sinh vật chuẩn để tạo đòng gen [cloning gens] của bất kỳ sinh vật nào. E. coỉỉ được coi là tế bảo vật chủ đơn giản nhất ừong công nghệ gen. Vi khuẩn E. coỉi dễ dàng chấp nhận nhiều loại vector chuyển gen như plasmid hay phage qua biển nạp hay tải nạp. Những protein tái tổ hợp đàu tiên như insulin, xomatostatin và đến nay hàng trăm protein khác được tạo dòng ở E, coli đã đi vào sản xuất công nghiệp với thị trường hàng chục tỷ ƯSD/năm. 20.6.2.4. Các.đóng góp chủ yếu của E.coỉi - Đối tượng chủ yếu cho các nghiên cứu: •

Sao chép, phiên mã, dịch mã và tái tổ hợp.

•

Đột biến.

•

Điều hòa biểu hiện gen [Gen regulation].

•

Kỹ thuật ADN tái tổ hợp [recmbinant ADN technology].

- Đóng góp cho nghiên cứu cảc lĩnh vực khác: Trao đổi chất của tế bào [Cell metabolism], gen ức chế vô nghĩa [Nonsense suppressors], sự tuyến tính [Colinearity] giữa gen và polypeptit, các Operon, sự đề kháng thuốc dựa vào plasmid [Plasmid-bazod drug resistance] và sự vận chuyển tích cực [Active transport]. 20.6.2. S- Các enzynt và protein tham gia tỗng hợp và cắt nucleic axit Sao chép ADN được nghiên cứu rất chi tiết ở E. coli, mà phần chủ yếu đã nêu ở chương II. Ở đây, một số chi tiết được bổ sung, cụ thể là các phức hợp enzym tách mạch ADN mẹ và tổng hợp các mạch con [bảng 20,4]. Hàng loạt các enzym và protein, mà phần lớn là các phức hợp protein đa phân, tham gia tổng hợp ADN, phiên mẫ tạo ARN. Cả tế bào nhân sơ lẫn nhân chuẩn đều có hoạt tinh ADNpolymeaz đa năng. Một số ADN polymeaz hoạt động như những enzym độc lập, nhưng số khác [chủ yếu là replicaz] kết nhau thành phức hợp lớn nhiều protein. Tiểu phần [subunit] tổng hợp chi là một trong nhiều chức năng khác nhau của replicaz như tháo xoăn [unwinding], khởi sự tổng hợp mạch m ớ i,...

348

Bảng 20.4. Các enzym tham gia sao chép ADN ở vi khuẩn E. coiL E nzym

G en m ã hoá

C hứ c năng

p o ỉC ;

Enzym polyme hoá chù yếu

1. A D N polymeaz III

ADNE,Q,N,X; 2. ADN polymeaz I

Cắt mồi ARN, lắp chỗ trổng

p o ỉA - E ; m u tD . p o lA

3. Helicaz

ADNB

Tháo xoắn ở chẻ ba sao chép

4. Primaz

ADNG

Tạo mồi mạch ADN mới

5. Protein gắn điểm khởi sự [Origin-binding protein].

G ắn

ADNA

ssb

6 . P ro te in c ă n g m ạ c h S S B

[Single-strand binding protein]

7. ADN ligaz

điểm khởi sự sao chép [Ori]; tạo thuận lợi cho mở tách mạch.

Ngăn các mạch đơn đã tách không chập lạ i.

ỉig A , ỉìg B

Nối các đ ầ u hở trê n ADN

Bảng 20.5. Các enzyntADNpolymeaz ở vi khuẩn E. coli Gen mã hoá

Chức năng

]. ADN polymeaz I

poIA;AĐNE, Q,N,X

Enzym phục hồi chù yếu. cắt mồi ARN và lắp kín khoảng trống

2. ADN polymeaz II

hoỉA-E; mutD.

Enzym phục hồi phụ [minor].

3. ADN polymeaz III

poỉB

Replicaz, polyme hoá chù yếu.

4. ADN polymeaz IV

poìC

Phục hồi cấp cứu [SOS repair].

5. ADN polymeaz V

ADNB umuD ’2C

Phục hồi cẩp cứu [SOS repair].

Enzym

349

Ở E. coỉỉ đã tìm ra và biết chức năng của 5 loại ADN polymeaz [bảng 20.5]. Sự phân hủy nucleic axit cũng đòi hỏi enzym đặc hiệu: - Deoxyribonucleaz [ADNaz] là enzym cắt các liên kết trong phân tử ADN. Nó có thể cắt mạch đơn hay kép. Gyraz là một loại enzym topoixomraz cắt ADN làm tháo xoắn. - Ribonucleaz [ARNaz] là các enzym cắt ARN, có thể đặc hiệu đối với ARN mạch đơn hay mạch kép. Các nucleaz chia thành 2 nhóm: - Exonucleaz cắt tùng nucleotit một từ đầu mút của mạch polynucleotit; chúng có thể đặc hiệu đối với đầu mút 5’ hay 3’ của ADN hay ARN. Endonucleaz cắt các liên kết bên trong mạch ADN; chúng có thể đặc hiệu đối với ARN hay ADN mạch đơn hoặc mạch kép. * Cẩu trúc và chức năng các tiểu phần của ADNpoiymeaz III Tất cả các ADN polymeaz cùng có những tính chất cẩu trúc chung giống nhau. Replicaz ADN pol III là một holoenzym 900 kD [kilodalton], một phức hợp gồm hom 10 phân tử protein [hình 20.12]. Đặc biệt là protein vòng [5 [P-ring] làm móc [clamp] bao ADN ở giữa để trượt về trước mà mạch đơn này không bị bong ra khi được chép. Ngoài ra, ADN polymeaz phải có khả năng nhận biết 4 loại N như chất phản ứng phụ thuộc vào chỗ được "đọc" trên mạch khuôn. Sao chép ADN ở E. coli diễn ra với tốc độ rất nhanh, có thể đạt đến 50.000 nucleotit/phút. Thật khó hình dung một quá trình phức tạp, được thưc hiện chính xác, mà diễn ra với tốc độ nhanh như vậy, chưa kể đến việc làm sao các N tập trung với nồng độ cao đáp ứng kịp thời cho nhu cầu.

H ình 20. ỉ 2-. RepUcaz A D N p o ỉ III là m ột p h ú c hợp gồm hơn 10 protein.

20.6.3. Biến nạp [Transformation] 20.6.3.1.

Hiện tượng và điều kiện

Hiện tượng biển nạp được Griffith phát hiện ở vi khuẩn Dipỉococus pneumoniae [nay gọi là Síreptococus pneumoniae - phế cầu khuẩn gây sưng phổi ở động vật có vú] vào năm 1928. Phát hiện này và các nghiên cứu về cơ chế biến nạp có ý nghĩa lịch sử cho sự ra đời của Sinh học phân tử. Vi khuẩn này có 2 dạng khác nhau: - Dạng SiH, gây bệnh có vỏ bao tế bào [capsule] bằng polysaccharid càn trở bạch cầu phá vỡ tế bào. Dạng này tạo đốm mọc [khuẩn lạc] láng [Smooth-láng] trên môi trường agar. - Dạng Rịi, không gây bệnh, không có vỏ bao, tạo đốm mọc nhăn [Rough-nhãn]. Thí nghiệm tiến hành như mô tả trên hình 20.13.

Hình 20.13. Hiện tượng biển nạp: - Tiềm vi khuẩn s sổng gây bệnh cho chuột - chuột chểt. - Tiêm vi khuẩn R sổng không gây bệnh - chuột song.

351

- Tiêm vi khuẩn s bị đun chết cho chuột - chuột sổng. - Hỗn hợp vi khuẩn

s bị đun chết trộn với vi khuẩn R sống đem tiêm cho chuột - chuột chết.

Trong xác chuột chết có vi khuẩn S v à R Hiện tượng trên cho thấy vi khuẩn s không thể tự sống lại được sau khi bị đun chết, nhung các tế bào chết này đã truyền tính gây bệnh cho tế bào R. Nó được gọi là biển nạp [transformation]. Năm 1944, T.A very, Mc Leod và Mc Carty đã tiến hành thí nghiệm xác định rõ tác nhân gây biến nạp. Nếu các tế bào s bị xử lý bằng proteaz [enzym phân hủy protein] hoặc ARN-az [enzym phân hủy ARN] hoạt tính biến nạp vẫn còn, chứng tỏ protein và ARN không phải là tác nhân gây biến nạp. Nhưng nếu tể bào s chết bị xử lý bằng ADNaz [enzym chỉ phân hủy đặc hiệu ADN] thi hoạt tính biến nạp không còn nữa, chứng tỏ ADN ỉà nhân tố biến nạp, Kết quả thí nghiệm cỏ thể tóm tắt như sau:

ADN của s + các tế bào R sống —» chuột —» chết [có R + S] Hiện tượng biến nạp là một chứng minh sinh hóa xác nhận ràng ADN mang tín hiệu di truyền. Như vậy, biển nạp là hiện tượng truyền thông tin di truyền bằng ADN. Trong biến nạp, ADN ừần từ một tế bào vi khuẩn [thể cho] này được truyền sang tế bào vi khuẩn khác [thể nhận]. Biến nạp xảy ra khi vi khuẩn nhận ADN ngoại lai và hấp thu vào trong tế bào. Khi tế bào vi khuẩn bị vỡ do bị tan [lysis], ADN vòng tròn của chúng thoát ra môi trường thành các đoạn thẳng với chiều dài khác nhau, có khả năng gây biến nạp cho các tế bào nhận khác. Biến nạp được nghiên cứu kĩ nhất ở các vi khuẩn Sừeptococcus pneumoniae, Bacillus subtilis, Haemophilus influenzae và ở một sổ nhóm vi khuẩn khác. Hiệu quả của biến nạp phụ thuộc vào 3 yếu tố: - Tỉnh dung nạp của tể bào nhận. - Kích thước của đoạn ADN ngoại lai. - Nồng độ của ADN 20.6.3.2.

Tỉnh dung nạp của tể bào nhận

Một điều quan trọng của biến nạp là tể bào nhận phải có trạng thái sinh lí đặc biệt được gọi là khả năng dung nạp hay khả nạp [competence]. Tế bào có khả năng hấp thu ADN ngoại lai và được biên nạp [transformable] gọi là khả nạp [competent] và đây là tính trạng di truyên. Thậm chí trong các chi [genra] biến nạp, chi một số chủng [strains] hay loai la được biên nạp. Tinh khả nạp trong phần lớn các vi khuẩn biến nạp tự nhiên

[naturally transformable] được kiểm soát [regulated] và các protein đặc hiệu tham gia vào hấp thu và tác động đến ADN. Các protein đặc hiệu khả nạp đỏ gồm protein gắn ADN liên két màng [membrane-associated ADN-binding protein], autolysin vách tể bào và các nucleaz khác nhau. Ở loài Bacillus subtiỉis dễ biến nạp, các tế bào sản sinh và tiểí ra một peptit nhỏ trong quá trình tăng trưởng và sự tích lũy nồng độ cao của peptit này biến tế bào thành khả nạp. Ở Bacillus, chỉ 20% tế bào biến thành khả nạp và ở trạng thái này trong vài giờ. Trong khi đó, ở Streptomyces, 100% tế bào cỏ thể thành khả nạp, nhưng chỉ trong một thời kỳ ngắn của chu trình tế bào. Biến nạp tự nhiên hiệu quả cao được phát hiện chỉ ở một ít loài vi khuẩn như Acỉnobacter, Azotobacter, Bacillus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria và Thermus. Ngược lại, E, colỉ và nhiều loài vi khuẩn khó biến nạp ừong điều kiện tự nhiên. Tuy nhiên, có thể gây ra sự dung nạp bằng xử lý hóa chất hay tạo những điều kiện nhất định cho sự tăng tnrởng của tế bào. Khi xử lý tế bào E. coỉi với ion canxi nồng độ cao, chúng trờ thành khả nạp và biến nạp các plasmid thực hiện có hiệu quả. Những tế bào dung nạp trên bề mặt có các nhân tổ dung nạp [competence factor]. Chủng đã được tinh sạch một phần và nghiên cứu ở nhiều loại vi khuẩn. Ờ Streptococcus [trước đây gọi là Dỉplococcus] pneumoniae đã trở thành dung nạp có 30 đến 80 điểm nhận trên tế bào có khả năng gắn với ADN mạch kép hầu như của bất kì nguồn nào. Mặt khác, Haemophilus influenzae cỏ một số lượng hạn chể từ 4 đển 8 điểm nhận [receptors], mà những điểm nhận này trước tiên nhận biết ADN mạch kép có các cặp bazơ trình tự như sau: 5’AAGTGCGGTCA-3’ được gọi là “điểm hấp thụ ” [uptake site]. Sự kiện là các điểm hấp thụ này đặc biệt chung ờ ADN của Haemophilus [trên bộ gen có khoảng 600 điểm như vậy] và tương đối hiếm ở ADN cùa các loài khác đã giải thích vì sao Haemophilus chỉ biến nạp giới hạn với các vi khuẩn trong loài. Phần lớn các vi khuẩn chỉ dung nạp trong một giai đoạn giới hạn của chu trình sổng. Trong giai đoạn đung nạp, tế bào tổng hợp một hay nhiều protein được gọi là “các nhân tố dung nạp”, chúng biển đổi màng tế bào để có thể gắn với đoạn ADN ngoại lai. Như vậy, các điểm thụ thể chỉ hiện diện trong giai đoạn dung hợp. 20.6.3.3. Sự hấp thu AĐN Trong biến nạp, vi khuẩn khả nạp gắn thuận nghịch với ADN. Các tế bào khả nạp có thể gắn ADN nhiều hcm cả 1000 lần so với tế bào không khả nạp. Điều kiện quan trọng thứ hai để thực hiện được biến nạp là ADN phải cỏ mạch kép và đoạn biến nạp phải cỏ trọng lượng phân tử tối thiểu là 400.000 đalton [lớn khoảng 1/200 bộ gen của vi khuẩn], dĩ nhiên đây không phâì là giới hạn cao nhất, số lượng tế bào được biến nạp [transformants - thể biến nạp] tăng ti lệ thuận với nồng độ của ADN cho đến lúc

353

mà các điểm thụ thể [receptor sites] bão hòa do các đoạn ADN gắn vào [thường khoảng 10 đoạn/tế bào]. Ở Streptococcus pneumoniae mỗi tế bào có thể gắn khoảng 10 phân tử ADN mạch kép dài 10 - 15 kbp [kilobazơ pairs]/phân tà. ADN được hấp thụ vào tế bào và bị enzym cắt làm giảm trọng lượng phân tử còn khoảng 8 kbp/phân tử và mạch đom. Mật độ ADN tối thiểu để có thể phát hiện biến nạp là 0,01 ng/ml, một con số thấp đến nỗi không thể phát hiện bằng phương pháp hóa học. Điều thú vị là trong biến nạp ở Haemophilus influenzae, đoạn ADN phải có chuỗi ký tự 11 bp chuyên biệt để xảy ra quá trinh gắn không đảo ngược và thu nhận ADN. Chuỗi này được tìm thấy với tần suất cao bất thường ở bộ gen của Haemophilus, bộ gen đã được giải ký tự chuỗi hoàn toàn. Bằng chứng này và việc một số vi khuẩn nào đó có thể biến nạp trong môi trường tự nhiên làm cơ sở cho giả thiểt là biến nạp không chỉ xảy ra ửong phòng thí nghiệm mà còn đóng vai ữò quan trọng ừong việc truyền gen cho thế hệ sau trong tự nhiên. Bằng cách tăng cường trao đổi gen, những vi khuẩn khá biển tự nhiên tăng tính đa dạng vờ tính thích ứng. 20.6.3.4. Đoạn ngoại lai và đoạn nội tại Khi ADN mạch kép xâm nhập vào tế bào, môt mạch bị phân hủy. Bất kì đoạn ADN nào từ tế bào cho xâm nhập tế bào nhận, được gọi ỉà đoạn ngoại ỉaì [exogenote], ADN nguyên vẹn của tế bào nhận gọi là đoạn nội tại [enđogenote]. Tẻ bào vi khuẩn nhận đoạn ngoại lai sẽ lưỡng bội ở một phần bộ gen, được gọi là hợp tử từng phần [merozygote]. Tuy nhiên, đoạn ngoại lai mạch đơn không bền vững và bị phân hủy nếu không được gắn vào bộ gen thể nhận. Quá trình ưao đổi thông tin đì truyền bằng chuyển chỉ một phần vật liệu di truyền từ tế bào này sang tế bào khác được gọi là sự giao nạp từng phần [meromixis]. Có người cho rằng đoạn ngoại lai đơn mạch được gắn với protein [như protein Rec-A ở E. coỉi], protein này hỗ trợ tìm vùng bổ sung trên đoạn nội tại, làm đứt mạch và gán đoạn ngoại lai. Các enzym sẽ Qắt các đầu tự do [của cả thể cho và thể nhận] và ligaz hàn kín lõm trống. Khi đoạn ngoại lai đã gắn vào đoạn nội tại thỉ tế bào không còn là hẹrp tử từng phần nữa. Nếu đoạn ngoại lai chứa một alen với đoạn nội tại, thì mạch kép tái tổ hợp sẽ có một hay nhiều chỗ bắt cộp sai [mismatch bazơ paữs] và đoạn ADN này được gọi là heteroduplex. Nếu các tế bào con nhận alen mới, sửa sai [mismatch repair] được thực hiện băng cách cắt đoạn nội tại và dùng mạch ngoại lai làm khuôn để thay thế. Sự gắn đoạn ngoại lai vào ADN tế bào phận được thực hiện nhờ tái tổ hợp tương đồng [xem sau]. Haị hoặc nhiều hơn các gen liên kết chặt có thể nằm trong đoạn ADN biến nạp. Nếu sự xâm nhập cùa hai hay nhiều gen vào đoạn nội tại, thì tế bào nhậa sẽ được đồng biển nạp [cotransformed]. Tần số của đồng biến nạp tỉ lệ nghịch tương ứng với khnáng cách giữa các gen cùng biến nạp.

354

20.6.3.5.

Cơ chế phân tử

Diễn biến của quá trình biến nạp ở cấp độ phân tà được tóm tắt ừên sơ đồ hình 20.14. Để dễ hiểu, các giải thích dựa theo ADN của các dòng vi khuẩn s và R trong thí nghiệm của Griffith. Quá trình gồm các giai đọan chù yểu: - S ự phân hủy A D N tể bào cho: AON tế bào cho có thể là cùa tế bào tự nhiên bị phân hủy hoặc trong thí nghiệm bị gây chế bằng nhiệt độ cao hay tác nhân phá vỡ tế bào. - A D N bám vào bề mặt tế bào: Protein gắn vào ADN. - Thâm nhập của ADN: Sợi ADN mạch kép của dòng vi khuẩn s sau khi chui qua màng tế bào của dòng R thì một mạch s sẽ bị nucleaz của tế bào cắt, còn lại một mạch nguyên. - Bắt cặp [Synapsis]và tải tổ hợp: Nhờ sự hỗ trợ của protein RecA ADN của thể nhận R sẽ biến tính tách rời 2 mạch ở 1 đoạn đễ bắt cặp với đoạn ADN thể cho s vừa chui vào.

Các nucleotide FeeAprotein

Bắt cặp VÉ tái tồ hợp

Tể bào đa biển nạp

Hình 20.Ỉ4-. Sơ đồ diễn biển cùa 10000Da. Nếu nhỏ hơn thì khả năng sinh mỉễn dịch yếu hoặc không có.

433

cấu trúc phân tử phức tạp: Một số chất như polysacarit có khối lượng lởn nhưng

khả năng sinh ĐƯMD yếu vì có cấu tạo đom giản do cấu trúc lặp đi lặp lại, trong khi hapten có khối luợng phân tử nhỏ nhưng nếu gán với protein thì lại ưở thành chất sinh miễn dịch.

21.2.2. Kháng nguyên Không phải toàn bộ phân tò KN nhận diện và liên kết với phân tử KT hoặc TCR mà chỉ có một phần nhất định của KN gọi là quyết định kháng nguyên [antigenic determinant] còn gọi là epitop, mới kết hợp vởị phần tương ứng nằm trên KT, gọi là vị trí kết hợp kháng nguyên hay paratop hoặc với TCR. Sự kết hợp giữa paratop và epitop mang tính đặc hiệu cao giống như enzym với cơ chất hay khóa với chìa. * Các loại kháng nguyên a. Theo thành phần hóa học Dựa theo thành phần hớa học người ta chia ra K.N protein, polyxaccarit, ỉipit, axit nucleic. Trong đó protein luôn là KN mạnh nhất vỉ vừa có khối lượng phân từ lớn, vừa có cấu trúc phức tạp. b. Theo nguồn gốc • KN đồng loài [alloantigen] là các KN khác nhau ở các cá thể trong cùng một loài, do cỏ sự khác biệt đi truyền. Ví dụ KN nhóm máu ABO, • KN khác loài [heteroantigen] là KN chung cho mọi cá thể của nhiều loài hay nhiều chủng vi sinh vật, Ví dụ albumin của người và thỏ. • Tự kháng nguyên là KN của bản thân cơ thể kích thích để tạo tự kháng thể, gọi là hiện tượng tự miễn. c. Siêu khảng nguyên [superantigen] Các KN có khả năng đáp ửng kích thích ĐƯMD cực mạnh thì gọi là siêu KN. Siêu KN kích thích không đặc hiệu tế bào T gây tăng sinh nhờ vừa liên kết với bề mặt ngoài của phân từ MHC-II của tế bào trình diện KN vừa gắn với TCR của tế bàọ T mà không mà không cần phải nhờ tế bào trình điện kháng nguyên [APC] chế biến. Ví dụ điển hình của siêu KN là độc tố tụ cầu gây ngộ độc thực phẩm. Siêu KN gây ra triệu chứng là do kích thích tế bào T thoát ra một lượng lớn cytokin.

434

APC [fcJTB]

Tế M o t

Hình 21.6: Siêu kháng nguyên. Hầu hểt thụ thể KNphổ biển cùa tể bào T ỉà TCR. Siêu KN một mặt gắn với Vậ của TCR, một mặt gắn với MHC-II [a.i] nên có thể hoạt hóa tể bào T mà không cần phải được tế bào APC ché biến như ở cảc KN bình thường. [Theo LM.Prescott, J.P.Hơrỉey, D.A.KỈeÌn,2005]. d. KNphụ thuộc tuyển ức [gọi tắt ỉà KN phụ thuộc T - Thymus dependent antigen] Là loại KN phải có sự hỗ trợ của tế bào T mới kích thích được tế bào B biệt hóa thành tế bào plasma để sản xuất KT. Phần lớn KN đều là KN phụ thuộc T. KN không phụ thuộc T là KN không cần có sự hỗ trợ của tế bào T cũng có thể kích thích tế bào B biệt hóa thành tế bào plasma sản xuất KT, do vậy vẫn kích thích tạo KT ở cơ thể không có tuyến ửc hoặc không còn tuyến ức. Trên phân tử có nhiều quyết định KN trùng lặp, thường có bản chất là polysacarit [ví dụ polysacarit của phế cầu khuẩn typ III] là KN không phụ thuộc tuyến ức. KT sinh ra bởi KN này thuộc lớp IgM. e, Tá chẩt [adjuvant] Là các chất trơ. Ví đụ hydroxit nhôm, parafĩn...khi trộn với kháng nguyên sẽ tăng cường đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên đó. / Hapten Là phân tử có khối lượng thấp chỉ có thể trở thành chất sinh miễn dịch nếu kết hợp với chất mang phù hợp.

435

21.3. CÁC C ơ QUAN CỦA HỆ MIÊN DỊCH

21.3.Ỉ. Các cơ quan lympho trung tâm Các tế bào nguồn [còn gọi là tế bào gốc] từ tủy xương không khác nhau về hình thái, chúng vào tuần hoàn tới cư trú tại cơ quan lympho trung tâm, đó là tuyến ức và túi Fabricius [ở gia cầm] hoặc cơ quan tương đương túi [ở động vật có vú]. • Tại đây chúng biệt hóa và tăng sinh không phụ thuộc bởi KN. • Dòng tế bào nguồn nếu đi vào tuyến ức sẽ được biệt hóa thành tế bào T, còn nếu đi vào túi [Bursa] Fabricius sẽ được biệt hóa thành tể bào B [B=Bursa]. Ở người và động vật có vú không có túi Fabricius thi tủy xương và mô bạch huyết ờ thành ruột [mảng Peyer] được coi là tương đương túi Fabricius. 21.3.1.1. Tuyển ức Tuyến ức là khối dẹt gồm 2 thùy nằm sau xương ức. Tuyến ức xuất hiện sớm nhất so với các cơ quan lympho khác, đạt ữọng lượng tương đối lớn ở thòi kỳ phôi, sau khi trẻ ra đòi tiếp tục lớn và đạt trọng lượng cao nhất [30-40g] ở tuổi dậy thì, sau đó thoái hóa dần, đến khi già chỉ còn những đám lympho biểu mô. Tuyến ức được chia làm hai phần: vỏ và tủy • Vìrng vỏ: chứa phần lớn tế bào tuyến ức, mật độ dầy đặc. Vùng vỏ chứa tế bào Iympho, nhiều tế bào biểu mô và một ít đại thực bào. Các tế bào này làm lá chắn ngăn chặn sự xâm nhập của kháng nguyên. • Vùng tủy: chủ yếu chứa các nguyên bào ỉympho, rất hiếm đại thực bào và chứa cấu trúc đặc biệt gọi là thể Hassall. Thể Hassall gồm các tế bào biểu mô dẹt xếp đông tâm. 21.3.1.2. Tủi Fabricius Là cơ quan lympho trung tâm chỉ có ờ gia cầm, nằm gần hậu môn, là noi biệt hóa tế bào nguồn thành tế bào B. Động vật có vú không cỏ túi Fabricius nên sự biệt hóa tế bào B xảy ra ngay trong tủy xương.

21.3.2. Các cơ quan ỉympho ngoại vỉ Các tế bào T và B sau khi chín sẽ được vận chuyển đến các cơ quan lytnpho ngoại vi để tiếp xúc với KN thực hiện đáp ứng miễn địch, bao gồm các cơ quan có vỏ bọc [lách, hạch, lympho] và không có vỏ bọc [mảng Payer, hạch hạnh nhân ở họng, các mô lympho ở dưới da, dưới niêm mạc]. 21,3,2.1.

Lách: là cơ quan lympho ngoại vi lớn nhất, là nơi bẫy KN vào theo đường máu

và là nơi chính tạo KT. Lách được chia ra thành các vùng:

436

- Vùng tủy đỏ: có chức năng tiêu hóa hồng cầu và các tế bào hư hại mà không gây miễn dịch. - Vùng tủy trắng: có hai loại cấu trúc [1] Cấu trúc dạng ống: các tể bào lympho T dọc theo động mạch bè, gọi là khu vực phụ thuộc tuyến ức. [2] Những nang chứa các tế bào lympho B, gọi lá khu vực không phụ thuộc tuyến ức. KN bị tể bào lưới ở vùng rìa bắt giữ, chế biến, đưa đển vùng phụ thuộc tuyến ức trình cho tế bào T và hợp tác với tế bào B để tạo KT. 21.3.2.2. Hạch lympho: hình hạt đậu nằm rải rác khắp cơ thể hoạt động như hệ thống sàng lọc, thu giữ KN theo đường bạch huyểt, di chuyển chậm theo các mạch hẹp, dích dắc để tăng sự tiếp xúc với đại thực bào và các tế bào lympho. Hạch chia thành 3 vùng: - Vùng vỏ: có các nang lympho chứa chủ yểu tế bào B, một ít lympho T và các tế bào tua. - Vùng vỏ sâu: nằm ở khoang giữa, chứa lympho T và đại thực bào tạo khu vực phụ thuộc tuyển ức. - Vùng lối: vùng chứa lẫn lộn các lympho T, B, đại thực bào và tương bào [tế bào plasma]. Hạch là nơi thu gom và tập trung KN từ các vùng khác nhau theo mạch bạch huyết và là nơi sản xuất kháng thể rồi chuyển vào hệ tuần hoàn máu. 21.4. KHÁNG THÉ Kháng thể [KT-antibođy]: là các gama globulin [Ig] có trong huyết thanh của động vật có khả năng liên kết đặc hiệu với KN đã kích thích sinh ra nó. Ở đây ta chỉ xét các kháng thể miễn dịch [KTMD].

21.4.1.Cấu trúc của KTMD Tất cả các KT đều có cấu trúc giống nhau gồm 4 chuỗi polypeptit. Hai chuỗi nhẹ kí hiệu là L và hai chuỗi nặng kí hiệu là H, gắn với nhau bởi càu disulíua [S-S] [hình 21.7]. Chuỗi nhẹ: Trật tự axit amin của hai chuỗi nhẹ giống nhau và được chia làm hai vùng. Vùng có trật tự axit amin thay đổi gọi là vùng biến đổi [kí hiệu Vl], năm phía đầu axnin [-NH2] của phân tử. Vùng có trật tự không thay đổi gọi là vùng cố định [ký hiệu CL] nằm phía đầu cacboxyl [-COOH]. Trật tự axit amin vùng cố định của chuỗi nhẹ luôn giống nhau ở tất cả các lớp kháng thể, hoặc theo trật tự lamda hoặc theo trật tự kappa. Ngược lại, trật tự ở vùng biến đổi luôn khác nhau, kể cả ở các kháng thể do cùng một tế bào sinh ra.

437

VỊ trí k cì hợp khíing Iiguvóiì

Vímg bún lổ

VỊ trí kôì liợp klìáng nguvCu

V ùng

bio'll tlrff

___

Vùng

cỏ' .định VỊ trí k ít liạp killing tiguyõVi

[XX]II

Hình 21.7: cẩu tạo của kháng thể Mỗi chuỗi n ặ n g c ó 4 v ù n g a x it am in : m ộ t vùng biến đổi v à ba vùng cố định. Vùng biến đổi [kỉ hiệu là V h] nàm phía đầu amin đổi xứng vói vùng biển đổi của chuỗi nhẹ tạo thành vị trí kết hợp KN [paratop]. Vùng cố định nằm phía đầu cacboxyl, chia Chuỗi nặng:

làm 3 v ù n g n h ỏ có k í h iệ u C h I , C h2 v à C h3. G iữ a v ù n g C h I v à C h 2 là v ù n g k h ớ p nối có

tác dụng như bàn lề làríi cho phân tử có hỉnh chữ Y và cỏ thể điều chinh cho hai paratop . gắn với epitop của KN. i u iu iịỊ -

V Ị Ir í k í l hợp kháng ngiiyOn

Chuỗi nhẹ

Vfing trội tự í»ùt am in thay

Yi.Y2.Y3.74

0C] a2

10g/l [66%, 23%, 7%, 4%]

2gfl [85%, 15%]

1,2 g/1

0,03 g/1

200 ng/ml

Các chuỗi peptit khác Dưới lóp Nồng độ trong huyết thanh

Hoạt tính sình học Cố định bổ thể Con đường cổ điển Con đường nhánh Gắn với ĐTB Gắn với tế bào mast Gắn với lympho hạt lém Gắn với bạch cầu axit

ri.Y2.Y3 +

n.73

n.Y3

ri.r3.Y4

- "

Yl.Y2.r3.Y4

Qua niêm mạc

Qua nhau thai

Yi.Y2.73.Y4

Khuếch tán ngoài mạch

439

IgG chiếm 80% tổng Ig trong huyết thanh người bình thường, cấu tạo gồm chuồi nhẹ Kappa hoặc lamda và hai chuỗi nặng gama. Ở người Việt nồng độ IgG trong máu là 1400 mg/100ml. IgG là kháng thể duy nhất được truyền tò mẹ sang thai nhi qua nhau thai. IgG giữ vai trò chính bảo vệ cơ thể chống tác nhân gây bệnh, đảm nhiệm các chức năng opsonin hóa [giúp đại thực bào bẳt giữ K.N], hoạt hỏa bổ thể, gây độc qua trung gian tế bào phụ thuộc KT [giúp tế bảo K diệt tế bào đích], trung hòa ngoại độc tố [độc tố uốn ván, độc tố do Clostridium botulinum gây ngộ độc thúc ăn, nọc rắn, nọc côn trùng...], gây ngưng kết vi khuẩn và trung hòa virut.

C huỗi J

Hình 2ỉ. 9: cẩu trúc IgM, kháng thể có kích thước ỉớrt gồm năm phân từkểt hợp với nhau [pentame] thành hình sao, tạo ra 10 vị trí kết hợp kháng nguyên. - IgM chiếm 5-10% trong huyết thanh ở người bình thường. IgM có cấu tạo gồm hai chuỗi nhẹ kappa hoặc lamda và hai chuỗi muy. Năm globulin chụm lại với nhau thành phân tử lớn hình sao năm cánh nhờ cầu nối disulfua và chuỗi protein J, do vậy cỏ tới 10 paratop. IgM xuất hiện sớm, thực hiện các chức năng như hoạt hỏa bổ thể, ngưng kết hồng cầu cùng loài trong trường hợp nhóm máu ABO, ngưng kết vi khuẩn. - IgA có cấu tạo gồm 2 chuỗi nhẹ kappa hoặc lamda với hai chuỗi nặng alpha. Có hai loại: IgA trong huyểt thanh chủ yểu ở dạng mônome và IgA tiết [slgA] luôn có dạng dime, có ừong dịch tiểt của cơ thể như sữa, nước bọt, nước mát, trong dịch nhầy đường tiêu hóa, sinh đục, hô hấp. IgA monome làm nhiệm vụ hoạt hóa bổ thể theo con đường nhánh. IgA tiết chống vi khuẩn ừên bề mặt niêm mạc gây nhiễm trùng đường hố hấp, tiêu hóa đồng thời chống KN nhóm máu ABO.

440

Hình 21.10: cấu trúc ỉgA íiểt. Mặc dù phần lớn IgA là monome nhưng IgA tiết là dime. - IgD có nồng độ trong máu rất thấp và cấu tạo gồm hai chuỗi nhẹ kappa hoặc lamda và hai chuỗi nặng deỉta. Hoạt tính sinh học của IgD còn chưa rõ nhưng nó có mặt trên tế bào B làm thụ thể cho KN. - IgE có nồng độ trong huyết thanh rất thấp và có cấu tạo gồm hai chuỗi nhẹ kappa hoặc lamda và hai chuỗi nặng epsilon. IgE tham gia vào quá mẫn tức thì [hay dị ứng] bằng cách gán phần Fc với tế bào mast [đuỡng bào] và phần Fab với kháng nguyên. Tế bào mast được hoạt hóa sẽ giải phóng các chất hoạt mạch như histamỉn, leukotrien, serotonin gây giãn mạch và tăng tính thẩm thành mạch.

21.4.3. Cơ chế hình thành kháng thể miễn dịch Việc hình thành KT là một quá trinh rất phức tạp đòi hỏi có sự tham gia của nhiều tế bào: tế bào T, tế bào B và tế bào trình điện KN [APC] và phải có mối tương tác giữa các phân tử bề mặt [TCR, MHC, kháng thể bề mặt tế bào B]. Khi KN vào cơ thể sẽ theo dòng máu và hệ bạch huyết vào hạch lympho, iách và gan. KT sẽ được tạo thành ở lách và hạch lympho. Trước hết KN phải được APC trình diện. APC là đại thực bảo hoặc cũng có thể là tế bào B. - APC là tể bào B thông qua thụ thể là KT bề mặt sẽ nhận diện KN. KN vào tế bào rồi tiêu hóa trong endoxom. Các peptit được tạo thành sẽ kết hợp với phân tử MHC-II đi ra bề mặt tế bào để tương tác với TCR. - APC là đại thực bào cũng hoạt động như vậy nhưng không có thụ thể dành cho KN. Đại thực bào thâu tóm KN, tiêu hóa và giải phỏng peptit. Peptit cũng gán với MHC-II để đưa ra bề mặt trình diện tế bào T h như trường hợp với APC là tế bào B. Phức hợp MHC-II-KN sẽ được trình diện cho tế bào Th thông qua TCR. Phân tử MHC cũng tương tác với thụ thể CD4 trên mặt tế bào Th. Được kích thích bởi KN, tế bào

441

T h hoạt hóa và tâng sinh, sản ra interleukin để kích thích tế bào B tăng sinh và biệt hóa thành tế bào plasma sản xuất kháng thể và dòng tế bào B nhớ. Tế bào plasma chi sổng được khoảng một tuần nhưng lại sản một lượng lớn KT. Tế bào B nhớ có đời sống dài và tồn tại cả khi KN đã mất. Khi được khích thích bởi KN vào lần hai, chúng sẽ biến thành tế bào plasma để sản xuất KT nhiều nhanh chóng hơn. Đó chính là đáp ứng miễn dịch lần hai và là cơ sở của việc tiêm vacxin. Một số KN có thể kích thích tạo thành KT ở mức độ thấp mà không càn có sự tham gia của tế bào T, được gọi là KN không phụ thuộc tuyến ửc. Các KN này thường có cấu tạo đơn giản, lặp đi lặp lại như polyxaccarit. KT được tạo thành thường thuộc lớp IgM, có ái lực thấp. Tế bào B đáp ửng KN này không có trí nhớ miễn dịch. 21.4.4. T huyết chọn lọc dòng của Burnette Theo Burnette thì thông tin để hình thành KT đã phải có sẵn trong tế bào B từ trước khi có KN xâm nhập. Bằng con đường đột biến, hàng loạt loại tế bào B được tạo thành. Mỗi loại có khả năng đáp ứng với một loại KN. Trong thời kỳ bào thai, loại tế bào nào chống lại KN bản thân sẽ bị ức chế. Khi ra đời, cơ thể chỉ còn giữ lại các tế bào phản ứng lại KN lạ. Khi có KN xâm nhập, chúng sẽ chọn lọc tế bào nào phù hợp [có thụ thể phù hợp với quyết định KN] để kích thích, phân chia theo con đường gián phân tạo thành dòng. Các tế bào không phù hợp với KN thì không được kích thích để tạo đòng. Thuyết chọn lọc dòng được công nhận vì nỏ giải thích được nhiều hiện tượng miễn dịch như dung nạp miễn dịch [không tạo KT chống KN bản thân] và trí nhớ miễn dịch.

21.4.5. Cơ chế đi truyền của sự tạo thành kháng thể Một vấn đề đặt ra là làm thế nào có thể có khả năng tạo ra một lượng lớn và đa dạng các loại KT đến như vậy để đáp ứng lại các loại KN muôn hình muôn vẻ. Nếu theo quan niệm trước đây, một gen mã hóa cho một protein [hoặc một chuỗi polypeptit] thì có thể phải cần đến hàng tỷ gen mới có thể sản xuất được một lượng khổng lồ các loại KT. Điều đó vượt quá tiềm năng gen cùa cơ thể. Ngày nay vấn đề này đã được giải thích nhờ phát hiện ra sự tái sắp xếp lại các trình tự ADN và ARN xảy ra trong quá trình biệt hỏa tế bào B. Sự sấp xếp này đóng góp rất lớn vào việc tạo ra sự đa dạng của KT trong cơ thể. Muổn hiểu rõ cơ chế di truyền của sự tổng hợp kháng thể, chúng ta cần nghiên cứu chi tiết hơn cấu trúc kháng thể và sự sắp xếp lại gen. Cấu trúc kháng thể: các khảng thể khác nhau có ữật tự sắp xếp các axit amin khác nhau ờ vùng biến đổi. Trong vùng biến đổi lại có những vùng nhỏ có trật tự axit amin thay đổi rất mạnh, gọi là vùng siêu biến [HVR - Hypervariable region] chính là vị trí kết hợp với kháng nguyên.

442

Vùng biến đổi manh

Vùng biến đói chuỗi nặng

CÌIH

Vùng biến đổi của chuỗi nhc

Ch2

Vùng Vùng bi ổn ^ đổi mạnh

Hình 21.11: Biểu hiện cách sắp xếp ỉại trình iựADN mã hóa cho protein chuỗi nhẹ, K,. Vùng biển đổi của chuỗi nhẹ cũng như chuỗi nặng có 3 vùng siêu biến, được mã hóa bởi các gen vùng biến đổi [gen V] nằm ừên ADN của tế bào B ừong quá trinh chín ở tủy xương. Tại vùng siêu biến thứ 3 của chuỗi nặng còn cỏ một vùng được mã hóa bởi gen riêng gọi ]à gen D [từ chữ diversity - đa dạng] và một vùng nổi giữa vùng đa dạng [D] với vùng cố định [ C h ] gọi là vùng nói [J] được mã hóa bời gen J, ở chuỗi nhẹ không có vùng D. Vùng J nổi giữa vùng V với vùng Cl, cuối cùng là vùng cố định được mã hóa bởi các gen CL. Mỗi vùng biến đổi được mã hóa bởi hai đoạn gen [tức exon]: một đoạn gen biến đổi [V] ừong đỏ có vùng siêu biển và một đoạn gen nối gọi là J [joining]. Sợi ADN ban đầu dòng phôi nằm ưên nhiễm sắc thể thứ 2 chứa khoảng 40 exon V k và 5 exon J k- Trong quá trình phát triền của tể bào B ở tủy xương, nhờ sự chọn lọc ngẫu nhiên để biểu hiện một đoạn exon Jic và một đoạn exon Vfc trong mỗi tiền tể bào B, bằng cách tái sáp xếp lại ADN để có thể liên kết bất kỳ một exon Jk vói bất kỳ một exon Vk nào [tức V kI và J k2 ở hình 12]. Vùng nối giữa hai exon V-J đã được tổ hợp sẽ mã hóa cho vùng HVR3 của vùng biến đổi. Ở vùng cố định của chuỗi nhẹ K, chi cỏ một exon [Ck] nằm ờ gần vùng J. Khi phiên mã, toàn bộ locut gen tạo thành ARN tiền chất sau đó được cát nối thành mARN gồm V-Jc hoàn chỉnh để mã hóa cho chuỗi nhẹ của kháng thể. Locut gen mã hóa cho chuỗi nhẹ X nằm trên NST sổ 22 và quá trình tái sắp xếp và biểu hiện của nỏ cũng giống như đối với chuỗi nhẹ K- c ỏ khoảng 30 exon Vx, 4 exon Jx và 1 exon Cx.

443

VK1

12 Vk2

V k3

ADN dòng phôi

V Kn

1 2

Ị,

I Sắp xếp lại

ADN của tế bào B

V K1

2 3 k

ÌK

Phiên TTiã và cắt nối ARN ị mARN

1.1vkiik2 ck Ặ Dịch mă

protein chuỗi nhẹ v«iìk2 C*

Hình 21.12: Tổ chức và sắp xếp ìạì các gen mã hỏa cho chuỗi nhẹ %. Kỉ hiệu Ck = vùng cổ định cùa chuỗi KỊ, L đoạn dẫn đầu, J - vừng nối, Vty, v%2 --- Vfì~ các vừng J 4 Ằỉ /Trì. _ _ n I__ rỵ> T-_ biển đổi [Theo R. Gordon, T. Ian, 2000].

444

Trong các tế bào B chưa chín [tức các tế bào chưa được hoạt hóa bởi các KN], các sợi ARN tiền chất được cắt nối, sao cho đoạn gen vùng biến đổi được nối với đoạn gen vùng cố định CMví dụ Cy, c a, Cu, Cg hoặc c e để tạo ra các phân tử tưcmg ứng IgG, IgA, IgM, IgD hoặc IgE. * Nguồn gốc của sự đa dọng Các yếu tố đóng vai trò quan trọng để hình thành tính đa dạng của KT ở động vật có vú được liệt kê ở bàng sau: Sự đa dạng của các vùng mã hóa cho kháng thể Các gen dòng phôi

Các exon V, D và J

Sự tái sắp xếp các exon

Sự chọn lọc nẹẫu nhiên các exon V, D và J, tái sẳp xếp để biểu hiện.

Đa dạng cùa sự kết nối

Sự gắn các nucleotit sai hoặc cài xen các nucleotit vào điểm nối V-D-J.

Tái tổ hợp chuồi H và L

Sự lựa chọn độc iập các gen vùng biến đổi của chuỗi nhẹ và chuỗi nặng trong mồi tế bào B.

Đột biển xoma

Đột biến điểm trong các gen vùng biến đổi của tế bào B hoạt hóa.

Sự đa dạng được mâ hỏa trong genome lưỡng bội vả được hình thành nhờ sự chọn lọc ngẫu nhiên của các exon V, D và J trong mỗi tiền tế bào B. Hơn nữa sự đa dạng trong HRV3 được tạo thành trong quá trình liên kết các đoạn V và J hoặc V, D và J do sự tạo thành một cách ngẫu nhiên các biến dị trong trình tự nucleotit của tổ họp gen mới. Những biến dị này được tạo thành do được chèn thêm hoặc mất đi các nucleotit, dẫn đến mã hóa cho axit amin khác, tạo ra đột biến điểm, có thể làm thay đổi cấu hình của KT. Một điều cần chú ý là sự chọn lọc và tái sắp xếp của các exon chuỗi nặng V, D và J và các exon chuỗi nhẹ V và J, xảy ra hoàn toàn độc lập với nhau. Điều này dẫn đến sự đa dạng rất lớn về các vị trí liên kết KN [paratop], đưa đến sự đa dạng về tỉnh đặc hiệu của KT với KN. Ví dụ 2 tế bào B biểu hiện các vùng VH giống hệt nhau có thể nhận các vùng VL hoàn toàn khác nhau và do đó chúng đặc hiệu với các KN khác nhau. Mức độ cuối cùng của sự đa dạng xẩy ra trong các té bào B hoạt hóa và tăng sinh trong đáp ứng miễn dịch. Điều này bao gồm đột biến điểm [thay thế các nucỉeotit ừong quá trình sao chép AĐN] đặc biệt là ừong các trình tự mã hóa cho HVR có thể dẫn đến sự thay đôi các gốc axit amin gán với KN. Trong một sổ trường hợp đột bien xoma này tạo ra các tế bào B với thụ thể có ái lực cao với KN, sau đó các tế bào B này mới được chọn lọc trong trung tâm mầm để hoàn thiện thành tế bào plazma hoặc tế bào B nhớ.

445

* Sự loại trừ alen và chọn lọc dòng Sự tái sắp xếp các gen của KT trong qúa trình biệt hóa tế bào B không phải luôn thành công. Ví dụ có sự sắp lại các gen tạo thành tổ. hợp không mã hóa cho chuỗi nặng và chuỗi nhẹ hữu hiệu. Tuy nhiên mỗi tiền tế bào B có một số cơ hội tạo thành các tổ hợp có ý nghĩa do chúng có 2 alen trong mỗi gen của genome lưỡng bội, cùng vói khả năng sừ dụng 2 loại chuỗi nhẹ [kappa và lamda]. Thứ tự tái sắp xếp bắt đàu với mỗi alen của chuỗi nặng và tiểp sau đó là các alen của chuỗi nhẹ kappa vả cuối cùng, nểu cần thiết là các alen của chuỗi nhẹ L Một sự tái sắp xếp đúng sẽ ngăn chặn sự tái sắp xếp khác cùng loại. Ví dụ nếu một alen của chuỗi nặng được sắp xếp thành công thì alen của chuồi nặng khác sẽ không bao giờ được sử dụng ừong tế bào B đó và một alen chuỗi lamda sẽ chỉ được sử dụng nếu cả hai đều tiến hành tái sắp sếp lại các alen chuỗi K nhưng không tạo ra tái tồ hợp hữu hiệu. Sự loại trừ alen này đảm bảo ràng tất cả các KT bề mặt [trên tể bào B] hoặc KT tiết [IgA] được sinh ra từ tể bào B đều có vùng V h và V l giống nhau và đo đó đều đặc hiệu với cùng một KN. Điều này giải thích cơ sở di truyền của các ĐƯMD đặc hiệu với KN được tăng lên bởi sự chọn lọc dòng, được mô tả ở phần 5.4. Điều đó có nghĩa là khi các tế bào lympho B có thụ thể [BCR] phù hợp nhất với epitop của KN sẽ được kích thích để hoạt hóa và phân chia tạo nhiều tể bào cùng loại, gọi là một dòng. Trong một số trường hợp có nhiều tế bào cùng được kích thích để phân chia dẫn đến đáp ứng đa dòng chứa các phân tử KT có ái lực khác nhau đối với epitop. Các KT được tạo thành trong ĐƯMD thứ cấp [lần 2] thường có ái lực cao và được ưu tiên nhân rộng tạo thành một đòng phù hợp nhất với một KN. Các đáp ứng đơn dòng [monoclonal] và ít dòng [oligoclonal] thường được coi là trường hợp đặc biệt, ví dụ ở bệnh u tủy [myelomatosis] trong quá trinh phục hồi sau ghép tủy xương hay khi lai tế bào plasma sinh KT với tế bào u tủy để tạo dòng tế bào lai đơn dòng [monoclonal hybridoma]. * Kháng thể đơn dòng Trong tự nhiên, KN có nhiều epitop do đó khi đưa vào cơ thể sẽ kích thích cơ thể tạo ra nhiều KT. Muốn nhân một loại KT thì phải tiến hành tách chiết, vừa khó khăn vừa tốn kém. Năm 1975 lần đầu tiên Kôhler và Milstein mô tả phương pháp tạo KT đơn dòng bằng cách lai tế bào plasma với tế bào u tủy. Tê bào plasma có khả năng tạo KT nhưng không nhân lên được toong môi trường nhân tạo, vì chúng là tế bào đã biệt hóa tận cùng. Ngược lại tế bào u tủy cỏ thể phân chia rất nhanh, nhưng không cỏ khả năng tạo KT. Tế bào lai sẽ được ưu điểm của hai loại tế bào trên: vừa có khả năng tạo ra KT, vừa phân chia rất nhanh ữên môi trường nhân tạo.Nhưng tế bào lai này giống như các tế bào plasma đặc hiệu KN ban đầu, sẽ là đa dòng. Nhưng nếu pha thật loãng, rồi rỏ vào các giếng của bản nhựa, sao cho mỗi giếng chỉ có một tế bào riêng lẻ, rồi cho phân chia thì sẽ được một dòng tế bào có khả năng tạo ra một loại KT đặc hiệu với một loại epitop KN mong muốn. Do vậy người ta

446

định nghĩa KT đơn đòng là KT đo một đòng tế bào B sinh ra để đáp ứng đặc hiệu với một epitop KN. Ngày nay, KT đcm dòng được sử đụng rộng rãi bao gồm việc định loại vi sinh vật và xác định các tế bào biểu hiện các dấu ấn [marker] bề mặt khác nhau sử dụng trong y học thực hành, ví dụ theo dõi, quản lý các KT kháng CD3 đối với bệnh nhân ghép thận để ức chế tế bào T gây thải ghép, sử đụng để xác định doping trong thể thao, xác định liều lượng thuốc trong ngành dược. 21.5. CÁC TÉ BÀO THAM GIA VÀO ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH

# o k UỈ1 mill llffriiii lyiH’ftof t

Nmíii tòt' [jiitl cíu

iSMjiSTwiiMn

< t

' F

# A ID ija p F

fiiue&u

I♦

J V é

Hbugda

*•

/ ÌÍM tể kteh iik & N ,

l y

•

iympbo T I

1 bite lynipha B hff t tròf ttiyến lie tióá tró|iềy

T—

^ r ế h io p ỉa íin a

tfritimebaa

lể bảo lyrnptin r

!Tí&ỉạui*

Thifchio

H2O 2 + *02 [singlet oxy]

[3] H2 O2 + Ơ2 * ---► OH + OH' + ‘0 2 [oxy đom gốc hydroxyl]

[4] H20 2+ c r [hoặc ĩ'] mydQperoxitaz

o c r [hoặc OI*] + H2O [ o c r = hapohalite]

[5] o c r +H2 O2 --►'0 2 + C1‘ + H2O Oxit nitơ là hợp chất gây độc tể bào khác được tạo thành từ cơ chất là L-acginin và O2 với sự xúc tác bởi syntetaz cửa oxit nitơ. 2 acginin + 2 O 2 + 3NADPH + 3H+

+ 2NO + 2HC1 + 3NADP*

Cơ chế không phụ thuộc oxy bao gồm:

449

■

Ị^ IỆ Ig g g i§ p

M W ® £ i

v i sinh vật

M g á ii v à o hụ [ h í không d ặc b íộu

: :+ :

K h ả n g ih c

5 /

}

HÉh**Z [s 8\ M

Jầ ':Ê Ê sÊ ằ* *

ip]

■ t'

;NO 2 , v .v ...

Các nguyên tổ tuần hoàn sình địa hóa học

Trong số hơn 90 nguyên tổ hóa học tồn tại trong thiên nhiên, có 26 nguyên tố cần cho sự sống, cho nên chúng được gọi là các nguyên tố m ang tính sinh vật

[ b ả n g 2 3 .1 ] .

Theo nhu cầu của sinh vật, chúng được chia theo 3 nhóm: a- N guyên tố năng lượng [energy elements]: hay nguyên tố cơ bản, gồm c , H, o , N, là thành phần cơ bản cấu tạo nên axit amin và protein m à sinh vật không thể thiếu được, chúng có thể chiếm trẽn 90% trọng lượng khô của tế bào.

Bảng 23.1: H à m lư ợ ng tru n g bình của các nguyên tố tro n g cơ th ể sinh vật và tro n g vỏ T rá i đất

Hàm lưọng tưong đối % Cơ thể sinh vật

Vỏ trái đất

Nguyên tố vì lượng

46,6

Nguyên tố đa lượng

Cơ thể sinh vậí

vỏ trải đất

vết

0,095

0,02

vết

5,63

0,02

vết

1,5

0,105

vết

0,205

vết

vểt

1,5

2,09

Al*

vết

8,23

0,5

0,013

vết

0,0135

0,2

2,36

Mn*

vết

0,1

4,15

vết

0,1

2,33

Si*

vểt

28,2

*: Chỉ tồn tại trong cơ thể một ỉt sinh vật

544

Hàm lượng ttrừng đối %

b- N guyên tố đinh dưỡng đa lượng [macronutriens]: gồm Ca, M g, p, K, s, Na v.v. ..Đ ó là những nguyên tổ mà sinh vật cần đến với số lượng khá lớn, nhưng ít hơn rât nhiều so vói nguyên tố năng lượng. c- N guyên tố dinh dưỡng vi lượng [mìcronutriens]: gồm Cu, Zn, M n, M o, Co, Fe v .v ... Đó là những nguyên tố không thể thiếu được đổi với sự sống, nhưng vói nhu cầu rất í t Cũng có thể chỉ chia thành hai nhóm nguyên tổ đa lượng và nguyên tố vi lượng [bảng 23.1] Các nguyên tố đó chuyển hóa và di chuyển giữa các tầng nấc khác nhau của sinh quyển, thủy quyển, khí quyển, nhưng quá trinh chủ yếu vẫn là oxy hóa, khử, khí hóa, hóa rắn, hóa lỏng v .v .. . { b ả n g

2 3 .2 ] .

Bảng 23.2: Các quá trìn h cơ bản trong tuần hoàn sinh địa hóa học các nguyên tổ Quá trình

Nội dung

Oxyhôa

Phản ứng mất electron cùa nguyên tử một chất

Khừ

Phản ứng nhận elecừon cùa nguyên tử một chất

Khỉ hỏa

Phản ứng biến thành thể khí cùa một nguyên tố

Cổ định

Phản ứng cùa một nguyên tố từ thể khí biển thảnh không phải thể khí

Hòa tan

Phản ứng của một nguyên tố trong chất khó tan biến thành chất dễ tan trong nước

Kết tủa

Phản ứng của một nguyên tố trong chất dễ tan biến thành chất khó tan trong nước

ức chế hoạt động Khoáng hỏa

Quá trình một nguyên tố ữở thành một bộ phận của cơ thể sinh vật Quá trình một nguyên tổ trong cơ thể sinh vật trở thành chất vô cơ ngoài cơ thể

Các nhân tố chủ yếu ảnh hưởng đến tuần hoàn sinh địa hóa học của các nguyên tố bao gồm: - Tính chất hóa học của nguyên tố và phương thức được cơ thể sinh vật sử đụng. - Tốc độ sinh trưởng của sinh vật ảnh hưởng đến tốc độ di chuyển của nguyên tố trong phức hệ sinh thái sinh vật - phi sinh vật. - Tốc độ phân giải cùa cơ thể.

545

23.4.1.4, N hững đặc trưng cơ bản của tuần hoàn sinh địa hóa học Tuần hoàn sinh địa hóa học thường m iêu tả bằng các khái niệm [compartement],

n h ịp ỉư u th ô n g

kho

[pool], p h â n

kho

[flux rat]. Đ ỏ cũng là những đặc trưng cơ bân của tuần

hoàn sinh địa hóa học.

Bảng 23.3: Đ ặc trư n g tuần hoàn sinh địa hóa học của các quyển [Theo Chameides

1 Quyển

Tổng lượng [tấn]

Khỉ quyến

Tấng khí quyển 5 X 109 Tầng đối lưu 4,5 X 109

Thủy quyển

+Bề mặt biển 1,1 X 10" +Biển sâu 1.3 X 1012 +Tổng lượng

1.4 X 10"

Nham quyển

+VỎ đất lục địa

2 X 1013 +Thổ nhưỡng 2 X Ỉ08

và

Perdue ,

1997]

Nhịp luru thông [tấn/năm]

Thời gian hỗn hợp Trong bán cầu- khoảng 0,1 Giữa bán cầu- khoảng 2

+Lưu lượng sông 4,0 x io 7 +Lượng mưa

+Vệt trầm tích

+Bề mặt biển khoảng 100

3,9 X 108

+Biển sâu khoảng 1000

4.3 X 108 +Trao đồi theo chiều thẳng đứng 7.3 X 10®

+Thổ nhưỡng khoảng 104

+Tốc độ phong hóa lục địa 2 X 104 +Tốc độ trầm tích 2 X 104

+VỎ lục địa khoảng 109

+Bốc hơi

+V 6 đất hải dựơng

7 X 10

Thời gian tuần hoàn [năm]

Sức sản xuất bậc nhất

[TgC/s]

+Trầm tích biển khoảng 108

Cơ thể sổng: Sinh quyển đất liền: khoảng 10 Xác chết: Sính quyển đất liền: khoảng 30 Tấn c/năm

2 X 1012 Sinh quyển

C ơ th ể số n g :

+Sinh quyển đất liền: 8,3 X 105 tấn c +Sinh quyển biển: 1,8 X 1 0 3tấn c X á c c h ể t:

+Lục địa: 1,5 X 10é tấn c +Biển 3 x l 0 6tấ nC

546

+Sinh quyển đẩt liền: GPP 9 , 6 X 104 N PP4.8 X 104 +Sinh quyển biển: Tầng mặt GPP: 4 X 104 Tầng mặt NPP: 0,4 x i o 4

+Sinh quyển biển: khoảng 75 Tý lệ C:H:0:N:P +Sinh quyển biển 830:1230:604:9:1 +Sinh quyển biển 106:179:68:16:1

Kho còn gọi là kho dự trữ, chi số lượng vật chất được hạn định bởi các đặc trưng lý, hỏa, sinh. Trong kho, số lượng những vật chất đó luôn luôn vượt hơn rất nhiều số ỉượng kết

hợp bình thường trong các hệ thống sống và thường chỉ được phóng thích dần dần từ trong kho. Ví dụ toàn bộ

trong biển gọi là kho cacbon biển, c o

trong khí quyển gọi là kho

C O 2.

Phân kho chủ yếu dùng trong phân tích mội trường, chúng gồm những “kho” với quy mô nhỏ hơn. Tốc độ di chuyển vật chất từ phân kho [hoặc kho] này đến phân kho

[hoặc kho] khác có thể diễn đạt bằng nhịp ỉưu thông [flow rat]. Đó là lượng vật chất đi chuyển từ phân kho [hoặc kho] này đến phân kho [hoặc kho] khác ừ ong m ột đơn vị thòi gian nhất định. N gười ta còn sử dụng khái niệm nhịp chu chuyển

chu

chuyển [tum ove rat] và thời gian

[tum ove time]:

Nhịp chu chuyển = Nhịp lưu thông/lượng chất hóa học trong kho đó. Thời gian chu chuyển = tổng số chất đinh dưỡng trong kho/ nhịp lưu thông. N hững vật chất khác nhau ừong các kho khác nhau sẽ có nhịp chu chuyển khác nhau, chẳng hạn thời gian chu chuyển của nước ừong khí quyển chỉ có 10,5 ngày, cũng có nghĩa là nước trong khí quyển m ỗi năm phải đổi mới 34 lần. N guyên tố Si ử o n g biển có thời gian chu chuyển là 8000 năm, thời gian chu chuyển của N a kéo dài tới 206 triệu năm . Các quyển khác nhau cũng khác về thời gian tuần hoàn hóa địa cầu sinh vật, về thông lượng.

H ình 23.25: Thành p h ầ n k h í quyển.

547

Từ nử a sau của thế kỷ 20, do sử dụng rộng rãi các loại phân hóa học, thuốc trừ sâu, thuốc kích thích, thêm vào đó tầng ozon bị phá hủy, rừng bị hủy họai, hiện tượng “tam hóa” [sa m ạc hóa, m ặn hóa, hoang m ạc hóa] đất đai, dẫn đến hệ thống sinh thái toàn cầu không ngừng xấu đi và dẫn đến tuần hòa bất lợi của m ột số nguyên tố hóa học..

23.4.2. Tuần hoàn sinh địa hóa học cửa những nguyên tổ CO' băn

c, H, o, N

là những nguyên tố cơ bản tạo ra vật chất sống, trong tuần hoàn sinh địa

hóa học chúng đều có xuất hiện pha khí, cho nên tuần hoàn rất nhanh và đều thuộc dạng tuần hoàn thể khí. 23.4.2.1. Vòng tuần hoàn cacbon

Cacbon là nguyên tố phi kim loại, chất lượng nguyên từ tương đối là 12,011. Nguyên tử

cỏ thể cùng với các nguyên tử

c khác hoặc

các nguyên tử H ,

o, N ,

p hình thành nên

các càu nối cacbon hoặc càu nối cộng hóa trị [covalent bond] bền vững, tạo thành bộ khung cho các phân tử hữu cơ phức tạp [protein, photpho lipit, hydrat cacbon, axit nucleic].

Hình 2ỉ .26: Vồng turn hoàn cacbotĩ [theo J.G.Black].

548

Carbonattrong các trầm tích

Carbon hữu cơ bị phân giải bỏi vi sinh vật

hữu cơ làm thức Sn chữ động vật

Hình 23.27: Vòng tuần hoàn c trong tự nhiên [ th e o M . K . C o w a n , K .P . T a la r o ].

Cacbon có thể tồn tại dưới các dạng khử, ví dụ như metan [CH 4 ] và các chất hữu cơ, cũng có thể tồn tại dưới dạng oxy hóa - ví dụ như c o và CO 2 . Chất khử [như hydro - m ột loại chất khử mạnh] vả chất oxy hóa [như O 2] có thể ảnh hưởng đến các phản ứng sinh học và hóa học liên quan đến cacbon. Trong quá trình phân giải chất hữu cơ có thể sản sinh hydro, nhất là khi lên m en trong điều kiện kỵ khí. N ếu hydro và m etan sinh ra, chúng có thể chuyển từ khu vực kỵ khí sang khu vực hiếu khí. Đây là cơ hội để oxy hỏạ hydro và metan. M etan trong khí quyển có tốc độ tăng lên khoảng 1% mỗi năm, từ m ức 0,7 ppm đã tăng lên đến l,6 -l,7 p p m [theo thể tích] trong vòng 300 năm qua. N guồn m etan này có nguồn gốc đa dạng.

549

K v k lú

f f le a k h i

Co đậih cacbon

CỐSnhcacbon

Hình 23.28: Vòng tuần hoàn cacbort cơ sở trong môi trường [theo L.M.Prescott và cộng sự]. Nêu m ột cột nước chứa oxy nằm trên m ột vùng kỵ khí chứa vi khuẩn m etan thì metan sẽ bị oxy hóa trư ớc khi xâm nhập vào không khí. Trong nhiều trường hợp, như trong ruộng lúa không bị che phủ bời lớp nước chứa oxy thì m etan có thể trực tiếp thoát vào không khí, làm cho lượng chứa m etan trong không khí toàn cầu tăng lên. R uộng ỉúa, động vật nhai lại, m ỏ than, nhà m áy xử lý ô nhiễm , bãi rác và ao hồ đều là những nguồn quan trọng làm tăng m etan toong không khí. Các vi sinh vật kỵ khí ừ o n g ruột m ối [như M e ta n o b r e v ỉb a c te r ]

550

cững có thể làm sản sinh metan.

B ảng 23.4:

Đ ặ c tr ư n g c ủ a c á c c ơ c h ấ t h ữ u c ơ p h ứ c tạ p ả n h h ư ở n g đ ế n s ự p h â n g iả i [d e c o m p o s itio n ] v à h a o tổ n [d e g r a d a tio n ]

Hao tổn

Nguyên tể tản tại vói lượng lớn Cơ chất

Gốc ctf bản

Tinh bột

Glucoz

Liên kết [chỉnh]

P [ l- 4 ]

+ + +

p [1 ^ 3 ]v à p

+ +

-t-

a [ l —»6] Xenluloz Hemixenluloz

Glucoz Đường đơn C 6 và C5

[ 1Phenylpropan

Lignìn Kitin

N-acetinglucozsamin

Protein Hydro cacbon

Axìt amin Aliphatic,Cyclic, Aromatic

béo; một số chứa

+ + +

c -c sc - 0 P [l-4 ]

peptid

Glycerin, Axit Lipit

Không

+ + +

a [1 -4 ]

Có Oí + + +

este

PvàN Sinh khối vi sinh vật các dạng photphodieste

Axit nucleic Bazơ purin, pyrimidin, đường,

và dây nối N-glycosiđic

photphat

Cacbon được cổ định thoạt đầu nhờ vi khuẩn lam, tảo lục, vi khuẩn quang hợp [như C h r o m a tiu m

và

C h ỉo r o b ìu m

] và các vi sinh vật tự dưỡng hóa năng hiếu khí. Việc hao tồn

chất hữu cơ chịu ảnh hưởng của nhiều nhân tố: [l]-S ự tồn tại các chất dinh dưỡng trong môi trường; [2]- Các điều kiện phi sinh học [pH, thế oxy hóa-khử, oxy, điều kiện thẩm

551

thấu]; [3]- Sự tồn tại của quàn lạc vi sinh vật. Phần lớn các cơ chất hữu cơ phức tạp đều được vi sinh vật sử dụng. Các cơ chất này chửa đựng các chất dinh đưỡng cần thiểt cho sự sinh trưởng của vi sinh vật. Kỉtin, protein, sinh khối vi sinh vật và axit nucleic chứa nhiều nitơ. N ếu các cơ chất này đều được dùng để sinh trưởng, lượng nitơ dư thừa và các chất khoáng khác không được dùng để tạo sinh khối mới của vi sinh vật sẽ được thải vào môi trường và tham gia vào quá ừình khoáng hóa [mineralization]. Đó là quá trình m à chất hữu có bị phân giải và lảm sản sinh ra các chất vô cơ đơn giản [như CO 2 , N H 4 +, CH 4 , H 2 ] Các cơ chất phức tạp khác chỉ chứa

c, H,

o , nếu được vi sinh vật sử dụng để sinh

trưởng thì vi sinh vật cẩn sử dụng thêm các chất dinh dưỡng khác từ m ôi trường để tổng hợp sinh khối, đó là quá trình cố định hóa [immobilization]. M ối quan hệ của việc sử dụng các cơ chất này với oxy cũng rất lý thú. Ngoài hydrocacbon và lignin ra, đại đa số các cơ chất đều dễ bị hao tổn trong điều kiện có oxy hoặc không có oxy. Q uá ưình hao tổn hydrocacbon nhờ vi sinh vật là rất đặc biệt, nhất là với những hydrocarbo m ạch thẳng hay m ạch phân nhánh, đòi hỏi trước hết phải có sự xâm nhập cùa phân tử O 2 . Gần đây người ta phát hiện thấy sự hao tổn kỵ khí hydrocacbon với các chất oxy hóa là sulfat hay nitrat. Khi có m ặt sulfat thì các vi khuẩn thuộc chi D e s u ỉ/o v ib r io

hoạt động, sự hao tổn phát sính rất chậm và quần lạc vi sinh vật cần một thời

gian dài để tiếp xúc với các phức chất này. Sự hao tổn này cuối cùng sản sinh ra sulfit, chất này cùng tồn tại với dầu m ỏ ừong dạng “khí chua” [sour gazs]. Lignin là m ột loại thành phàn kết cấu quan trọng trong vật liệu thực vật trưởng thành. Đó là loại cao phân tử vô định hình phức tạp m à cơ sở là các khối phenylpropan nói với các liên kết cacbon-cacbon và cacbon-eter. Chúng chiếm đến 1/3 ừọng lượng của gỗ. Đó là m ột trường hợp đặc biệt m à sự hao tổn sinh học [biodegrability] phụ thuộc vào O 2 có thể sử dụng.Sự hao tổn lignin thường không rõ rệt, vỉ phàn lớn nấm sợi làm hao tổn lignin tại chỗ

[in s itu

] chỉ có thể tác dụng trong điều kiện có O 2 , thông qua các enzym oxitaz làm giải

phóng ra các loại oxy hoạt động. Trong điều kiện không cỏ oxy, lignin khó bị vi sinh vật làm hao tồn, kết quả là làm tích lũy các vật liệu lignin, bao gồm sự hinh thành than bùn và đất ải [muck soils]. V iệc lignin khó bị phân giải ữong điều kiện kỵ khí là điều rất quan trọng ữong ngành kiến trúc. Các cấu trúc xây đựng lớn trên đầm lầy thường đặt các tấm gỗ dưới m ặt nước v à xây vật kiến trúc ưên các đống gỗ ấy. N ếu duy tri điều kiện kỵ khí thì các kết cấu ấy rất ổn định. N hưng nếu m ặt nước hạ xuống thì các tấm gỗ sẽ m ục nát, các kết cấu kiến trúc cỏ thề b ị đe dọa. M ột trường hợp t jrcmg tự khác ỉà các nấm sợi có thể tăng cường sự hao tổ n thành gỗ của thuyền bè trong điều kiện hiếu khí. D ạ cỏ là m ột ví dụ khác về mối liên hệ giữa lignin v à oxy. Trong dạ cỏ hầu như không có oxy do đó khó có thể làm hao tổn thành phàn lignin ừong thức ăn. Sau khi sử đụng được phần đường và các hợp chất carbohydrat, thi phần còn lại trong phân trâu bò sẽ có tác dụng tốt trong việc cải tạo đất đai.

552

Tại nhiều khu vực hình thức làm hao tồn nhờ vi sinh vật là rất quan trọng. Chúng tham gia vào quá trình tích ỉũy các sản phẩm của dầu mỏ, sự hình thành các đầm lầy và bảo tồn các hiện vật lịch sử.Trong điểu kiện hiếu khí hoặc kỵ khí, lúc cơ chất hữu cơ bị vi sinh vật tác động hoặc khoáng hóa, sự có m ặt hay vắng m ặt của oxy cũng đều ảnh hưởng đến sự tích lũy các sàn phẩm cuối cùng. Trong điều kiện hiếu khí vi sinh vật làm hao tồn các chất hữu cơ phức tạp vả làm sinh ra các chất oxy hóa như nitrat, sulfat và CO 2 . N gược lại, trong điều kiện kỵ khí sẽ dễ dàng tích lũy các sản phẩm cuối cùng dạng khử, bao gồm ion amon, sulíĩt, và metan. Các dạng oxy hóa hay khử này nếu chúng còn lại trong môi trường hiếu khí hoặc kỵ khí đã hỉnh thành nên chúng thì thường chỉ

tr ở

thành các chất dinh dưỡng. Nếu

có sự hỗn hợp thì các loài oxy hóa sẽ đi chuyển về các khu vực cỏ tính khử nhiều hơn, còn các loài khừ sẽ đi chuyển về các khu vực có tính oxy hóa nhiều hơn. Trong những môi trường như vậy [nối với các chất oxy hóa và chất khử] sẽ có k hả năng sản sinh năng lượng ngoại sinh. Khi các chất oxy hóa và các chất khử này bị vi sinh vật tác động sẽ dẫn đến sự xúc tiến vòng tuần hoàn dinh dưõng.

H ìn h 2 3 .2 9 : Ả n h h ư ở n g c ủ a o x y đ ổ i v ớ i s ự p h â n g iả i c á c c h ấ t h ữ u c ơ [ th e o L .M .P r e s c o tí v à c ộ n g sự ].

553

Đặc điểm của vòng tuần hoàn cacbon là: - R ất nhiều kho

nhỏ [C dạng trong C 0 2 khí quyển, trong cơ thể sinh vật] chuyển

hóa với tốc độ nhanh, trong khi c trong kho c lớn [C hữu cơ trong m uối cacbonat và vật trầm tích] thì chuyển hóa với tốc độ chậm và tác động tới các kho

c khác.

- Tuần hoàn trong biển và trong đất liền tiến hành tương đối độc lập, giữa chúng có sự ừao đổi bằng CO 2 - Vi sinh vật có tác dụng to lớn khi khoáng hóa chất hữu cơ và phân giải c hữu cơ, nhưng có tác dụng rất nhỏ trong việc CO 2 . 23.4.2.2. Vồng tuần hoàn L ư u huỳnh

Lưu huỳnh [S] là nguyên tố lớn thứ 14 ừong vỏ Trái đất, phân tử lượng là 32,06. Giống như p, hàm lượng s ưong cơ thể khá thấp, chỉ vào khoảng 0,25% , nhưng lại là một thảnh phần quan trọng của chất nguyên sinh. Trong thiên nhiên hóa, từ hỏa ừị -2 đến + 6 , nhưng chỉ có

dạng oxy hóa hay gặp, xem

hlnh thành

dạng oxy

b ả n g 2 3 .5 .

Bảng 23.5: Các dạng lim huỳnh và các trạ n g th ả i oxy hóa ch in h [C harỉson vổ cộng sự, 1992]

Hóa trị -2

Khí quyển Thể khi

D ạng hạt

h 2 s ,r s h

0 +2 +4

Thâ/ quyến

RSSR c h 3 SOCH j

s 2o - \ so2

Thề nhưỡng

H2SsHS“t s 2, RS" RSSR

r s h ,o c s ,c s 2 -1

Nham quyển

SO 2 .H2O

H 2SO 3.

CH 2 SOOH

h s o 3-

S '\ HS" MS

Sinh quyển N h a m th ạ c h

S‘2 ,HgS

Cystein, Cystin,

FeS2 s*2 s8

so 2-3

S 0 23

s c >2

H 2SO 4 N H 4H SO 4 [ N H 4] 2S 0 4

h 2so 4

CaS04

h so 4

CaS04.H A MgSCŨ

S 0 ‘24

N f t 2S 0 4

c h 2 so 3h G h i c h ú : R l à g ố c h y đ r o c a c b o n [ n h ư C H ì], M l à i o n k ừ n ỉ o ọ i

s nhẩt, là nguồn s lớn nhất trên ưái đất. Kho d ự trữ schính ờ nham quyển [như quặng sulfija, strầm tích và nhiên liệu khoáng]. K hối lượng m uối sulfat hòa tan ứong nước biển cũng rất lớn. s còn tồn tại trong Trong các loại oxit, quặng sắt vàng [FeS2] chửa nhiều

554

khí quyển với các dạng khí H 2 S, SO 2 và sulfila metyl. C ơ thể sinh vật và chất hữu cơ chứa rất ít s [bảng

nhưng là nguồn s có tốc độ tuần hoàn nhanh.

1 0 .6 ],

B ản g 23.6:

K ho

tr o n g

Kho s

bề m ộ t t r ả i đ ấ t [ S c h l e s i n g e r ,

1997]

Hàm lượng/ X 1018 gS 2,8 X 10' 7 1280 7440 0,0085 0,0155 8720

Khí quyển Nước biển Đá trầm tích Thực vật ừên cạn Chất hữu cơ trong đất Tổng cộng

Oxy ho á ÌuHi huỳnh Khử sulfat [dồng ho á]

ụ e s u ụ o Y ie iv

' Lim huỹnhliũtico'

Quà trinli khoáng hođ vật ầ Ỉ t

Aìíeromonas Clostridium Desuựứvibro Desuựoiomacuĩun

íKỈỊịr sụlísit [dị hóa]

Oxyhoả sulfur ThìohadUus Beggìatoa :

Thioứtrix ■

V 4#: ; I , «>

m 4 ụ a itắ đ tiệ m W

hiểu kh i không sìnhơxỵ

Chlowbium iu m I Kỵ khi tiu m Ị Chromaảum

H ình 23.30: Vòng tuần hoàn lưu huỳnh cơ sở [theo L.M .Prescott và cộng sự].

555

Tuần hoàn s là m ột trong các vòng tuần hoàn phức tạp nhất của sinh quyển, vừa có tuần hoàn thể khí, vừa có tuần hoàn trầm tích, cho nên được coi thuộc dạng tuần hoàn quá độ. Trong tuần hoàn lưu huỳnh, Vi sinh vật xúc tác các quá trình oxy hóa và khử s dưới các hành thức khác nhau, thúc đẩy tuần hoàn sinh địa hóa học và đóng vai trò quan trọng hàng đầu. Quá trình cơ bàn của vòng tuần hoàn s là: tầng nham thạch sulfat và nhiên liệu hỏa thạch trong đất liền và trong đại dương bị phân hủy và phong hóa tự nhiên, cùng với sự phun ừào núi lử a . . .sẽ giải phóng H2 s, SO 2 vào khí quyển, s trong khỉ quyển thông qua tác dụng m ưa và trầm lắng m ột phần ừ ở về biển, phần khác trong đất biến thành muối sulfat dành cho thực vật hấp thu, là thành phần của một số axit amin, di chuyển trong chuỗi thức ăn. Chất bài tiết và xác động thực vật bị vi sinh vật phân hủy, s bị giải phóng ra, lại trở về đất hoặc qua các dòng chày trên mặt đất rửa trôi về sông hồ rồi tới biển và trầm tích ở đáy biển sâu. Do hàm lượng s trong thiên nhiên rất phong phú, nhu cầu của sinh vật đối với s không nhiều như đối với c , o , p, nên s rất ít khi ừ ở thành nhân tổ hạn chế đổi với sự sinh trưởng của cơ thể.

H ìn h 2 3 .3 1 : V ò n g tu ầ n h o à n lư u

556

huỳnh [ t h e o

J .G .B la c k ] .

Vi khuẩn quang hợp dùng hợp chất lưu huỳnh làm chất cho elecừon để chuyển hóa lưu huỳnh. Đó là chức năng của

T h io b a c iỉlu s

và các vi sinh vật tự dưỡng hóa năng tương

tự. Ngược lại, khi sulfat khuếch tán đến môi trường có trạng thái khử thì chứng sẽ tạo cơ hội cho những nhóm vi sinh vật khác tiến hành khử sulfat [sulfat reduction]. Chẳng hạn, khi tồn tại m ột chất khử hữu cơ có thể sử dụng được thì vi khuẩn

D e s u ỉý o v ib r io

sẽ dùng

sulfat để làm chất oxy hỏa, sử dụng sulfat như chất nhận elecừon ngoại lai để hình thành sulíít tích lũy lại trong môi trường. Đó là ví dụ điển hình của quá trình khử dị hóa [dissimilatory reduction] và hô hấp kỵ khí. Ngược lại, việc khử sulfat trong quá trình sinh tổng hợp axit amin và protein được coi là một quá trình khử đồng hỏa [assimilatory reduction]. N hiều vi sinh vật khác cũng được biết đến là ỉoại khử dị hóa lưu huỳnh nguyên tố, đó là

D e s u lfu a o m o n a s ,

cổ khuẩn ưa nhiệt, và cả các vi khuẩn lam ừong các trầm tích có

độ muối cao.Sulfit là m ột dạng trung gian quan trọng khác, nó có thể bị nhiều loại vi sinh vật khừ thành sulfit, đó là các vi khuẩn như A l t e r o m o n a s , Vi khuẩn

D e s u ỉ/o v ib r io

C lo s tr id iu m

và

D e s u lfo m a c u lu m .

thường được coi là loại kỵ khí bát buộc. Tuy nhiên các nghiên cứu

gần đây cho biết khi chúng tồn tại trong m ôi truờng có mức oxy hòa tan là 0,04% thì chúng cũng có thể đùng oxy để hô hấp. Ngoài ra, các vi khuẩn oxy hóa lưu huỳnh thuộc nhóm tự dưỡng quang năng rất quan trọng như

C h r o m a tiu m

và

C h ỉo r o b iu m

có thể tác động m ạnh trong điều kiện

kỵ

khí nghiêm

ngặt dưới chiều sâu của nước, m ột nhóm lớn các vi khuẩn khác nhau có thể thực hiện quang hợp hiếu khỉ không sinh oxy. [aerobic anoxyic photosynthesis]. Trong môi trường nước biển và nước ngọt phát hiện thấy các vi khuẩn quang hợp hiếu khí không sinh oxy này sử dụng sắc tố bacteriochlorophyl a và carotenoit, chúng thường là thành phần chính cùa quần lạc vi sinh vật. Các chi chủ yếu là

E r y th r o m o n a s , R o z o c o c c u s , P o r p h y r o b a c te r

và

R o z o b a c te r .

Các thành phần “nhỏ” ứong vòng tuần hoàn lưu huỳnh có vai ữ ò quan trọng trong sinh học. M ột ví đụ điền hình ỉà dimtylsulfoniopopionat [DM SP], chúng được sử dụng bởi vi khuẩn phù du [bacterioplankton] như nguồn lưu huỳnh để tổng hợp protein, chuyển hỏa thành dim etylsulfit [DM S] - m ột chất lưu huỳnh bay hơi có thể ảnh hưởng tới các quá trình của khí quyển. Khi điều kiện pH và thế oxy hóa khử thích hợp, nhiều chuyển hóa quan trọng trong vòng tuần hoàn lưu huỳnh cũng không có sự

c ỏ th ể

thực hiện thông qua các phản ứng hóa học m à

gia của vi sinh vật. M ột ví dụ quan trọng cùa quá trình phi sinh học này

là sự oxy h ó a sulfit thành lmi huỳnh nguyên tố. N hững bước then chổt của vòng tuần hoàn s bao gồm các quá trinh sau đây:

557

a - Đ ồ n g h ó a lư u h u ỳ n h ;

B ó là quá trình vi sinh vật sử dụng sulfat và H 2 s tạo nên vật

chất của tế bào. Vi sinh vật ngoài một số rất ít có thể đồng hóa trực tiếp s, phần lớn phải đùng sulfat làm nguồn s . Sau khi chúng hấp thu sulfat sẽ khử thành sulíua, kết hợp với các chất của tế bào như protein, quá trinh đó được gọi là tác dụng khử sulfat chất đồng hóa.Tác dụng khử sulfat cần đùng tới năng lượng. Trước khi khử sulfat cần tiêu hao A TP để chuyển hỏa thành ađenosin 5 ’ photphosulfat [APS]; tiếp theo phải tiêu hao A TP thứ 2 để chuyển hóa APS thành 3 ’ photphoadenosin 5 ’-photphosulphat [PAPS]. Sau đó khử PAPS thành sulfit, rồi khử tiếp thành sulfit. Sulíít sinh ra được serin hấp thu, rồi tạo thành cystein. b- Tác dụng kh ử h n t hưỳnh

[desulphuration]: chỉ quá trình protein và các chất hữu

cơ chứa s khác được vi sinh vật phân hủy phóng thích H 2 S. N hiều Vi sinh vật hoại sinh trong hồ có khả năng này, chẳng hạn các loài sống ừong những hồ nghèo dinh dưỡng như M y c o b a c te r iu m p h le i, M y c o b a c te r iu m filifo r m e ;

các loài sống trong những hồ giàu dinh

dưỡng như Pseudomonas fluorescens, Bacterium deỉìcatum V.V... Các loài tảo biển thường tổng hợp dim etylsulfoniopropionat [D M SP], dùng để điều tiết áp suất thẩm thấu tế bào. DMSP được vi sinh vật phân giải chuyển hỏa thành dim etylsulfit [DMS]. D M S bay hơi vào khí quyển, rồi sẽ cùng với H 2 s dưới tác dụng của ánh sáng tạo thành sulfat:

H2 S/DMS -* s 20 '23 -►H2S04 Loài người đốt cháy các nhiên liệu chứa s , thải SO 2 ra khí quyển, hình thành khói axit. H2 SO 4 tan trong hơi nước, khiến cho pH nước m ưa từ trung tính giảm xuống còn 3,5, hỉnh thành nên

m ư a a x it,

gây ô nhiễm m ội trường vả làm nguy hại đến sức khỏe nhân loại..

c- T á c d ụ n g lư u h ó a

[sulphurication]: Q uá trình hình thành H 2 SO 4 từ H 2 S, s , FeSƠ 4

gọi là lưu hóa hay oxy hóa lưu huỳnh [sulfua oxydation]. Tham gia tác dụng lưu hóa cỏ vi khuẩn lưu hóa và vi khuẩn lưu hùynh. -

V i k h u ẩ n lư u h ó a :

N hữ ng loài thuộc chi

T h io b a c iỉlu s

có thể oxy hóa s hoặc sulfit

để thu năng lượng, sinh ra H 2 SO 4 , đồng hóa CO 2 và tổng hợp nên chất hữu cơ, thường bên trong tế bào không ch ứ a trữ các hạt lưu huỳnh, n h u

2 S + 3Ơ2 + 2H2O N a2 S 2O 3 +

—

*■

T h io b a c iỉlu s th io o x ita n s

chẳng hạn:

2H2SO4 + năng lượng

O 2 + H 2 O —►Na 2 S 0

+ H 2 SO 4 + năng lượng

H2S + O2 —* 2 H2O + năng lượng Vi khuẩn

T h io b a c ìlỉu s /e r r o o x y d a n s

có thể thu được năng lượng từ qua trình oxy hóa

FeSC>4 thành Fe 2 [ 8 0 4 ] 3 : 4 F e S 0 4 + 0 2 + H 2 S 0 4-> 2 Fe 2 [S 0 4] 3 + H 20

SS8

Vi khuẩn

T h io b a c illu s fe r r o o x y d a n s

chịu được axit m ạnh, Fe 2 [SƠ 4 ]3 lại là chất dễ

hòa tan, vì vậy cỏ thể dùng vi khuẩn này để tách được đồng, sắt ra từ các dạng x ỉ quặng hay quặng nghèo: FeS + 7 Fe 2 [S 0 4] 3 +

H 20 - » 1 5 F e S 0 4 +

Cu2S + 2 Fe 2[S04]3

H 2 SO 4

2Cu SO4+ 4 FeS04 + s

Phương pháp tách quặng thông qua vi khuẩn được gọi là phương pháp

ỉu y ệ n k im ư ớ t,

các chất F e S 0 4>C 11SO 4 sinh ra sẽ qua các phưcmg pháp hiện đại để thu hồi lại kim loại. N goài ra, vi khuẩn lưu huỳnh màu lục và vi khuẩn lưu huỳnh m àu tía có thể quang hợp ừong điều kiện kỵ khí: C 0 2 + H2S -*• [C H2 0 ] +2S + 2 H20 [ánh sáng] 3 C 0 2 + 2S + 5H20

3[CH 2 0 ] + 2H 2 S 0 4

[ảnh sáng]

khuẩn ỈĨỈU huỳnh: c ỏ thể oxy hóa H 2S thành s và tích trữ hạt s trong tế bào. Khi môi trường thiếu H 2 S, chúng sẽ oxy hóa tiếp s thành H 2 S O 4 , nâng lượng sinh ra được -

Vỉ

dùng để cố định CO 2 : 2 H 2 S + O 2 —*►2S + 2 H 2 0 + năng lượng 2

S + 2 H 2 O —> 2 SO "24 + 4H+ + năng lượng

V i khuẩn lưu hùynh bao gồm 2 loại - vi khuẩn lưu huỳnh đạng sợi và vi khuản lưu huỳnh tự dưõng quang năng. d - T á c d ụ n g k h ử s u lfa t [ s u lfa t r e d u c tio n ]

Tác dụng khử sulfat cỏ

dạng: dạng đồng hóa và dạng dị hóa. Tác dụng khử sulfat

dạng dị hóa là quả trình s hoặc sulfat dưới tác đụng của vi sinh vật được dùng làm thể nhận elecừon v à bị khử thành H 2 S. Ví dụ phẩy khuẩn

D e s u lfo v ib r io d e s u lfu a ic a n s

có thể sử

dụng glucoz và lactoz để khử sulfat:

c 6 H 12 0 6 + 3H2S04 2

C02 + 6 H2O + 3 H2S + năng lượng

CH 3 CHO H CO O H [axit lactic] + H 2 S 0 4 -*• 2 CH 3 COOH [axit axetic] + 2 CO 2 +

2 H 2O + H2S + năng lượng Trong phản ứng ừ ê n axit lactic oxy hóa không triệt để, làm tích lũy axit axetic.Trong các ống thóat nước thải bằng bê tông hoặc bằng gang, nếu có m ặt sulfat, đáy ổng thường do thiếu oxy sẽ sản sinh ra H 2 S. H 2 S sẽ nổi lên bê m ặt tầng nước thải, gặp oxy hòa tan, H 2 S bị vi khuẩn lưu huỳnh hoặc vi khuẩn sulfua hóa oxy hóa thành H 2 SO 4 và làm ăn m òn

559

đường ống. Trong thực tế có thể chống ăn mòn bằng cách duy trì dòng nước thài chảy thông suốt và nâng cao điện thế khử. e - S ự k h ử lư u

huỳnh t r o n g

th a n

Trong than thường có một lượng nhất định các hợp chất lưu huỳnh [chừ ưếu là hữu cơ và s trong quặng pyrit chứa sắt]. Khi đốt than sẽ xuất hiện khói HỉS có hại, khí này tham gia vào các trận mưa axit, làm ô nhiễm đất và nước, phá hoại cân bằng sinh thái. VI vậy việc khử s và phân hủy s trong than là một vấn đề có ý nghĩa toàn cầu, Vi sinh vật phân giải s ữong quặng pyrit theo 2 phương thức: một là, trực tiếp oxy hỏa và làm hòa tan quạng; hai là, tác dụng gián tiếp theo cơ chế như sau: 2FeS2 + 702 + 2H20 — 2FeS04 +2 H2SO4 Vi sinh vật 2 FeSƠ4 +

Vi O 2 + H 2 S O 4 —*

F e2 [S Ơ 4 ]3

+H 2O

Vi sình vật FeS2 + Fe2[S04]3 ■-* 3FeS04 +3S 2S + 302+ H2]

2 H2SO4

Vi sinh vật

shữu cơ ữong than chù yếu là hợp chất dạng thơm của Fe, và nhóm lipit chứa Fe, ừong đó chứa hàm lượng cao là DBT- dibenzothiophene. Vi sinh vật có hai phương thức phân giải DBT:một ỉà, tác dụng trực tiếp lên nguyên tử strong DBT; hai lồ, biến sthành H2SO4. Tham gia vào việc khử

s trong than cỏ nhiều nhỏm vỉ

sinh vật khổc nhau;

T h io b a c iỉlu s th io o x ita n s , T h ìo b a c illu s fe r r o o x ita n s , P s e u d o m o n a s , A lc a lig e n s , E s c h e r ic h ia c o ỉỉ, S u ỉ / o ỉ o b u s a x ừ o c a ỉ d a r i u s ...

ó 4

560

♦ HNT«

H ì n h 2 3 . 3 2 : Q u á t r ì n h p h â n h ú y D B T c h ứ a ỉ u v h ụ ỳ n h t r o n g th a n .

23,4.2.3. Vòng tuần hoàn n itơ

Cơ bàn của vòng tuần hoàn niter là quá trình Nitrat hóa [N itrification], Phản nitrat hóa [Denitrification] và c ố đinh nitơ [Nitơ fixation], N itơ chủ yếu tồn tại ở khí quyển, chiếm tới 78% trong khí quyển, trong sinh quyển chỉ chiếm 0,3% tổng khối lượng sinh vật. Muối vô cơ của nitơ [muốỉ amon, nỉtrat, nitrit] có độ hòa tan trong nước cao, dễ tham gia vào vòng tuần hoàn. Chất m ùn [humus] ữong đất ôn đới thông qua việc khoáng hóa từ từ mà chuyển biển thành N vô cơ. Vùng nhiệt đới do nóng và ẩm, tốc độ khoáng hóa nhanh, ít tích Ịũy chất mùn. Khí nitơ lồ khi trơ, m uốn m ở nổi N =N cần dùng nhiều năng lượng, chỉ

có một số ít sinh vật cổ định được Nitơ. Thông qua tia chớp phóng đ i ệ n , phun trào cùa núi lửa, cũng có thể cố định được một lượng ít nitơ, Ngoài ra cố định nỉtơ tại các nhà mnáy phận đạm hỏa học [tốn rất nhiều nang lượng] cũng có thể biến N ỉ thảnh m uối amon hoặc nỉtrat cimg cấp cho cây trồng. Khoảng 85% tác dụng cố định nitơ trên Trái đất là do vi sinh vệt cố định nitợ thực hỉện, trong đỏ 60% xẩy ra trên đất liền và 40% xẩy ra ở đại dương.Thực vật hắp thụ nitơ vô

Qơ

trong đẩt, chù yổu là nitrat để tổng hợp ra protein thực

vật, Động vật hấp thu protein thực vật để tổng hợp thành protein động vật, Xác động thực vật và chất bài tiết chứa nitơ được vi sỉnh vật phân hùy trở lại thành nitơ vô cơ, m ột phẩn được thựp vệt hắp thu, phần còn lại qua táe dụng cùa vị khuẩn phàn nitrat hóa biến thành khí nitơ trở về khí quyển.

561

Khù nitrat

Nitrat hoá [Niùvbacte Niùvaxus]

ẳonghoá

ĩ* híítt c

m ;

~f^~GeứbactermetaỉiÌKducens Ị Desuựotibro Cbstrũũum Dị hoá và khoáng hoa

... Nìtraỉhoá

Ợũừosomonas, Nitmsococcus]

Hình 23.33: Vòng tuần hoàn nìtơ cơ sở [theo L.M. Prescott và cộng sự]. Vi sinh vật dị dường [heteroừophs] cũng có thể tiến hành niưat hóa, m ột số vi sinh vật dị dưỡng còn cỏ thể kết hợp quá ừ ìn h nitrat hỏa với quá ư ìn h phản n iừ at hóa kỵ khí, đó

là quá trình oxy hóa NH 4+ trong điều kiện mức oxy thấp và tạo ra N 2O và N 2. Trong điểu kiện thiếu oxy việc tồn tại quá ư ìn h oxy hóa ion amon [anam m ox là m ột thuật ngữ thương nghiệp] cho thấy quá trình nitrat hóa không chỉ là quá trinh hiểu khí. Vì vậy khi chúng ta tìm hiểu vòng tuần hoàn sinh địa hóa học, bao gồm cả vòng tuần hoàn nitơ, trong các sách trước kia những vòng tuần hoàn đơn giản đã không phản ánh chính xác các quá trình sinh địa hóa học. N itrat hỏa ỉà m ột quá trình hiếu khí , oxy hóa ion am on [NHU*] thành nitrit [NO 2 ], rồi sau đó oxy hóa thành nitrat [NỌ}*]. Chẳng hạn, vi khuẩn thuộc các chi N itr o s o c o c c u s N ỉtr o b a c te r

N itr o x o m o n a s

và

đỏng vai trò quan trong trong giai đoạn trước, còn vi khuẩn thuộc chi

v à các vi khuẩn dị dưỡng hóa năng tương ứng sẽ thực hiện giai đoạn sau. Gan

đây người ta p hát hiện thấy vi khuẩn

N iừ o x o m o n a s e u tr o p h a

ừ ong phản ứng phản nitrat

hóa tương quan, sẽ dùng N O 2 làm chất oxy hóa, trong điều kiện kỵ khí oxy hóa ion amon thành nitrit và N O . N goài ra, quá trinh nitrat hóa dị dưỡng [heteroứophic nitrification] thực

hiện bời vi khuẩn và nấm đóng vai ưò quan trọng ừong những môi trường axit.

562 r

Đ ộng vật nguyên siuli vá ttộng vật

...ỷ d i

H ì n h 2 3 . 3 4 : V ò n g t u ầ n h o à n n i t ơ [ t h e o M . K . C o w a n , K .P . T a ỉe r o ] .

563

Q uá trình phản nitrat hóa [denitrification] đòi hỏi m ột loạt các điều kiện môi trường khác nhau. Đ ó là m ột quá trình dị hóa, thông thường do các vi khuẩn dị dưỡng như P s e u d o m o n a s d e n itr ijic a n s

thực hiện. Trong quá trình này nitrat sẽ là chất oxy hóa trong

điều kiện hô hấp kỵ khí, tuy vẫn có thể tích lũy nitrit, nhưng sản phẩm chủ yểu của quá trinh phản nitrat hóa là N 2 và N 2 O. N itrit rất hệ trọng đối với m ôi trường vì chúng có thể tạo ra các nhân tố gây ung th ư [carcinogenic] thuộc loại niừosam in. Sau nữ a là nitrit có thể bị chuyển hỏa thành am on do tác dụng khử dị hóa của nhiều loài vi khuẩn khác nhau, bao gồm các vi khuẩn

G e o b a c te r m e ta lỉir e d u c e n s , D e s u ỉ/o v ib r io

spp., và

C lo s tr id iu m .

Q uá trình đồng hóa n itơ íà việc sử đụng nitơ vô cơ làm chất dinh dưỡng và dùng

chúng để tạo Ta sinh khối mới của vi sinh vật. Vì ion amon đã bị khử cho nên chúng trực tiếp thâm nhập m à không cần tiêu hao nhiều năng lượng. Tuy nhiên lúc đồng hóa nitrat lại cần dùng nhiều năng lượng để khử. Trong quá trình này nitrit có th ể đirợc tích lũy như một loại sản phẩm trung gian. Sinh vật nhân nguyên thủy hiếu khí hay kỵ khí đều có m ột số loài có khả năng cố định nitơ, nhung khả năng này không cỏ ở các sinh vật nhân thực [eucaryotes]. Trong điều kiện hiếu khí có khá nhiều loài vi sinh vật sống tự do tham gia vào quá trình này [A z i t o b a c t e r , là thuộc chi

A z o s p ir iliu m

C lo s tr id iu m .

]. Trong điều kiện kỵ khí vi khuẩn cổ định nitơ quan trọng nhất

V i khuẩn lam , chẳng hạn như Ả n a b a e n a ,

O s c iỉỉa ío r ia ,

do cố định

nitơ đa ỉàm tăng nguyên tố n itơ trong m ôi trường nước. N goài ra còn có quá trình cổ định nitơ do quan hệ cộng sinh giữa thực vật v à vi sinh vật. Ví dụ sự cộng sinh của vi khuẩn nốt sần

[R h iz o b iu m , B r a d y r h iz o b iu m

thân gỗ, của vi khuẩn lam

] với cây bộ Đậu, của xạ khuẩn

À n a b a e n a a z o lla e

F r a n k ia

với nhiều cây

với bèo hoa đâu [A z o ỉ ỉ a ].

Quá trình cố đ ịnh nitơ đòi hòi phải có m ột chuỗi nối tiếp các bưởc khử. A m on - sản phẩm của quá trình nitơ - gia nhập ngay vào chất hữu cơ dưới dạng m ột amin. Các quá trình khử là rất m ẫn cảm với O 2 v à phải phát sinh trong điều kiện kỵ khí, ngay cả với các vi sinh vật hiếu khí. Sự bảo vệ cảc enzym cố định nitơ được thực hiện bởi nhiều cơ chể khác nhau, bao gồm c ả các rào cản vật lý, chẳng hạn như các dị bào tử [heterocysts] ở vi khuẩn lam. Trong hình 10.29 ta thấy v i sinh vật có thể oxy hóa N H í+ kỵ khí cùng với việc khử

NO2’ để làm sản sinh ra N2- đó là quá trinh oxy hóa amon thiểu oxy [anam ox process]. Quá trình này có thể giúp loại bỏ n itơ trong nưởc thải ở các phân xuởng xử lý nước thải, làm giảm sự m ẫn cảm với n itơ ở các hệ sinh thái nước ngọt v à n uớc biển. Tập đoàn vi sinh vật phù du [planctom ycetes] đóng vai trò quan ữọng trong quá trình này.

564

H ì n h 2 3 . 3 5 : V ò n g t u ầ n h o à n n i t ơ t r o n g t ự n h i ê n [ t h e o J . G .B l a c k ] .

Lượng nitơ trong quá trinh tuần hoàn tính theo tỷ tấn [10ỉ5 g] được thống kê như sau: Trong khí quyển- 3 800 000; Trên lục địa: phản nitrat hóa - 0,12/nãm; xác hữu cơ - 300; am on do phân giải chất hữu cơ chuyển vào khí quyển - 0,075/năm; cố định sinh học - 0,14/năm; cố định công nghiệp - 0,036/nãm ; cố định do tia chớp - 0,004/năm; nitơ theo sông ra biển: NO3' 0,008/năm, N H / - 0,005/năm. Trong đại dương: cố định sinh học - 0,10/nãm; cố định do tia chớp- 0,004/năm; xác

hữu cơ - 550; chất vô cơ tạo thành do amon hóa và niưat hỏa- 577; phản nitrat hóa0,09/nãm; trầm tích: 0,00025NH4+/năm; 0,002 N/năm Q uá trình chuyển hóa nitơ hữu cơ thành muối am mon được gọi là quá ừình am on hỏa [amonification]. Dưới tác đụng của vi sinh vật protein, axit am in, các b azơ nitơ sỗ bị thủy phân tạo thành axit amin.

Sau đó tiếp tục phân hủy tới N H 3 .

Protein

polypeptit

proteinaz

axit am in

polypeptitaz

565

Quá trình amon hóa có sự tham gia của nhiều enzym khác nhau, sau đây là một sổ ví dụ: D eam ination oxy hóa: RCH CO OH + 1/2 0 2

-ỳ

RCOCOOH + NH 3

deaminaz

NH 3

Deamination thủy phân: RCHCO O H + H 2 O I

RCHOHCOOH+NH3 deaminaz

NH3

Deamination khử:

RCHCOOH + 2 H -ỳ RCH2COOH+NH3 I nh

N H 3 giải phóng ra lại có thể bị vi sinh vật sử dụng. V iệc tiến hành tái đồng hóa amon [cố định sinh học] và am on hóa [khoáng hóa] có liên quan đến tỳ lệ C/N trong m ôi trường. Thông thường lúc N H 3 bị hạn chế thì quá trình cố định sinh học là chính, trong điều kiện ngược lại thì quá trình khoáng hóa lại là chủ yếu. N ếu tỷ lệ C/N bằng khoảng 20 thì quá trình cổ định sinh học và quá trình khoáng hóa đạt tới tỷ lệ lý luận bình quân.Trong sản xuất nông nghiệp khi bón phân tạo ra tỷ lệ C/N nhỏ hơn 20 thì quá trình khoáng hóa vượt quá quá trinh cố định sinh học. N gược lại, nếu tỷ lệ C/N cao hơn 20 thì quá trình cố định sinh học vượt quá quá trình khoáng hóa. Hai bước của quá trình niừ at hóa [nitrification] được trình bày như sau: N H ^ + 3/2 0 2 «— >N O 2 + H20 + H+ [-3]

[+3]

AGO’= -276kj.m or' NO

+ 1 /2

[+3]

0 2

«-►N O *3

[+5]

AGO’= -7 3 k j.m o r‘

Các vi khuẩn nitrat hóa thường được thực hiện bởi các vi khuẩn tự dưỡng. Điển hình là các loài N itrosolobus m ultiform s, N iừosococcus oceanus, N iữosococcus mobilis, N itrospina gracili, N iữosovibrio tenuis, N itrobacter w inogradskyi, N itroxom onas europaea, N itrosospira brieusis...

Bảng 23.7: Đặc điểm của các loài vỉ khuẩn nitrat hóa điển hình Phương thức phân cắt

NOl'oxy

NH4+oxy hóa thành NCV

Hình thái tế bào

Kích thước, lim

Nitrosoỉobus Multiform

Hình lá

1,5 X 1,5

Noãn phân

Chu mao

Nitrosococcus Oceanus

Hình cầu

1,8 X 2,2

Phân cắt

Chu mao

Nitrosococcus Mobiỉis

Hình cầu

1,5 X 1,8

Phân cắt

Cực mao [mọc ở 2 đầu]

Nitrospira Gracilis

Hình que mỏng

[03-0,4] X [2,7-6,5]

Phân cắt

Không

Nitrosovibrio Tenuis

Hình dấu phẩy

[0,3-0,4] X

Phân cất

Cực mao

Nẩy chồi

Cực mao

Phân cắt

Cực mao

Phân cắt

Chu mao

Tên vi khuẩn

Nìừobacter Winogradskyi

H ìn h

Nitroxomonas Europaea Nìtrosospira Briensìs

quả lê

rm iA

Tiên mao

hoa thành NOa -

+ +

[1,1-3,0]

[0,6-0,8] X

[1,0-2,0]

Hình que

{0,8-0t9 ]x [1,0-2,0]

Hình

xoắn

[0,3-0,4] X [1,0-5,0]

M ột số vi sinh yật dị dưỡng cũng có thể tiến hành nitrat hỏa nhưng chỉ thực hiện được giai đoạn 1 chứ không thể oxy hóa tiếp nitrit. Đó là nhiều loài thuộc các chi N o c a r d ia , A c h r o m o b a c te r , P s e u d o m o n a s , V ib r io , A s p e r g illu s , F u s a r iu m ...

Q uá trinh nitrat hóa chủ yếu là quá trình hiếu khí, thường xảy ra trong đất có pH trung tính, thoát nước tốt. Trong điều kiện kỵ khí hoặc trong điều kiện axit m ạnh rất hạn chể xảy ra quá trinh này. N itrat và nitrit do vi khuẩn oxy hóa thành, thực vật có thể hấp thu để tổng hợp ra các axit amin. Trong đất còn có m ột bộ phận nitrat được oxy hóa chậm chạp để trờ thành thành phân cùa chất m ùn. Vì ion amon mang điện tích dương, de bị các hạt đât sét mang điện tích âm hấp phụ, thông qua tác đụng nitrat hóa m à hình thành nên các ion n iưat và nitrit mang

567

điện tích âm, có thể di chuyển tự do trong dung dịch đất. N itrat ừong đất dễ bị nước mưa rửa trôi, theo dòng chảy tởi hồ, sông và biển, được sinh vật thủy sinh sừ dụng; hoặc bị rửa ừ ôi làm cho m ôi trường ngày càng thiếu oxy và dẫn tới tác dụng phàn nitrat hóa, tạo ra sự hao m òn nitơ của đất. Trong thực tiễn sản xuất phải bón phân N m ột cách khoa học, đồng thời phải dùng các chất ức chế quá trình nitrat hóa, như nitrapyrin, nhàm nâng cao hiệu suất phân bón, và ngăn ngừa nitrat từ các vùng đất màu m ỡ rửa trôi và làm ô nhiễm nguồn nước. Q uá trinh khử nitrat bao gồm khử niừat đồng hóa và khử nitrat dị hóa. -

K hử

niừat đ ồ n g

hóa

K hử nitrat đồng hóa là quá trình sinh học, sau khi nitrat được tể bào hấp thụ, sẽ khừ hình thành amon kết hợp vào vật chất tế bào. N hiều vi khuẩn, nấm và tảo cỏ khả năng khử

nitrat đồng hóa. Mục đích của quá trình này là sử dụng amon trong nitrat, mà không phái là chất nhận electron, cho nên hệ enzym khử niừat đồng hóa [gồm enzym khử nitrat đồng hóa và enzym khử nitrit đồng hóa] không bị ức chế bởi oxy khí quyển. -

K hử

nitrat

dị hóa

K hử nitrat dị hóa là quá trình sinh học sau khi nitrat được tế bào hấp thụ, được dùng làm chất nhận electron, qua đó khử thành anaon. Trong m ôi trường bùn bẩn, nước thải công nghiệp, hoặc trong dạ cỏ, đễ dàng sinh tác dụng khử nitrat đị hỏa. Trong quá trình này nitrat đóng vai trò chất nhận elecửon, cho nên tác đụng khử niừat dị hóa bị oxy ức chế. Khử nitrat dị hóa lại chia thành khử nitrat dị hóa dạng lên men và khử nitrat dị hóa dạng hô hấp. Đặc điểm khử nitrat dị hóa dạng lên men là không có sự tham gia của enzym két hợp m àng, cytocrom và photphoryl dẫn truyền electron, còn khử nitrat dị hóa dạng hô hấp thì ngược lại. N êu sản phẩm khử niử at dị hỏa dạng hô hấp ở thể khí như N 2 , N 2 O thỉ gọi là quá trình phản nitrat hỏa [denitrification]. Trong quá trình phản nitrat hóa, nitrat qua tác dụng của các enzym khử niứat, enzym khử N O ..., lấy cytocrom làm chất nhận electron, cuối cùng bị khử thành N 2 . M ột khối lượng lớn N 2 N 2 O được phóng thích vào khí quyển. Vi khuẩn phản n itrat h ó a phổ biến nhất ừong thiên nhiên là chi chi

A ỉc a ỉig e n s ,

ngoài ra còn có các chi

M o r a x e lỉa ,

P a r a c o c c u s , T h ìo b a c iỉỉits , B a c illu s , M ic r o c o c c u s

và

V ib r io .

P seu d o m o n a s,

s p ir iỉỉu m ,

rồi đến

C o r y n e b a c te r iu m ,

Vi khuẩn phản n iừat hóa phần

lớn là các vi khúẩn kỵ khí không bắt buộc, khi trao đổi năng lượng có thể dùng oxy hoặc nitrat làm chất nhận electron cuối cùng. V iệc khử n iửat cỏ ý nghĩa nhất định trong việc sử dụng chất h ữu c ơ ữong đất, nhưng tác đụng phản nitrat h ỏa làm giải phóng khí N 2 0 , cỏ thể tham gia vào việc phá hủy tầng ozon của khí quyển.

23.4.2.4. Vòng tuần hoàn sắt Sắt [Fe] là m ột trong 10 nguyên tố có hàm lượng phong phú nhất trong vỏ trái đất, nhưng trong cơ thể chỉ có khoảng

0 ,0 0 2

%. s ắ t là thành phần quan ừọng của enzym sinh

học, là nguyên tố không thể thiếu của chất diệp lục, sắt phát huy chức năng quan trọng trong hô hấp, qụang hợp, ừong các phản ứng oxy hóa khử đối với nitơ. Trong thiên nhiên sắt chủ yếu tồn tại dưới dạng quặng sắt vàng [FeS 2 ] tồn tại trong thạch quyển, trong nước có ít hơn. sắ t tồn tại dưới 2 dạng oxy hóa Fe2+và Fe3+. Khi chịu ảnh hường của vi sinh vật, pH vả thể oxy hóa khử, 2 dạng đó có thể chuyển hóa lẫn nhau. Chì có sắt hóa trị 2 m ới được vi sinh vật hấp thu sử dụng, chuyển hóa thành các chất hữu cơ chứa sắt. Sắt

sắt 3 và chất hữu cơ chứa sắt dưới tác dụng của vi sinh vật sẽ xẩy ra các

phản ứng oxy hóa, khử, thực hiện vòng tuần hoàn sinh địa hóa học của sắt

[ h ìn h 2 3 .3 6 ].

H ỉếuklú pịH trung tình =* G allionela pH axit ~ Leptospiìlum , ThiohaciU usferrooxidans pH axit v à tt ã nòng= Suựolobus

Fkrribacteriwn ĩimnetiứim [kobữctermttứìỉiTeducènĩ

Qữữbacitr ’ DesuỊfbro7nonasaC«ioxidayiĩ

VÍC tự

qnang n ă n t

H ình 23.36: vỏng tuần hoàn s ắ t [theo L M .P resco tt và cộng sự].

569

Vi khuẩn G a lỉio n e ỉỉa

T h io b a c iỉỉu s fe r r o o x ita n s

thực hiện quá ừình trong điều kiện axit. Vi khuẩn

rất hoạt động trong điều kiện trung tính. Còn vi khuẩn

S u l/o ỉo b u s

lại thực hiện

quá trình trong điều kiện axit và ưa nhiệt. Trong tài liệu trước đây còn nhắc đến hai chi vi khuẩn oxy hóa sắt khác là

S p h a e r o tìỉu s

và L e p t o t h r i x . Hai chi này được các nhà nghiên cứu

không chuyên về V i sinh vật học gọi là

v i k h u ẩ n sắ t.

Thực ra đó là các vi khuẩn dị dưỡng

hóa năng sinh trường ư ê n cơ chất hữu cơ trong điều kiện oxy h óa h ó a học ion sắt

thành

ion sắt 3 [hình thành kết tủa sắt không tan]. Gần đây người ta phát hiện thấy có những vi sinh vật oxy hóa Fe2+ dùng niừat làm chất nhận electron. Qưá trình này phát sinh trong vật trầm tích dưới nước với lượng chứa oxy rất thẩp. Có thể là có m ột con đường khác trong môi trường tích lũy rẩt nhiều sắt oxy hóa khi mức oxy rất thấp. V iệc khử sắt thực hiện trong điều kiện kỵ khí và sẽ dẫn đến việc tích lũy sắt 2. Tuy nhiên rất nhiều vì sinh vật trong quá trình trao đồi chất của m inh cỏ thể khử m ột lượng nhỏ sắt. Việc khử phần lớn sắt được thực hiện bởi những vi sinh vật hô hấp sắt đặc biệt [specialized iron-respiring], như là các vi khuẩn s u lfu a r e d u c e n s , F e r r ib a c te r iu m ỉim n e tìc u m

và

G e o b a c íe r m e ta ỉỉir e d u c e n s ,

S h e w a n e lla p u fr e fa c ie n s .

G e o b a c te r

Chúng lấy ion sắt

làm chất oxy hóa và thu được năng lượng từ chất hữu cơ để sinh trưởng. N goài việc khử các ion sẳt 2 tương đối giản đơn, có m ột số vi khuẩn từ hóa

[magnetite] như Aquaspirìỉỉum magnetotacticum có thể đem sắt ngoài tế bào chuyển hóa thành oxit sắt khoáng từ tính hỗn hợp hóa tn [ Fe 3 Ơ 4 ] và tạo thành kim chỉ nam bên trong tế bào. Ngoài ra, vi khuẩn khử sát dị hóa cũng có thể tích lũy sắt từ tính [m agnetite] như m ột sản phẩm bên ngoài tế bào. Trong các vật ừ ầm tích có thể gặp các quặng sắt từ tính dưới dạng các hạt, các hạt này giống như các hạt tìm thấy trong tế bào vi khuẩn. K ết quả nghiên cứu này cho thấy vi khuẩn có những cống hiến lâu dài trong các vòng tuần hoàn sắt. C ác gen m a hóa việc tổng hợp sắt từ tính [m agnetite] đã được clone hóa vào các vi khuẩn khác và làm sinh ra các vi khuẩn mới m ẫn cảm với từ tính. N hững vi khuẩn từ tính [m agnetotactic bacteria] hiện nay được gọi là

V i k h u ẩ n từ tin h -c ầ n k h ỉ

[magneto-aerotactic bacteria]. Chúng có thể lợi dụng

từ trường để chuyển d ịch đến những đầm lầy cỏ mức oxy thích hợp hom với các chức năng của chúng. K hoảng m ười m ấy năm gần đây người ta đã phát hiện thấy những vi sinh vật m ới, quang hợp không sinh oxy, có thể sử dụng ion sắt 2 để làm chất cung cấp electron. Do đỏ các vi khuẩn oxy hóa sắt n hư

G e o b a c te r

và

Shew aneU a

sinh ra ion sắt toong các vùng

kỵ khí sáng [lighted anaerobic zones] được xác định là khử sắt trên cơ sở dinh dưỡng hóa năng và tạo thành m ột vòng tuần hoàn sắt oxy hóa/khử kỵ khí b ắt buộc. Khi pH trung tính, sắt 2 trong không khí tự phát oxy hóa thành kết tủa hợp chất sắt 3, nhưng khi pH là axit thì sự oxy hóa đỏ rất chậm, vi khuẩn oxy hóa sắt ưa axit xúc tiến quá trình nói ư ên, hình thành nên chẩt lắng tủa m àu nâu và tiếp tục axit hóa chất sinh ra:

570

Fe2+ + 1/402 + H+-> Fe3+ + I/ 2 H 2 O Fe3++ 3H20 -» Fe[OH ] 3 + 3 H+ Phản ứng chung là: Fe2+ + l / 4 0 2 + 5/2 H 20 -» Fe[OH ] 3 + 3 H + Oxy hóa và lắng đọng sắt thường có sự liên hệ với nhau, vi sinh vật oxy hóa và lắng đọng săt bao gôm: vi khuân oxy hóa săt ưa axií

ự h io b a c iỉỉu s fe r r o o x ita n s , F e r r o b a c illu s

ferrooxitans, Ferrobacillus sulfooxiians, Sulfolobus, Leptospiriỉlus khuẩn sắt và nấm pH trung tính Peỉopỉoca,

Hyphomicrobium,

và

M etaỉỉogenium ] ,

[S id e r o c o c c u s , P ỉa n c to m y c e s , C a u ỉo c o c c tís , N a u m a h n ie ỉỉa ,

Peđomỉcrobium,

Xạ

khuẩn,

Ochrobium

tectum,

Sỉderrocapsa, Thiopedia, Cỉonothrix, Crenothrix, Pỉanktomyces, Galỉìoneỉla, Toxothrix, Achoỉeplasma, Popỉlaspora, Aureobaxitium, Cryptococcus, Conìothyrìium...]. G a ỉĩio n e ỉỉa fe r u g in e a

thuộc nhóm vi khuẩn sắt tự dưỡng hóa năng, trung tính, kỵ khí

bắt buộc hoặc vi hiếu khí, chỉ có thể dùng Fe2+ làm thể cung cấp electron. Chúng có thể thông qua chu trình Calvin để thu nhận CƠ 2 , hình thành nên những tảng ư ầm tích lớn hydroxìt sắt trong nước: 2

H 2 SO 4 + 3H20 + 2 Ca CO 3 + I/ 2 O 2 -> 2 Fe[OH ] 3 + 2 C aS 0 4 + 2 C 0 2 4

FeCƠ 3 + 6 H 2 O

+ O 2 —+ 4

F e [0 H ] 3 + 4 CƠ 2 + năng lượng

Do năng lượng thu được từ oxy hóa sắt 2 thành sắt 3 rất ít, vi khuẩn sắt [chi nhóm vi khuẩn oxy hỏa sắt

thành sắt 3] lại cần đến năng lượng đó để tổng hợp vật chất tế bào, cho

nên chúng cần oxy hóa rất nhiều sắt để duy ừ ỉ sự sổng. Khi vi khuẩn sát sống trong ống nước bằng gang,thường do nước mang tính axit nên hòa tan sắt thành sắt 2. Dưới tác dụng cùa vi khuẩn sắt, Fe2+ không ngừng chuyển thành Fe3+ [ri sắt], tích lũy tại trên thành ống, cuối cùng có thể dẫn đến việc ống nước bị tắc. Khai thác than béo và đồng tại những vùng mỏ lộ thiên, thường làm cho quặng sất vàng [FeS2] bộc lộ ra ngoài không khí, gặp

0 2

sẽ xẩy ra phản ứng oxy hóa chậm chạp, tạo

ra điều kiện axit, gọi là phản ứng khởi thủy. Ion sắt 2 , sản phẩm của phản ứng này, dưới tác dụng của vi khuẩn lưu huỳnh sẽ , oxy hóa sắt 2 thành sắt 3. Dưới điều kiện axit, sát 3 sẽ hòa tan và có thể phản ứng với quặng sắt vàng và oxy hóa quặng sắt vàng thành ion sắt

và ion sulfat. Ion sắt 2 hình thành lại bị vi khuẩn oxy hóa thành ion sắt 3 và lại phản ứng với quặng sắt, phản ứng oxy hóa này được tăng tốc, gọi là vòng tuần hoàn tăng trường [propagation cycle]. Do đó quặng sắt vàng sẽ bị oxy hỏa không ngừng, liên tục và nhanh chỏng. Đ ây là nội đung của quá trình thu hồi Fe và Cu ở các khu xỉ quặng hay ở các quặng nghèo. Do vi khuẩn oxy hỏa quặng sắt vàng cho nên khu mỏ này hay thải ra nước khoáng mang tính axit, gây ô nhiễm m ôi trường xung quanh. Vi khuẩn khử sắt 3 thành sắt 2 là phương thức chủ yếu để hòa tan sắt ưong thiên nhiên. Trong đầm chua, dầm lầy, vật trầm tích ờ các đáy hồ thiểu oxy, sắt 3 thường bị vi

571

khuẩn khử thành sắt 2. N hững vi khuẩn đó bao gồm m e g a te r ìu m , E s c h e r ic h ia

B a c illu s

coỉì,

m e s e n te r ic u s ,

B a c ittú

p o ỉy m y x a ,

B a c illu s

c ir c u ĩa n s ,

P seudom onas

B a c illu s

a e r u g in o s a ,

P r o t e u s v u l g a r i s , A c h r o m o b a c t e r i c h t h y o d e r m i s , S t a p h y l o c o c c u s ....

Ngoài việc khử sắt trực tiếp, một số vi sinh vật còn có thể nhờ việc sinh ra metylat và

s dưới điều kiện kỵ khí để khử sắt 3. C ơ chế khử sắt này hiện nay còn chưa rõ, nhưng đâ có một số nghiên cứu chứng tỏ, giảm pH và Eh của môi trường sẽ có lợi cho việc khử oxit sắt. N ăm 1975, học giả M ỹ R.P.Blakem ore phát hiện được xoắn khuẩn từ tính M a g n e to ta c tic s p ir illu m

từ bùn đáy biển Bắc Mỹ.

Vì đa số sắt tồn tại ừong các quặng rắn, rất khó tan trong nước, cho nên thường chỉ có sắt 2 mới được thực vật hấp thu. Vi sinh vật hấp thu và sử dụng sắt đôi lúc cũng trở thành nhân tố hạn chế đối với sự sinh trưởng của thực vật. 23.4.2.5. Vòng tuần hoàn M a n g a it [M n]

Càng ngày người ta càng chú ý đến vòng tuần hoàn m angan [Mn]

Hiếu khi

Hình 23.37: Vòng tuần hoàn Mangan [theo L.M.Prescoư và cộng sự].

Vòng tuần hoàn M n liên quan đến việc chuyển hóa ion M n2+ thành M nƠ 2 [tương đương với ion M n4+], quá trình này liên quan đến suối nước nóng, bùn nóng và là m ột phần quan trọng của việc thấm ướt đá [rock vARNishes]. Vai ữ ò chù yếu trong việc oxy hóa Mn2+ là các vi khuẩn

‘'Metaỉỉogenium

L e p to th r ix , A r th r o b a c te r , P e d o m ic r o b iu m

và m ột chi chưa biết rõ là

Vi khuần Shewaneỉỉa, Geobacter và các sinh vật đinh dưỡng hữu cơ hóa

năng có thể hỗ trợ việc hoàn thành quá trình khử M n 23.4.5.6. Vòng tuần hoàn photpho [P]

Phốtpho [P] là nguyên tố nhiều thử 10 của Trái đất, nguyên tử lượng là 30,975. H.Brand phát hiện ra p từ năm 1669. Năm 1688 B.Albinus phát hiện thấy p trong cơ thể thực vật; năm 1771 K.W .Schelle phát hiện thấy p ừong ữ o của bột xương và lần đầu tiên chứng thực sự tồn tại của chúng trong cơ thể sống. M ặc dù lượng p trong cơ thể chỉ vào khoảng 1%, nhưng do p là m ột thành phần của axit nucleic, của ATP, m etionin...cho nên chúng có chức năng quan trọng ừong các quá trĩnh dự trữ năng lượng, chuyển hóa lipit và trao đổi hydrat cacbon.. Trong thiên nhiên p tồn tại ở 4 trạng thái oxy hóa: -3, 0, +3, +5, bao gồm PH 3 [hóa trị -3], p nguyên tố [thường ở dạng

P4,

hóa ừ ị 0], axit pHotphorous và các đẫn xuất [H 3 PO 3 ,

H 2PO 3', H PO 32' hóa trị +3] ,axit photphoric và các dẫn xuất[H 3 PƠ 4 , H 2 PO 4 H PO 4 2' PO 4 3' hóa trị +5]. Trong tất cả hợp chất chứa p, chỉ có hóa trị +5 là ổn định, chúng hình thành các hợp chất tồn tại ừong thiên nhiên. Vòng tuần hoàn p thực chất là sự chuyển hóa lẫn nhau giữa các m uối photphat. Trong nông nghiệp, vì hàm lượng p trong đất không cao, p hình thành qua phân hủy nhờ vi sinh vật không đủ cung cấp, cho nên p Ưong đất thường trở thành yếu tổ hạn chế yêu cầu sinh trưởng của cây trồng. Photpho cỏ thể chia thành 3 loại: p vô cơ hòa tan, p vô cơ không tan v à p hữu cơ. Vi sinh vật chù yếu tham gia các quá trình tuần hoàn p nhờ hòa tan p hừu cơ, chuyển hóa p khó tan thành dạng hòa tan, và chuyển hóa p vô cơ thành p hữu cơ. Sự khoáng hóa của p hữu cơ là quá trình chuyển hóa từ p hữu cơ thành p vô cơ ở dạng hòa tan. Quá trình này chủ yếu xảy ra trong đất, cũng có trong nước. M ột số vi khuẩn và nấm cỏ thể sinh ra enzym phytaz làm hòa tan phytat [axit phytic] v à giải phóng ra axit photphoric... Thuộc về nhóm này có

A s p e r g illu s , P e n ic iỉlìu m , R h ừ o p u s ,

C u n n in g h a m ia ,

A r th r o b a c te r , S tr e p to m y c e s , B a c illu s ...

Axit phytic [phytat] + nước —* Inositol + 6 PO43'

573

H ìn h 2 3 .3 8 : V ò n g tu ầ n h o à n p h o t p h o [th e o J .G .B la c k ] .

Một số vi khuẩn và nấm có thể sinh ra nucleaz và nucleotitaz, trước tiên thủy phân axit nucleic thảnh núcleotit, rồi từ nucleotit giải phóng ra axit photphoric, như vi khuẩn B a c illu s m e g a te r iu m

var. p h o t p h a t ỉ u m ,

P s e u d o m o n a s ...

A xit nucleic. + Ĩ1H 2 O —►n N ucleotit —►N ucleosid —►P O 4 3'

Có một số vi khuẩn và nấm có thể sinh ra photphatidaz [photpholipaz], thủy phân photphatíd [photpholipite] thành axit béo, glycerin và axit photphoric, chẳng hạn như vi khuẩn

B a c illu s

cereus,

B a c illu s

m y c o id e s ,

B a c illu s

a s te r o s o p u s ...ĩìề

phân giải lecitin

[lecithine] vi sinh vật sinh ra enzym lecitinaz [lecithinaz]:

Lecitin + 3 H2O -* 2 axit béo + glycerin + colin [cholin] + PƠ43’ Trong quá trinh vi sinh vật phân giải p hữu cơ, một phần p dùng cho trao đổi chất của bản thân, phần còn lại được giải phỏng ra dưới dạng axit photphoric. K hi tỷ lệ

p hữu cơ < 200 sẽ. cỏ axit photphoric giải phóng ra, khi tỷ lệ sẽ bị vi sinh vật đồng hóa; khi tỷ lệ

c/p từ 200 -

c/p của

300 thỉ toàn bộ p

c/p > 300 thi axit photphorìc không nhừng bị tiêu dùng

hết, còn phải hấp th u thêm từ m ôi trưởng. N ếu việc bón phân hữu cơ có trị số c / p cao sẽ

dẫn đến việc cạnh ứanh giữa thực vật và vi sinh vật về nguồn thức ăn photpho.

574

Tính hòa tan ừong nước của

H 2PO 4"

H P O 4 2'

PƠ 4 3' giảm đần theo thứ tự. p trong

nhiều sinh cảnh tồn tại dưới dạng muối Ca, Fe, Li, AI không tan, do đó hạn chế việc hấp thu của thực vật và vi sinh vật. Tác dụng hữu hiệu hóa p chỉ nhờ thông qua tác đụng của các vi sinh vật hòa tan m uối photphat không tan. Có thể có

phương thức hòa tan sau đây:

- Sản sinh axit hữu cơ, thúc đẩy sự hòa tan p. Chẳng hạn như axit fulvoic và photphat sắt có thể hình thành nên phức chất ổn định, lảm giải phóng ra các photphat không tan. - Sàn sinh axỉt vô cơ, thúc đẩy p hòa tan. Vi sinh vật tự dưỡng có thể thông qua quá trinh nitrat hóa sinh ra axit nitric, thông qua quá ừình sulfat h óa sinh ra axit sulfuaic, làm thúc đẩy sự hữu hiệu hóa của p trong đất. - Vi sinh vật khi phân giải chất hữu cơ sẽ sinh ra nhiều CO 2 tan trong nước, làm hình thành ra HCO 3 ' và H 2 C 0

chúng làm xúc tiến sự phân hủy các khoáng thạch chứa p, xúc

tiến sự hòa tan của các photphat Ca, photphat Fe. - Trong điều kiện kỵ, vi sính vật có thể khử Fe3+ thành Fe2+, thúc đẩy việc giải phóng axit photphoric. Do vi sinh vật có khả năng đồng hóa p rất cao, cho nên phần lớn p hữu cơ trong đất nằm trong tế bào các vi sinh vật đất. Trong nước , khi có đủ p cũng sẽ dẫn đến sự sinh trưởng

quá m ức

của tảo.

M ặc dù photphat thường không bị khử bởi vi sinh vật, nhưng trong điều kiện kỵ khí, nếu thiếu sulphat, nitrat thì photphat vẫn có thể bị khử để làm chất nhận electron. PH 3 dễ bay hơi, không ồn định trong không khí, tuổi thọ trung bỉnh chi có 1 ngày, gặp oxy sẽ tự bổc cháy tạo ra ngọn lửa màu xanh lam. Ở gần các nghĩa địa và đầm lầy, có nhiều chất hữu cơ bị phân giải, có khi sinh ra khí PH3[ gặp oxy sẽ tự bốc cháy, sau đó lại đốt cháy cả khí m etan, dân ta thường gọi là hiện tượng “m a chơi” . H 3 P 0 4-> h 3 p o 3 - > h 3 p o 2 - > p h 3 Ngoài PH 3 ra p không tồn tại dưới dạng thể khí nào khác, cho nên tuần hoàn p thuộc dạng tuần hoàn trầm tích điển hình

[h ìn h 2 3 .3 5 ].

p chủ yếu tồn tại dưới 2 dạng: dạng nham

thạch và dạng m uối hòa tan. Thực vật và vi sinh vật chỉ có thể sử dụng p vô cơ hòa tan, chuyển hóạ chúng thành p hữu cơ và cung cấp cho động vật. Sau khi động thực vật chết, xác của chúng sẽ bị vi sinh vật phân giải, p quay trở lại đất. Photphat hòa tan trong đất bị nước m ưa rửa ừ ô i xuống sông, biển, được tảo và các loài thực vật thủy sinh hấp thu, hòa nhập vào chuỗi thức ăn. Khi thực vật thủy sinh chết đĩ, xác bị phân hủy, m ột lần nữa p hữu cơ lại chuyển hóa thành p vô cơ, m ột phần tiếp tục tham gia vòng tuần hoàn, phần còn lại trầm tích xuống đáy hình thành các mỏ photphat. Photphat bị phong hóa và bị loài người khai thác tại các nhà m áy sản xuất phân lân.

575

Do tuần hoàn p là vòng tuần hoàn không hoàn toàn, trầm tích nhiều xuống đáy biển, trừ những biến đổi địa chất nâng đáy biển thành đất liền, còn thì ít có cơ hội được giải phóng. Do ảnh hưởng của hoạt động không hợp lý của con người, như bón phân p quá m ức, thải ra nhiều nước bẩn chứa p, sẽ làm phá vỡ sự cân bàng giữa p tuần hoàn và p trầm tích, làm cho lượng p tham gia vào vòng tuần hoàn ngày m ột ít đi, vả trở thành m ột nhân tố hạn chế hoạt động sống trên Trái đất. 23.4.5.7. Các vòng tuần hoàn khác và m ối quan hệ với nhau

Vi sinh vật có thể dùng các loại kim loại khác làm chất nhận electron. Các kim loại như europium [Eu], tellurium [Te],selenium [Se] và rhodium [R h] đều có thể bị khử. Nhóm ví sinh vật chủ chốt có thể khử các kim loại này là các vi sinh vật tự dưỡng quang năng hữu cơ

[photoorganotroph],

R h o d o p seu d o m o n a s.

chẳng

hạn

như

R h o d o b a c te r ,

R h o d o s p ir iỉlu m

Đối với selenium đù có tác dụng m ạnh là các vi khuẩn

s tu tz e r i, T h a u e r a s e ỉe n a tis

và

W o ỉìn e ỉla s u c c in o g e n s .

và

P seudom onas

Các quá trình khử này sẽ làm giảm

bớt độc tính của kim loại Sự chuyển hóa photpho nhờ vi sinh vật trước hết là từ các dạng đơn giản chuyển thành các dạng phức tạp [hóa trị +5], bao gồm polyphotphat tìm thấy trong các hạt dị nhiễm sắc [m etachrom atic granules], M ột loại sản phẩm đặc biệt [có thể do vi sinh vật sinh ra] là photphin [P H 3] với hóa trị -3. Chất này được giải phóng ra từ đầm lầy, đất, hải dương và có thể cháy ừ o n g không k h í , có thể kèm theo sự cháy của metan. c ầ n nhấn mạnh là, chúng ta đã giới thiệu riêng rẽ chức năng tuần hoàn của s , p, Fe, M n nhưng ừong quá trinh trao đổi chất của đa sổ vi sinh vật thì chúng Hên hệ với nhau thông qua việc sử dụng chung các chất oxy hóa [oxydants] v à các chất khử [reductants]. Chẳng hạn, m ột số vi sinh vật khử sulfat có thể dùng H 2 hoặc chất hữu cơ để khử Fe3+ và cũng cỏ thể oxy hóa s nguyên tố khi có m ặt M n [IV ] làm chất nhận elecừon. Trong điều kiện kỵ khí, vi khuẩn Đ e s u ỉ/o b u lb u s p r o p ỉo n ic u s

chuyển M n [IV] thành sulfat tạo thành sự liên kết s và Mn

trong sự tuần hoàn kỵ khí. Gần đây B .Schinck và M. Friedrich đã m iêu tả m ột cặp năng lượng độc đáo. Họ đã phân lập được m ột loại vi khuẩn tự dưỡng vô cơ [lithoautotrophic]từ các ừầm tích kỵ khí có thể liên kết sự oxyhỏa phosphit [ P 0 35'] thành photphat [PO 4 3'] với việc khử sulfat thành H 2 S. Schinck và Friedrich cho rằng vòng tuần hoàn năng lượng này có thể đã phát huy tác đụng trong thời kỳ đầu của Trái đất.

Bảng 23.8: N h ữ n g v ỉ dụ về tác dạng tương h ỗ vi sinh vật-kim lo ạ i và n h ũ n g ảnh hưởng tương quan với vi sinh vật và các động vật m áu nóng

Tác dụng tương bỗ [interaction] và chuyển hóa [transform ation] Nbóro lảm ỉoại

Kim loại

Vi sinh vật

Đ ộng vật m áu nóng

Kim loại quý hiếm

Ag Au Pt

Vi sình vật cỏ thể khử ion kim loại thành dạng nguyên tố.Kim loại dạng ion mức thấp đua vào môi trường sẽ có hoạt tính kháng vi sinh vật

Nhiều loại trong số các kim loại này cỏ thể khử thành dạng nguyên tố và không đi qua được rào chấn máu-não. Việc khử Ag có thể dẫn đến lắng đọng bất hoạt trên da

Kim loại có thể hình thành liên kết Cacbon-Kim loại ổn định

Vi sinh vật có thể chuyển dạng vô cơ vả hữu cơ thành dạng metyl hóa, một số trong đỏ ở mức cao dinh dưỡng h ư ớ n g tớ i sự tích lũy sính học [bioaccumulate]

Một số hình thức metyl hỏa cùa kim ỉoại có thể xuyên qua rào chắn tnáu-não, gây nên các hiệu ứng lên hệ thần kinh hoặc gây tử vong

Trong dạng ion nồng độ cao các kim loại này có thê trực tiếp ức chế vi sinh vật.Chúng thường được s ử dụng làm nguyên tố vi lượng ở nồng độ rất thấp

Kim loại ở tnức độ caobị thanh lọc khỏi cơ thế các động vật bậc cao nhờ phàn ứng với protein huyết tương và các ca chế khác.Nhiều kim loại nà^ cũng được dùng làm nguyên to vi lượng ở nồng độ rất thấp.

Các kim loại khác

Hg Se

Cu Zn Co

23.4.5.8. V i sinh vệt và độc tính cũa kim loại

Ngoài các kim loại như Fe, M n ...đổi với vi sinh vật cơ bản là vô hại, còn hàng loạt các kim loại là có nhiều tác dụng độc hại khác nhau đối vởi vi sinh vật và các động vật máu nóng. Vi sinh vật có vai trò quan trọng trong việc làm biến đổi sự độc hại của các kim loại này. K im loại là m ột nhóm khá rộng, trong đó các

k im ỉo ạ i n ặ n g

không đi qua được rào

cản máu-não của các động vật m áu nóng nhưng lại có ảnh hưởng rất rõ rệt lên vi sinh vật. Vi sinh vật cũng cỏ thể khử dạng ion của kim loại thành dạng nguyên tổ. N hóm th ứ hai là cảc kim loại hay á kim [metalloids] m à vi sinh vật có thể m etyl hóa để chuyển thành các sản phẩm dễ di động hom - kim loại hữu cơ [organometals]. M ột sổ kim loại hừu cơ có thể xuyên qua rào cản máu-não vi vậy ảnh hưởng đến trung khu thần kinh của các động bật m áu nóng. K im loại hữu cơ chứa những dây nối cacbon - kim loại, đó là đặc trưng dễ nhặn biết của chúng

577

Hình 23.39; Vòng tuần hoàn thủy ngân [Hg] [theo.L.M.Prescott và cộng sự]. V òng tu ần hoàn thủy ngân [Hg] có ý nghĩa đặc biệt quan trọng. N ó có nhiều đặc trưng vể các kim loại được m etyl hóa. N hiều thế kỷ qua các hợp chất thủy ngân đã được ứng dụng rộng rãi ữ o n g công nghiệp, v ấ n đề này đã được Lew is C arroll đề cập đến trong cuốn A lice in th e W onderland. Lúc đó H g được dùng để định hình mũ, vi sinh vật đã làm m etyl hóa m ộ t số thủy ngân v à sinh ra độc hại hơn cho người sản xuất mũ. M ột lượng lớn H g được dùng trong công nghiệp đào thải xuống biển làm cho vịnh M inam ata ở tây-nam N hật B ản đã bị trúng độc ữ ên diện rộng. H g vô cơ lắng đọng trong bùn ở đáy vịnh bị vi khuẩn

D e s u ỉ/o v ỉb r io

metyl hóa. D ạng H g bị m etyl hóa có khả năng

bay hơi và tan trong lipit và làm cho nồng độ H g không ngừng tăng lên Ưong chuỗi thức ăn [thông qua quá trình

m ở r ộ n g s in h h ọ c -

biomagnification]. N gười ăn phải nguồn thực phẩm

sơ cấp [cả] sẽ bị rối loạn nghiêm trọng hệ thống thần kinh,Trong rất nhiều hồ nước ngọt ở Canada và m iền trung- bắc H oa K ỳ cũng xảy ra những tình trạng tương tự, ở đó rất nhiều xưởng bột giấy đ ã dùng các hợp chất H g để khống chế sự sinh trư ớng của vi sinh vật. Thậm chí hàng chục năm sau cá trong các hồ ở vùng h ạ lưu các xưởng b ộ t giấy này cũng không có thể dùng để ăn. N hỏm kim loại thứ ba tồn tại dưới dạng íon gây độc hại trực tiếp cho vi sinh vật v à các kim loại này có thể ảnh hưởng đến cả các sinh vật bậc cao.. Tuy nhiên, nếu không tiếp xúc trong thòi gian quá dài hoặc tiếp nhận quá nhiều thì protein huyết tương cỏ thể tác dụng vởì các ion này và giúp bài xuất khỏi cơ thể. Chỉ trong trưởng hợp vói liều lượng tương đối cao thì kim loại này m ới có thể gây chết người. V ới nồng độ thấp nhiều loại kim loại này được sử dụng như các nguyên tố v i luợng. Sự m ẫn cảm khác nhau của các sinh vật bậc cao và vi sinh vật đối với kim loại đ ã là cơ sở để tạo nên các

578

phương pháp phòng thổi [antiseptic] từ cách đây trên 150 năm. Tuy vi sinh vật dễ phát sinh sức đê kháng với các kim loại nặng nhưng trong m ột số ứng dụng y học người ta nhận thấy dùng có lợi hcm so với dùng chất kháng sinh, ví dụ như dùng hợp chất của bạc chống vi sinh vật đê chữa trị các vết thương, hay dùng trong các ống dò [catheters]. 23.5. TÁ C DỤNG T Ư Ơ N G H Õ CỦA V I SIN H V Ậ T V Ở I C Á C C H Á T GÂ Y Ô N H IẺ M M Ô I T R Ư Ờ N G

23.5.1. Hiệu ứng sinh thái học của các chất gây ô nhiễm Có thể lấy tình hình ở Trung Quốc để làm ví dụ. Theo uớc tính của các chuyên gia, những tổn thất hàng năm của Trung Quốc do ô nhiễm môi trường gây ra đạt tới 283 tỷ nhân dân tệ [NDT]. Chỉ tính riêng ô nhiễm nước cũng đã gây ra tổn thất tới 50 tỷ NDT. Theo “N hật báo Phương Đông” [Hong Kong] thì từ thập niên 60 của thể kỷ trước đến nay, trong 432 con sông lớn nhỏ có đặt hệ thống giám sát môi trường của Trung Quốc thì có tới 80% đã bị ô nhiễm ở các mức độ khác nhau, trong đó những đọan sông lớn chảy qua các đô thị chiểm 20%, các sông nhánh bị ô nhiễm chiếm 60%. Trong 2800 hồ ở TQ, nơi nào nhận nuớc thài đô thị, đa số đều xuất hiện hiệii tượng vượt m ức dinh dưỡng. Do khai thác quá mức nước ngầm, khu vực Bắc Kinh - Thiên Tân xuất hiện lún sụt tới 1,5-2,0 m trên diện tích lớn. Nước ngầm ở độ sâu 38 m ừong vùng địa hình dung nham thuộc Quế Lâm, kim loại nặng đã vượt chi tiêu tới 10-20 lần. Tổn thất do ô nhiễm khí quyển tạo ra ước tới khoảng 20 tỷ NDT. Do đốt than, do khí thải công nghiệp và do khí thải xe hơi từ các đô thị mà các khí SƠ 2 , c o . .. trong không khí và các hạt nhỏ huyền phù độc hại đẩ bao phủ kín bầu trời các đô thị. Ô nhiễm không khí đã gây ra tỷ lệ chết do ung thư phổi ở nhiều thành phố đã tăng đến 0,02% , vùng bao phủ m ưa axit trong toàn quốc đã tăng lên đến 30%. Tất cả những tổn thất đó cộng lại đạt tới 20 tỷ NDT. N hững tổn thất đo phá hoại m ôi trường sinh thái tự nhiên ước tính đạt tới 200 tỷ NDT. Tỷ lệ che phủ rừng năm 1949 là vào khoảng 30%, nhưng tới năm 2004 chỉ còn không tới 10% Thảo nguyên cũng bị thoái hóa nghiêm ừọng, diện tích bị sói m òn tăng lên tói 155

104 km2, chiếm 16% diện tích cả nước. Từ thế

kỷ 19 đến nay, m ức độ công nghiệp hóa ngày càng tăng, làm cho hàm lượng chất ô nhiễm hữu cơ công nghiệp trong mồi trường đẵ tăng lên vượt bậc. Con người đã thải ra một khối lượng lớn các chất thải công nghiệp hóa học, thuốc in nhuộm , cũng như chất thải của các sản phẩm công nghiệp đưa vào môi trường, như thuốc trừ sâu, dung môi, chất dẻo, dược phẩm. Do những chất thải đó có thành phần phức tạp, độc hại với người và các sinh vật khác, lượng chất thải lại lớn và trên diện tích rộng cho nên là loại chất ô nhiễm hữu cơ có tác hại nghiêm ừọng nhất đối với môi trường.

579

2 3 .5 .1 .1 . H i ệ u ứ n g s ì n h t h á i c ủ a c á c c h ẩ t ô n h i ễ m h ữ u c ơ n h ă n tạ o

Hợp chất hữu cơ tổng hợp bao gồm các chất hữu cơ đễ bay hơi [V O Cs], các chất hữu cơ không bay hơi [NVOCs], các sản phẩm phụ tiêu độc[DBPs], các hydrocacbon thơm đa vòng [PAH S] . .. Chất hữu cơ tổng hợp bao gồm tới trên 60.000 loại khác nhau. Chất hữu cơ tổng hợp nhân tạo, đa số là độc hại, trong đó VOCs là nguy hiển nhất, vì khi tiếp xúc với nước chứa V O C s , các chất nảy có thể thấm qua da, càng độc hại hơn khi người tắm ở những nơi có các chất này. Ở H oa Kỳ các chất hữu cơ tổng hợp bị liệt kê vào danh sách các chất gây ô nhiễm cao nhất bị hạn chế sử đụng gồm những chất gây ung thư chủ yếu sau đây: -

T r ih a ỉo m e ta n

[THM ], sinh ra bcá phản ứng giữa chất hữu cơ và Clo dư thừa trong

nước, yêu cầu hàm lượng không được vượt qua 0,1 mg/L. -

T e tr a c h lo r o c a c b o n ,

tồn tại trong các chất tẩy rửa dầu công nghiệp, trong các dung

môi làm lạnh, trong ngành hun sấy, yêu cầu hàm lượng không được vượt quá 0,005 rag/L. -

B enzen,

có m ặt trong chất tẩy rửa, dung m ôi hữu cơ, yêu càu hàm lượng không

được vượt quá 0,05 mg/L. -

T r ic ỉo r o e ta n ,

tồn tại trong các chất tẩy rửa dầu, dung m ôi hữu cơ, thuốc trừ sâu, yêu

cầu hàm lượng không được vượt quá 0,002mg/L. quá

C ỉo r o e ta n ,

0 ,0 0 2

dùng trong việc chê tạo cao su nhân tạo, yêu cầu hàm lượng không vượt

mg/L.

D ib r o m o e ta n

[EDB], dùng làm chất phụ gia xăng dầu, thuốc trừ sâu, yêu cầu hàm

lượng không được vượt quá 0,005 mg/L. -

D ib r o m o c ỉo r o p r o p a n

[DBCP], dùng trong nông nghiệp, gây vô sinh và ung thư,

yêu cầu hàm lượng không được vượt quá

0 ,0 0 2

mg/L.

23.5.1.2. H iệ u ử ng sinh th á i của thuốc B V T V đ ổ i với m ô i trư ờ ng

Thuốc bảo vệ thực vật [B V TV ] hay còn gọi là nông được rất cần cho sự phát triển nông nghiệp hiện đại. Thuốc B V TV thông qua nhiều con đường đi vào đất, làm ô nhiễm môi trường đất ngày càng nghiêm trọng. Tuy nhiên, do tác dụng tự làm sạch của đất [như bay hơi, khuếch tán, pha loãng, hấp phụ, phân giải] m à có thể giảm bớt m ức độ ô nhiễm. Nhưng nểu thuốc B V TV đi vào đẩt với số lượng v à tốc độ vượt quá khả năng tự làm sạch cùa đất, tức vượt quá dung lượng m ôi trường của đất thổ nhưỡng, thỉ sẽ d ẫn đển việc đất bị ô nhiễm thuốc. Thuốc B V TV hằng năm ở Trung Q uốc đùng tới 500 nghìn tấn, thuốc trừ sâu chiếm 70% , trong đó thuốc trìr sâu là lân hữu cơ có độc tính cao chiếm tới trên 70% trong số các loại thuốc trừ sâu. Sự ô nhiễm thuốc B V TV của đất không những làm thay đổi chức năng và kết cấu bình thường của đất, m à còn làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và

phát triển của thực vật, từ đỏ qua chuỗi thức ãn mà ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe con người. Trong nông nghiệp sử đụng nhiều thuốc trừ sâu và thuốc trừ bệnh không những làm ô nhiễm nông phẩm m à còn làm ô nhiễm nghiêm trọng m ôi trường. Ví dụ chim ăn những nông phẩm bị ô nhiễm thì tỷ lệ đẻ trứng sẽ giảm, vỏ trứng mỏng đi, nếu nghiêm trọng có thể dẫn đến tuyệt chủng. Nhiều loại thuốc trừ sâu, trừ bệnh không những gây ra hiệu ứng cấp tính gây chết người, còn sinh ra những tai biển lâu dài như gây ung thư, gây dị dạng, gây đột biến gen... 23.5.1.3. H iệ u ứng sinh th á i của dầu mỏ đối vởi m ô i truớ ng

Các chất dầu mỏ khi xâm nhập vào môi trường, do những cơ chế sinh học và phi sinh học [chủ yếu là oxy hóa quang hóa học], dần dần được phân hủy. N hiều nghiên cứu chứng tỏ, trong các yếu tố làm sạch ô nhiễm dầu mỏ trong thiên nhiên, thì vi sinh vật cùng đóng vai ừ ò quan trọng. Vùng tưới tiêu Thẩm Dương-Phủ Thuận ờ Trung Quốc có trên 13.333 ha ruộng lúa, suốt 40 năm qua chủ yếu tưới bằng nước thải của xưởng lọc dầu chứa dầu mỏ, nhưng vẫn chưa phát hiện thấy có lượng dầu tích lũy và những tác hại cụ thề. N guyên nhân chủ yếu do tác dụng phân giải của hệ sinh thái vi sinh vật trong vùng tưới tiêu đã bị ô nhiễm dầu mỏ. M ặt biển bị ô nhiễm dầu mỏ [nhu tai nạn võ tàu chứa dầu, rò ri d ầ u . ..] cũng gây ô nhiễm dầu mỏ. Ổ nhiễm dầu mỏ đều gây nguy hại cho môi trường, và cần tiến hành các biện pháp phân giải sinh học. Dầu m ỏ là m ột hỗn hợp phức tạp gồm khỏang 200-300 loại hợp chất, gồm các hydrocacbon mạch thẳng, mạch vòng, mạch thơm và những hợp chất phi hydrocacbon. Tính chất phân hủy sinh học của dầu mỏ tùy thuộc vào chùng loại và kích cỡ phân tử hydrocacbon của chúng. Chuỗi n-alkane có độ dài trung bình [C | 0~C

24]

dề bị phân hủy

nhất, hydrocacbon m ạch ngắn đối với nhiều vi sinh vật là độc hại, nhưng lại đễ bay hơi. Hydrocacbon m ạch càng dài, tính đề kháng sinh học càng tăng,

về loại hỉnh hydrocacbon,

mạch thẳng dễ phân hủy hơn mạch vòng; hyđrocacbon không no dễ phân hủy hơn hydrocacbon no; m ạch thẳng dễ hơn mạch phân nhánh; phân nhánh càng nhiều.vi sinh vật càng khỏ phân hủy, cuổi chuỗi có nguyên tử cacbon bậc 4 thi lại càng khỏ khăn hơn; hydrocacbon thơm m ạch vòng rất khó hoặc không thể phân hủy được. 23.5.1.4. H iệ u ứng sinh th á i của các chất ô nhiễm hữ u cơ tro n g nước

N ước thải sinh hoạt thành thị và nưởc thải của các nhà m áy dùng chất hữu cơ làm nguyên liệu thường chứa rất nhiều chất hữu cơ cao phân tử là thành phần của sinh vật cũng như các sản phẩm trao đổi chất trung gian, đỏ là hydratcacbon, protein, lipit, axit amin, axit béo v .v .. .N hững chất này tuy không độc nhưng dễ được vi sinh vật phân hủy hơn, cũng do

đỏ tiêu hao nhiều oxy hòa tan trong nưởc gây nguy hại tới môi trường.

581

Ô nhiễm phenol trong nước chủ yếu là từ các nguồn nước thải chứa phenol, chẳng hạn từ xưởng luyện than cốc, xưởng khí than, xưởng lọc dầu, xường chưng cất gồ, xưởng nhựa tổng hợp, xưởng tổng hợp xenluloz, xưởng sản xuất các loại như thuốc nhuộm, dược phẩm, hương liệu, thuốc BVTV, sợi thủy tinh, sơn, chất diệt khuẩn, thuốc thử hóa học... Phenol là chất ô nhiễm gây độc nhưng độc tính tưong đối thấp. Hợp chat phenol gây độc cho cá, nếu trong thịt cá có mùi kerozn là hậu quả của việc nhiễm độc phenol. ô nhiễm dầu m ỏ nguy hại đến chất lượng nước cũng như sinh vật thủy sinh. Dầu nổi trên m ặt nước có thể lan tỏa nhanh chóng, hình thành váng dầu, làm ngăn cản mặt nước tiếp xúc với không khí, ỉàm giảm oxy hòa tan. Dầu m ỏ chứa chất gây ung th ư hydrocacbon thơm đa vòng [polycyclic aromatic hydrocacbon], tích tụ qua cơ thể sinh vật thủy sinh rồi ảnh hưởng tới sức khỏe con người. 2 3 .5 ,1 .5 , H i ệ u ứ n g s i n h t h á i c ủ a c á c c h ấ t ô n h i ễ m t h ể r ắ n

Các chất ô nhiễm thể rắn tùy nhu cầu khác nhau, trường hợp khác nhau, ở những nước khác nhau, m à m ang những ý nghĩa khác nhau. N ói chung đó là các rác thải rắn hay thể bùn sàn sinh tò những hoạt động sản xuất, lưu thông và tiêu thụ trong xã hội, không còn có giá trị sử dụng và bị loại thải. Chất thải rắn có thể là rác thải thành thị, rác thải công nghiệp và rác thải nông nghiệp, N hững chất này vừa là rác thải, nhưng cũng có thể là nguồn tài nguyên có thể khai thác. Chất thải rắn có những đặc tính sau đây: - Tính vô chủ: sau khi bị loại thải, không còn thuộc về ai, đặc biệt là đối với rác thải thành thị. - Tính phàn tán: sau khi bị vứt bỏ sẽ nằm rải rắc nhiều ncâ, cần phải thu gom lại. - Tính nguy hại: gây bất lợi cho sản xuất và cho sinh hoạt v à gây nguy hại đến sức

khỏe con người. - Tính hai m ặt, rác thải độc hại có thể x ử lý để trở thành những nguồn tài nguyên quý giá. Chất thài nguy hại đến m ôi trường liên quan đến tính chất và sổ lượng. N ấu ở mức nhât định sẽ không gây nguy hại tới m ôi trường, ở nông thôn trên khắp thế giới người ta tiến hành ủ phân các chất thải hữu cơ, không gây ra bất cứ vấn đề m ôi trường nào. Khi chất thài rắn tích tụ đến m ức độ nhất định sẽ sinh ra ô nhiễm m ôi trường. N goài yếu tố số lượng, tính chất của chất thải rắn cũng quyết định m ức độ nguy hại của chúng. Rác xây đựng là chất thải không độc hại, dù lượng có lớn, cũng khồng gây ô nhiễm và nguy hại đến m ôi tnrờng. Pin, đèn ống h ỏ n g ... đù lượng không lớn, nếu vứ t tùy tiện, sẽ gây ô nhiễm nghiêm trọng và nguy hại đến m ôi trường. D o đó, khi x ử lý chất thải rắn, phải nắm vững về sô lượng và m ức độ cần xử lý. N hấn mạnh quá m ức độc tính và số lượng chất thải rắn sỗ

làm tăng giá thành xử lý và ảnh hưởng đến khả năng khống chế ô nhiễm môi trường. Trên thực tế mức độ khống chế ô nhiễm rác thải rắn liên quan mật thiết đến trình độ phát triển kinh tế của đất nước cững như mức sống của dân chúng. N hiều chất thải rắn là những chất thải cỏ hại, nếu xử lý không thỏa đáng, những hóa chẩt độc hại và vi sinh vật gây bệnh trong đó có thể thông qua vòng tuần hoàn vật chất và nước ngầm m à đi vào hệ sinh thái nhân loại,làm gây hại đến cơ thể người, đồng thời phá hoại môi trường sinh thái, dẫn đến những sự thay đổi sinh thái khó có thể đảo ngược. Một số chất gây ô nhiễm có thể bay vào khí quyển, một số khác nhiều hơn xâm nhập qua tiếp xúc, ăn uống , qua nguồn nước bị ô nhiễm m à đi vào cơ thể người.

23.5.2. Tác dụng tương hỗ giữa vỉ sinh vật và chất gây ô nhiễm môi trường Trong điều kiện thiên nhiên, sự phân hủy chất ô nhiễm cùa vi sinh vật có 2 phương thức: một là trực tiếp sử dụng chất đó làm cơ chất sinh trưởng, khi phân hủy chất đó sẽ thu được năng lượng và các nguyên liệu tự thay thế để duy trì sự sổng. Đổi với quá trình trao đổi chất của vi sinh vật chì nhằm mục đích thu được năng lượng và ảnh hưởng của môi trường đối với con đường, sản phẩm cuối cùng, tốc độ của quá trinh đỏ, hiện đã có nhiều hiểu biết sâu sắc. Đ ã có những ứng dụng rộng rãi trong việc xử lý sinh học các chất gây ô nhiễm. Trong thiên nhiên các chất gây ô nhiễm chịu các tác dụng vật lý, quang hóa, hóa học, sinh học để phân hủy và chuyển hóa, Có những chất chuyển hóa nhanh, có những chất chuyển hóa rất chậm. Có những hạt thóc vẫn còn tồn tại trong các K im tự tháp Ai Cập tới mấy nghìn năm. Đó là do điều kiện môi trường tổi tăm, khô ráo, không thích hợp để cho vi sinh vật phát triển, do đó tốc độ phân hủy cực chậm. Nhiều nghiên cứu chứng tỏ, trong nước và đất, tác dụng sinh học là cơ chế phân hủy chính, m à vỉ sinh vật lại đỏng vai trò hàng đầu ứ o n g phân hủy sinh học. Nếu dùng đúng cách để loại bỏ, khống chế hoặc giảm thiểu hoạt tính của vi sinh vật thì tốc độ phân hủy, chuyển hóa vật chất sẽ chậm đi rất nhiều. N gược lại, nếu tạo môi trường thích hợp cho vi sinh vật phát triển sẽ xúc tiến nhanh chóng quá trình phân hủy và chuyển hóa các chất gây ô nhiễm. 23.5.2.1. Tiềm lực to lớn phẫn hủy các chất gây ô nhiễm của v i sinh vật bắt nguồn từ đ ặ c đ iể m c ủ a c h ú n g - V i s i n h v ậ t c ó t h ể [íc h n h ỏ , b ề m ộ t lở n , tố c đ ộ tr a o đ ổ i c h ấ t n h a n h :

Lấy vi khuẩn làm ví dụ, nếu xểp được 3000 trực khuẩn nối tiếp nhau m ới có được chiều đài của 1 hạt gạo.Phải có 2 nghln tỷ vi khuẩn mới có bình quân lg.V ới thể tích vật thể càng nhỏ, diện tích bề mặt của tất cả các đơn vị càng lớn. Rõ ràng, diện tích bề mặt của quần thể vi sinh vật lớn hơn rất nhiều so với bất kỳ loài sinh vật khác.

583

V i s i n h v ậ t c ó c h ủ n g l o ợ i n h iề u , p h ầ n b ổ r ộ n g k h ắ p , lo ạ i h ì n h t r a o đ ổ i c h ấ t ỉạ i rẩ t

đa dạng:

N hờ có các loại hình trao đổi chất cực kỳ đa dạng, làm cho hầu hết các chất hữu cơ trong thiên nhiên đều bị vi sinh vật phân hủy. Cho đến nay chúng ta đã biết có đến vài trăm ngàn chất gây ô nhiễm m ôi trường, trong đó đa số là các chất hữu cơ. Tất cả các chất gây ô nhiễm hữu cơ, có thể chia thành 3 loại: loại có thể phân hủy sinh học, loại khó phân hùy sinh học và loại không có thể phân hủy sinh học. Có thể nói, hầu hết các chất hữu cơ tồn tại trong thiên nhiên đều có thể bị vi sinh vật phân hủy. Có những loài vi khuẩn như P se u d o m o n a s c e p a c ia

có thể phân hủy trên 90 loại chất hữu cơ khác nhau, chúng có thể sử

dụng bất kỳ m ột trong những chất đó làm nguồn cacbon và năng lượng duy nhất để tiến hành trao đổi chất. M ột ví dụ khác, metyl thủy ngân rất độc với sinh vật, nhưng chủng vi khuẩn

các

P seu d o m o n a s

K62 lại có thể phân hủy và chuyển hóa thành Hg nguyên tổ.

- Nhờ có năng lực biến dị mạnh, nên nhiều Ví' sinh vật cổ khả năng phân hủy được c h ấ t hữu c ơ c a o p h â n t ử t ổ n g h ợ p nhân t ạ o . Hơn nửa thế kỳ nay, chất hữu cơ tổng hợp nhân tạo ồ ạt ra đời, đó là các thuốc trừ

sâu, thuổc trừ cỏ, chẩt tẩy rửa, chất tạo dẻo.. .M ột trong những m ục đích ban đầu khi sáng chế ra những chất đó là đòi hỏi phải có tính ổn định cao. Bởi vậy khi vi sinh vật tiếp xúc vói những chất đó, lúc đầu không phân hủy được là dễ hiểu. Do vi sinh vật có các loại hình trao đổi chất cực kỳ đa dạng và có năng lực biến dị m ạnh, cho nên đã phát hiện thấy những vi sinh vật có thể phân hủy được nhiều loại chất hữu cơ tổng hợp nhân tạo, thậm chí cả những chất mà trước đây cho là không thể phân hủy được.Từ các chủng biến đị có thể chọn ra được những chủng có khả năng phân hủy cao các chất gây ô nhiễm , và có thể sử dụng nguyên lý đỏ để thuần hóa định hướng, nhằm chọn ra những chủng vi sinh vật có hiệu suất phân hủy cao các chất gây ô nhiễm vốn khó hoặc không phân hùy được. -

V i s i n h v ậ t c ổ h ệ t h ố n g đ i ề u c h ỉ n h c á c e n z y m p h â n h ủ y v à n ă n g l ự c p h â n h ủ y g ọ i là

P ỉa s m id

Vi sinh vật tổng hợp ra các enzym m en phân hủy, các enzym này vừa m ang tính đặc hiệu, lại vừ a có tính chuyển đổi. Vi sinh vật có thể linh hoạt thay đổi con đường điều khiển và trao đổi chất cùa chúng, cùng m ột lúc cỏ thể sinh ra các loại enzym khác nhau để thích nghi với những m ôi trường khác nhau, giúp phân hùy và chuyển hóa các chất gây ô nhiễm trong m ôi trường. Plasm id là phân tử A D N dạng vòng trong tế bào vi khuẩn, là vật ehất di

truyền ngoài nhiễm sắc thể. Plasmid phân hủy ma hóa cho cổc gen cỏ thể giúp vi khuẩn tạo ra các enzym chủ chổt trong quá trình phân hủy sinh học. Plasm id đề kháng giúp vi khuẩn đề kháng được với nhiều chất kháng sinh và hóa chất độc hại như thuổc trừ sâu, kim loại nặng. Sự hiện diện của plasm id không ảnh hưởng đến sự sinh trựởng, p h át triển của tế bào chủ, nhưng khi gặp độc chẩt, plasm id bằng sản phẩm enzym của m ình sỗ m ang lại nhiều ưu

thể lựa chọn cho tế bào chủ. Bằng công nghệ gen, có thể chuyển plasm id giữa các tế bào khac loài, những tế bào tiếp nhận plasmid sẽ đồng thời nhận được những tính trạng do plasmid đó mang lại. Nhiều nghiên cứu cho biết, sự phân hủy sinh học đối với nhiều hợp chất độc, nhất là các loại hydrocacbon thơm phức tạp, đều có sự tham gia của plasmid. Việc di chuyển plasmid có tính chất phân hủy khác nhau từ tế bào cho sang tể bào nhận, có thể tạo nên những vi khuẩn chứa nhiều plasmid, có thể tham gia xử lý đồng thời xử lý nhiều thành phần trong nước thải và chất thải rắn. 23.5.2.2. S ự trao đỗi chất chung của vi sinh vật giúp m ở rộng phạm v i tác dụng đ ố i với cá c c h ẩ t ô n h iễ m h ữ u c ơ k h ỏ p h â n h ủ y

Sự trao đổi chất chung là một hình thức tác dụng khác của vỉ sinh vật đối với chất hữu cơ. Trao đổi chất chung của vi sinh vật được nêu lên sớm nhất từ năm 1959 bời Leadbeter và Foster. Họ phát hiện hiện thấy vi khuẩn metan

[ P s e u d o m o n a s m e ta n ỉc a ]

có

thể oxy hóa etan [ethane, CH 3 CH 3 ] thành etanol, acetalđehid nhưng lại không sử dụng được etanol làm cơ chất để sinh trưởng. Hai ông đã gọi hiện tượng này là sự oxy hóa chung, với định nghĩa là khi tồn tại cơ chất sinh trưởng, vi sinh vật oxy hóa những chất không phải cơ chất sinh trưởng, có nghĩa là vi thuẩn metan đã sừ dụng những cơ chất sinh trưởng dễ phân hủy ngoài etan để làm nguồn c và nguồn năng lượng. Trong quá trình sinh trưởng chúng đã sinh ra những enzym không đặc hiệu, vừa có thề oxy hóa cơ chất sinh trường, vừa có thể oxy hóa etan. Etan không phải là cơ chất sinh trưởng, nhưng dưới tác dụng của oxydaz không đặc hiệu đã bị oxy hóa thành etanol và acetaldehid. Quá trinh oxy hóa chung của etan không tách rời được với những enzym chủ chốt không đặc hiệu do vi khuẩn m etan sinh ra, nhưng lại không thể cung cấp cho vi khuẩn metan năng lượng cần thiểt để duy trì sư sống và nguyên liệu cần thiết cho trao đổi chất, v ề sau Jensen đã mở rộng nội dung này và đề ra khái niệm

tr a o đ ổ i c h ấ t c h u n g .

Ông cho rằng, khi tồn tại những

cơ chất sinh trưởng, hoạt tính của vi sinh vật sẽ tăng cường, sự phân hủy của vi sinh vật đối với những chất không phải cơ chất sinh trưởng, không kể là oxy hóa hay khử, đều là tác dụng trao đổi chất chung. Trao đổi chất chung không những chi sự phát triển cùa tế bào khi có mặt cơ chất sinh trường, đổi với các chất không phải cơ chất sinh trường, m à còn bao gồm sự chuyển hóa của vi sinh vật ờ trạng thái hô hấp nội nguồn khi cơ chất sinh trường bị tiêu hao hểt đối với các chất không phải cơ chất sinh trưởng. Trao đổi chất chung của vi sinh vật có thể tồn tại trong những tình huống như sau: - N hờ phân hủy các chất hữu cơ khác m à thu được năng lượng v à nguồn c.

- Thông qua việc hợp tác với vi sinh vật khác mà tạo ra sự trao đổi chất chung, thực hiện việc phân hủy các chất gây ô nhiễm.

585

- N hờ sự tổng hợp cảm ứng do các chất làm sinh ra hệ enzym tương ứng, sinh ra tác dụng trao đổi chất chung. Sự tồn tại của ưao đổi chất chung đã tăng cường mạnh m ẽ khả năng phân hủy sinh học đối với các chất khỏ phân hủy. V í dụ, m ột số thuốc trừ sâu khó phân hủy, không giúp ích gì cho sự sinh trưởng của vi sinh vật, nhưng thông qua trao đổi chất chung của nhiều nhóm vi sinh vật m à có thể phân giải từng phần hoặc toàn bộ thuốc trừ sâu đó. Chẳng hạn sự trao đổi chất chung giữa các vi khuẩn

và

A e r o b a c te r a e r o g e n s

H ydroom eonas

sp. giúp

chuyển hóa D D T thành sản phẩm trung gian rồi bị phân hủy tiếp bởi các vi sinh vật khác. Điều đó cho thấy trong thiên nhiên quá trình ừao đổi chất chung có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong quá trình phân hủy các chất khó phân hủy. N hững vi sinh vật đã được phát hiện thấy có quá t ì n h trao đổi chất chung gồm có: sp.,

A c h r o m o b a c te r

A r th r o b a c te r

B a c illu s m e g a te r iu m , B a c illu s

sp.,

M ic r o c o c u s

N o c a r d ia

sp.,

P seu d o m o n a s

c e r ific a n s ,

sp,,

sp.,

B r e v ỉb a c te r iu m

M ic r o c o c c u s ,

P s e u d o m o n a s flu o r e s c e n s ,

sp.,

n ìg e r ,

A s p e r g illu s

sp.,

ch ro o cco cu m ,

sp.,

H yd ro o m eo n a s

F la v o b a c te r iu m

M ic r o b a c te r iu m P e n e c iỉìu m

T r ic h o d e r m a v ìr iđ e , V ib r io

A z o to b a c te r

sp.,

N o c a r d ia

m e ta n ìc a ,

sp., X a n t h o m

onas

e r y th r o p o lis ,

P seu d o m o n a s

p u d ita ,

sp,.

Sự trao đổi chất chung không những nêu lên m ột vấn đề mới về cơ chế oxy hóa sinh học mà còn được coi như m ột kỹ thuật sinh hóa được ứng dụng trong việc phân hủy sinh học các chất thải thuộc nhóm hợp chất thơm . Hanne, Jaakko, W oods, M ary ... đa sử dụng nguyên lý trao đổi chất chung tồn tại trong nồi phản ứng kỵ khí, thông qua việc thêm nhừng cơ chất sơ cấp để xử lý nước thải chứa clorophenol, giúp loại bỏ được chất độc khỏ . phân hủy này. 23.5.2.3. Tác dụng p h â n h ủy sinh hỏa học n h ờ vì sinh vật

Phân hủy sinh học là sự phân hủy chất gây ô nhiễm bàng sinh vật, m à trong đó vi sinh vật đóng vai ừ ò ỉớn nhất, cho nên còn có thể gọi là phân hủy vi sinh vật. Vi sinh vật thông qua hoạt động ừao đổi chất của m ình để thể hiện tác dụng phân hủy sinh hóa học trong m ôi trường qua các m ặt sau đây: a - Q u á tr ìn h o x y h ó a :

- Oxy hóa rượu: — C H 2 OH —►CH 3 CH 2 O H [etanoỉ] —►CH 3 COOH [axit axetic]. Â r th o b a c te r

oxydans

thì tiến hành phản ứng CH 3 CH 2 O H CH 2 OH [propanediol] —»

CH 3 CHOH COO H [axit lactic] - Oxy hóa alđehit: như C H 3 CHO [acetalđehit] —> CH 3 C O O H [axit axetíc]; tiến hành bởi

P s e u d o m o n a s a e r u g in o s a .

- Oxy hóa gốc m etyl: như C 6 H 5 CH 3 [toluen] —►C 6 H 5C O O H [axit benzoic]; tiến hành bởi

586

P s e u d o m o n a s a e r u g in o s a .

- Oxy hóa amon: nhu am on [NH3‘] —>N itrit [NO 2 ]; do

N itr o x o m o n a s

- Oxy hóa axit nitrit: N itrit [ N 0 2 ] -> N itrat [NO 3 "]; do - Oxy hóa lưu huỳnh: Lưu huỳnh [ S] —►Sulfat [SO 4 "]; do

tiến hành.

N ìtr o b a c te r

tiến hành.

T h ìo b a c iỉlu s th ìo o x ìta n s

tiến hành - Oxy hóa sắt: Fe 2 +—»Fe3+ ; đo

T h ìo b a c ỉỉìu s fe r r o o x ita n s

tiến hành.

b- Quá trình khử: - Khử gốc eten [ethene.etylen]: —CH—CH— *—CH 2—CH 2—, nhu axit fumaric —►axit succinic, do

E s c h e r ic h ia c o ỉi

tiến hành.

- K hử rượu: =CH—OH— —> =C ỈÍ 2 như CH 3 CHOHCOOH [axit lactic] —> CH 3 CH 2 COOH -

[axit

propionic],

đo

C lo s tr id iu m

p r o p io n ỉc u m

tiến

hành.

K hử nitrat:N itrat [NOa]—>amon [NH 3 ]; nhiều vi sinh vật đất có thể tiến hành phản

ứng này. - K hử sulfat: H 2 SO 4 —

; do vi khuẩn

D e s u ỉ/o v ib r io

tiến hành.

—CH 2—COOH —*■CH 3 , như quá trình

c - Q u ả tr ìn h k h ử c a r b o x y l [d e c a r b o x y la tio n ]:

khử carboxyl trong axit succinic —» axit propionic.

d e s u lju a ic a n s

P r o p io n ìb a c te r iu m p e n to s a c e u m

có thể

tiến hành phản ứng decarboxyl đối với axit succinic. d - Q u á tr ìn h k h ử a m in [d e a m in a tio n ]:

\=CH—NH 2 —

\=CH 2 +N H 3 , như khử alanin

dưới tác dụng của B a c i ỉ ỉ u s p u t r i f i c u s có thể khử amin để thành axit propionic. e - Q u á tr ìn h th ủ y p h â n :

nhu thủy phân các este, nhiều vi sinh vật đất tiến hành phản

ứng này. /-

Q u ả tr ìn h e s te h ỏ a :

axit carbocynic với alcool xẩy ra phản ứng este hỏa: R—COOH

+ R*—OH —►R—COOR" + H 2 o , như nấm men

H a n e n u ỉa a n o m a ỉa

có thể chuyển biến axit

lactic thành este ỉactat. g-

Q u ả tr ìn h m ẩ í n ư ớ c :

thành acrolein, vi khuẩn

—CH 2—CHOH—>—CH=CH—[-H2 Ồ, như chuyển từ glycerin

B a c iỉỉu s

h - P h ả n ứ n g tr ù n g h ợ p :

tién hành phản ứng này.

—CHO + CH 3 CHO—>CHOH—CO CH 3 như từ glycerine

thành acrolein [acryladehit], m ột số nấm men có thể trùng hợp aldehit thành 3-carbocyl metyletyl keton. ì- Q u ả

tr ìn h

am on

hỏa:

c = 0 -> = C H -N H 2, như phản ứng am on h óa của axit

pyruvic tạo thành alanin dưới tác dụng của một sổ nấm men. k-

Q u ả tr ìn h a c e ty ỉ h ó a [a c e ty iiz a tio n ]-.

acetyl hóa.

N hư

C lo s tr id iu m k ỉu y v e r y

cỏ thể có tác dụng

Với các chất hữu cơ phức tạp quá trình phân hủy sinh học [biođegradation] có thế xảy ra bằng phương thức loại bỏ ion halogen [dehalogenation], thủy phân làm cắt mạch [fracm entation] và vô cơ hóa [mineralization]

'.[.'tì [c]

M in e r a liz a t io n

[a ] D e h a ỉo g e n a tio n .

23.5.2.4. N h ữ n g yếu tố m ô i trư ờ n g ảnh hưởng đến sự p h ân hủ y của v i sinh vật đ ố i với chất gẫy ô nhiễm a - H o ạ i tin h tr a o đ ổ i c h ấ t c ủ a v i s ìn h v ậ t

Bản thân hoạt tính ưao đổi chất của vi sinh vật là yểu tố chủ yếu nhất đối với việc phân hủy chất gây ô nhiễm . N hững vi sinh vật khác nhau sẽ có những phản ứng khác nhau đối với cùng m ột chất hữu cơ hoặc kim loại nặng. Trong pha logarit, vi sinh vật có tốc độ sinh trưởng nhanh nhất, trao đổi chất và có hoạt tính m ạnh nhất. Bản chất của từng loài vi sinh vật quyết định phương hướng và m ức độ phân hủy từng hợp chất. Trong vùng đất và nước có nhiều hydrocacbon, những vi sinh vật sử dụng được hydrocacbon sẽ chiếm ưu thế, đó là kết quà của sự tích lũy tự nhiên. b - T in h th íc h ứ n g c ủ a v i s in h v ậ t

Vi sinh vật có vật chất di truyền đơn giản, có kiểu trao đổi chất đ a dạng, cho nến có tính thích ứng và tính thuần hóa rất cao. Q ua quá trình thích ứng, vi sinh vật có thể dùng chất mới tổng hợp được để kích thích việc tổng hợp những enzym cần thiết cho sự phân

hủy. H oặc do vi sinh vật bị đột biến mà tạo ra hệ enzym mới. N ói chung, kết cấu quần lạc vi sinh vật không ngừng phát triển và thay đổi theo điều kiện của m ôi trường mới. c - K ế t c ấ u h ó a h ọ c v à k íc h th ư ớ c p h â n tử c ủ a c h ấ t g â y ô n h iễ m

Thông thường các hydrocacbon mạch thăng đễ bị phân hủy hơn so với các hydrocacbon m ạch vòng, hydrocacbon không no dễ bị phân hủy hơn so với các hydrocacbon no. Khi c trên m ạch chính bị các nguyên tố khác thay thế, vi sinh vật sẽ khó oxy hóa hơn, tức là nguyên tử khác trên mạch chính khỏ được vi sinh vật sử đụng hơn so với cacbon, trong đó ảnh hưởng của o là rõ ràng nhất, rồi đến s và N. Hợp chất m ả mỗi nguyên tử c trên m ạch ít nhất giữ được 1 liên kêt C-H thi ít cản trở hơn đối với sự oxy hóa sinh học. Khi các gốc H trên nguyên tử c đều bị thay thế bằng gốc alkyl hoặc gốc thơm, tức là nguyên tử c bậc 4, thì không dễ bị vi sinh vật phân hủy. Kích thước phân tử ảnh hưởng rất lớn đến khả năng phân hủy sinh học. Với các họp chất cao phân từ khả năng phân hủy sinh học bị giảm. Các chất tẩy rửa bắt đầu được sản xuất từ năm 1954, về sau ngày càng m ở rộng phạm vi ứng dụng, không những ừong sinh hoạt m à cà ừong nhiều ngành cồng nghiệp như công nghíêp xenluloz, dệt, giấy, thực phẩm , da, tẩy rửa kim loại... Sau thập niên 50 của thế kỷ 20, sản lượng chất tẩy rửa trên thế giới tăng mồi năm lên tới hàng chục triệu tấn, vậy m à không thấy chúng tăng lên rõ rệt trong đất cũng như trong cơ thể động thực vật. Điều đổ chứng tỏ chúng được chuyển hóa, loại trừ nhanh trong môi trường, chủ yếu nhờ tác đụng của vi sinh vật, và cũng do sử dụng các chất tẩy rửa có cấu trúc phù hợp cho sự phân hủy của vi sinh vật. d - C ả c y ế u tổ k h á c tr o n g m ô i tr ư ờ n g :

Đó là cổc yếu tố nhiệt độ, độ ẩm, pH, oxy, chất đinh dưỡng và sự cạnh ừ an h giữa các loài. Ảnh hưởng của nhiệt là rất rõ rệt đổi vói hoạt tính cùa từng loại enzym. Trong những môi trường có nồng độ oxy thấp [như ao hồ, đầm lầy, đất ngập n ư ớ c...] hoạt động của vi sính vật kỵ khí sẽ chiểm ư u thể. Phương thức hô hấp liên quan m ật thiết đến điện thể oxy hóa khử, khi điện thế oxy hóa khử càng thấp, thuốc trừ sâu

666

[hexachloro-cyclohexane]

và các dẫn xuất của nó phân hủy càng nhanh.

23.5.3. Sự chuyển hóa và phân hủy của vi sinh vật đối với các chất ô nhiễm hữu cơ 23.5.3.1, Sự chuyển hỏa và phân hủy của vi sinh vật đối với các chẩt ô nhiễm hữu cơ thiên nhiên a- Sự phân hủy của vi sinh vật đổi với chất hữu cơ cao phân từ nguồn gỗc sinh học

Nước thải đô thị cũng như nước thải của các ngành công nghiệp có sinh vật là nguyên liệu, thường chứa rất ngiều chất hữu cơ cao phân tử có nguồn gốc sinh học và các sồn phảm trao đồi chất trung gian của chúng [hydratcacbon, protein, lipit, axit amin v.v...]. Những chất này tuy không độc và nói chung, đễ bi vi sinh vật phân hủy, nhưng cũng từ đó 589

tiêu hao oxy hòa tan ư o n g nước, gây hại đến môi trường, làm tôm cá chết và gây ra sự thối rữa. - Phân hủy polyxaccarit Polyxaccarit khi bị vi sinh vật phân hủy, thường do enzym ngoại bào thủy phân thành

đơn chất Tồi do enzym nội bảo thủy phân tiếp. X enluloz là thành phần chính thành tể bào thực vật, chiếm 35 — 60% ữọng lượng thực vật vả là chất ô nhiễm hữu cơ lớn nhất trong thiên nhiên. C ellulaz của vi sinh vật gồm 3 loại khác nhau: Ci

c xvà

p-glucozsidaz. Enzym Cl thủy phân xenluloz thiên nhiên chưa

bị cắt ngắn. Enzym Cx còn gọi là P-1,4- glucanaz, cắt ngắn tiếp các polyoz và oligooz đẵ được cắt ngắn. Dưới tác dụng của vi sinh vật phân giải xenluloz hiếu khí, glucoz có thể oxy hóa triệt để thành CO 2 và nước. Dưới tác dụng của vi sinh vật phân giải xenluloz kỵ khí, glucoz cỏ thể lên m en butyric, sinh ra axit butyric, butanol, axit axetic, etanol, CO 2 , H2. Các vi sinh vật phân hủy xenluloz gồm các vì khuẩn hiếu khí như Cytophaga, Cellvibribrio, C ellulom onas...,vi khuẩn kỵ khí như C lostridium otnelianskii, Clostridium thermocellulazum,

nấm

có

Trichoderm a,

A spergillus,

Penicillium ,

Stachybotrys,

Therm oascus....

H ì n h 2 3 .4 0 : c ẩ u tr ú c c ủ a x e n lu io z [th e o J . W .L e n g e le r v à c ộ n g s ự ],

Tinh bột chia thành tinh bột m ạch thẳng [am yloz] và tinh bột m ạch nhánh [am ylopectin] Đom vị glucoz trong tinh bột m ạch thẳng nối với nhau bằng liên kết a-1,4 glucozsid; tin h bột m ạch nhánh ngoài liên kết a-1,4 còn có liền kết a-1,6 glucozsid. Trong tinh bột thiên nhiên có 10-20% là tinh bột mạch thẳng, còn lại là tinh bột m ạch nhánh. Tinh bột là nguồn năng lượng và nguồn

c quan ừọng

của nhiều loài vi sinh vật dị dưỡng, chúng

sinh enzym am ylaz thủy phân tinh bột thành m antoz và glucoz, rồi đi vào trong tế bào để vi sinh vật sử dụng.

H ì n h 2 3 . 4 ỉ : T i n h b ộ t v à c á c e n z y m t h ù ý p h â n t i n h b ộ t. [ T h e o 3. w , L e n g e l e r

A m ylaz của V i

sinh vật có

và c ộ n g

loại:

s ự ].

a-amylaz,

p-amylaz,

Iso-amylaz

và

Glucozamylaz.Tinh bột dưới tác dụng cộng đồng cửa 4 loại m en trên, có thể thủy phân hoàn toàn thảnh glucoz. Trong các hydrat cacbon có cẩu trúc tương tự tinh bột còn có glycogen, pullulan, cyclodextrin..Để tạo thành pullulan cần có enzym pullulanaz. Để tạo thành cyclodextrin cần có enzym cyclodextrin glucozyl tiansferaz. Rất nhiều vi sinh vật có khả năng phân giải m ạnh mẽ tinh bột, đó là vi khuẩn

B a c illu s , P s e u d o m o n a s , A th r o b a c te r ,

A c h r o m o b a c ie r A g r o b a c te r iu m , C lo s tr id iu m a m y ỉo ỉy tic u m , C lo s tr id iu m a m y lo b a c te r

và rất

nhiều chi nấm sợi khác nhau. Propectin là chất keo thiên nhiên không tan ừong nước, là thành phần chính trong chất gian bào của thực vật bậc cao. Propectin là loại cao phân tử polyanionic chủ yếu do các acid D -galacturonic nối với nhau qua liên kết a -[l,4 ] D-galacturonic axit, ngoài ra còn có các gốc đường rham noz, tiếp nối bằng liên kết [1,2] D-rhamnoz. Propectin bị thủy phân thành pectin hòa tan nhờ enzin propectinaz.Pectin hòa tan dưới tác dụng của pectinmetyl esteaz [pectaz] bị thủy phân thành axit pectinic rồi thủy phân tiếp thành các hợp chất đơn giản được vi sinh vật hấp thụ.

591

H em ieellulose

pprtin

H ìn h 2 3 .4 2 ; c ẩ u tạ o c ủ a p e c ti n

và h e m i x e n l u l o z s .

M ô thực vật chửa rất nhiều hem ixenluloz, chỉ đứng sau xenluloz, chiếm tới 25-40% ừong cây m ột năm và 25-35% trong cây cây gỗ. H em i-xenluloz là chất trùng hợp cao phân tử cùa nhiều loài pentoz và hexoz, ngoài glucoz còn cỏ xyloz, m annoz, galactoz, rhamnoz và arabinoz. Thường chứa 500-3000 đường đơn trong khi xenluloz có tới 7000-15 000 gốc glucoz. Có loại hem ixenluloz chỉ do 1 loại đường đơn tạo nên, như polyxyloz, polygalactoz, polym annoz; có những hem ixenluloz do nhiều loại dường đơn, axit mannuronic, axit galacturonic tạo nên. So với xenluloz, hem ixenluloz dễ bị vi sinh vật phân hủy hom. D o thành phần khác nhau, nên các loại enzym phân hủy cũng khác nhau. Lignin là chất trùng hợp cao phân tử của nhỏm hợp chất thơm , có rất nhiều trong mô thực vật hóa gỗ và k ẽ h ở gỉữa các sợi xenluloz trên thành tế bào, có tác dụng làm tăng cường độ bền cơ học. K ết cấu lignin rất phức tạp, lấy vòng benzen làm hạch tâm, trùng hợp từ m ột hoặc'nhiều chất thơm và có nhảnh propane, đồng th ài thưởng kết hợp với các loại poiyoz.

H ì n h 2 3 . 4 3 : c ẩ u t r ú c c ù a i i g n i n v à c á c t h à n h p h ầ n c ấ u t ạ o c ù a li g n in . [T h e o J . W .L e n g e le r v à c ộ n g sự ].

Lignin ỉà thành phần khó phân giải nhất của thực vật, thường do vi khuẩn phân hủy lignin thành nhóm chất thơm, rồi đo nhiều vi sinh vật phân giải tiếp. Tốc độ phân giải linin rất chậm và cỏ m ột phần rất khỏ phân giải. Các nghiên cứu chứng tỏ, chất mùn có thành phấn kểt cẩu gỉổng lỉgnin,được cho là từ các hợp chất thơm sinh ra trong quá trình phân giải lignin tái trùng hợp m à thành. Các loại vỉ sinh vật phân giải hoàn toàn ỉỉgnin các loài nẩm, vi khuẩn, trong đổ nấm đóng vai trò chủ yếu. Các loại nấm m ũ thưỉmg phá hủy Ịignin mạnh mẽ là Phanerochete chrysosporium, Đerkanđera adusta, Thametes versicolor, Pleurotus ostreatus, D ichom ỉtus squalens, Ceriporriopsis subvermispora... Ngòai ra còn có m ột số xạ khuần, vi khuẩn cũng có năng

593

lực phân hủy lignin, nhưng thường sử dụng enzym nội bào. Chúng thường thuộc các chi như Streptom yces, A rthrobaeter, M icromonaspora, Nocardia, Clostridium , Pseudomonas, A cinetobacter, Bacillus... M ô hình thường dùng để nghiên cứu việc phân giải lignin là nấm Phanerochete chrysosporium . Chất béo trong cơ thể động, thực vật chủ yếu gồm lipit, lipoid và chất sáp. Glycerin là sản phẩm thủy phân của chất béo. Vi sinh vật sừ dụng axit béo thông qua quá trình p-oxy hóa, phân hủy thành nhiều axit axetic, sau đó oxy hóa thành CƠ 2 - Trong điều kiện không thoáng k h í , axit béo khó phân hủy m à thường tích lũy lại. Các vi sinh vật phân hủy chất béo phần lớn là vi khuân hiếu khí thuộc các chi như Pseudom onas, Mycobacterium, A chromobacter, Bacillus.... M ột số vi sinh vật có khả năng loại trừ các độc tố nấm [mycotoxin]. Hiện đã biết tới trên 100.000 loài nấm, trong đó có khoảng 400 loài có sản sinh các độc tố. Đ ộc tố nấm làm ô nhiễm ngũ cốc, cây lấy dầu v à các nông phẩm khác. Đây là mổi hiểm nguy toàn cầu đối yới sự an toàn của thức ăn g ia súc, g ia cầm .. Đ ộc tố nấm còn trực tiếp hoặc gián tiếp gây ô nhiễm thực phẩm , làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Phương pháp tốt nhất để ưánh nguy hại của độc tố nấm là tạo ra các giống đề kháng đối với các nấm sinh độc tố. H iện nay, việc tạo giống lúa m ì và ngô kháng nấm bệnh đã có tiến bộ vượt bậc, nhưng vẫn chưa có giống nào mang tính đề kháng hoàn toàn. Cải tiến các khâu thu hoạch, dự trữ, chế biến cũng là phương pháp có lợi để hạn chế nấm sợi phát triển và sinh độc tổ. Ngoài ra dùng hóa chất để x ử lý nông phẩm cũng là m ột phương pháp khả thi. Ví dụ, người ta đã tìm thấy khoảng 100 hợp chất có thể ửc chế việc sản sinh ra aíìatoxin.

A f la to x in B ỉ v à B ĩ .

O c h r a to x in A

và B .

F u m a g iU in

Hình 23.44: Một số ỉoạỉ độc tổ nấm quan trọng. D ùng vi sinh vật để phân hủy độc tố nấm để khử độc tố nấm cũng là m ột phương pháp có ích. Scott đã đùng 3 chủng nấm men khác nhau khi lên men có bổ sung độc tổ nấm và nhận thấy có thể giảm bớt được 28% độc tố fumagillin A và 17% fumagillin B do A s p e g iỉỉu s fu m ig tu s

sinh ra, giảm bớt được 13% ochratoxin do

A s p e r g illu s o c h r a c e u s

sinh

ra, hấp thu được 21% ochratoxỉn nhưng chưa hấp thu được fumagillin. V ào thập kỷ 60 của thế kỷ 20, Cieglar đã phảt hiện thấy trên 1000 loài vi sinh vật có khả năng phân giải Aílatoxin do nấm

A s p e r g illu s fla v u s

F ỉa v o b a c te r iu m B - Ỉ 8 4

và

A s p e r g illu s p a r a g itic u s

sinh ra. Trong đó chùng

có loại trừ aflatoxin một cách triệt để.

b - V i s in h v ậ t p h â n h ủ y c á c h ợ p c h ấ t h yd ro c a c b o n

Hydrocacbon bao gồm rất nhiều chất có phân tử lượng từ 16 [tnetan] đến khoảng 1000. Trong đó có chất ở thể khí [metan, ethane, propane, butane, acetylene, etylen, propyne...], thể lòng bay hợi [xăng, benzen, toluen], cũng có ở thể rán [parafin]. Chúng thuộc về các nhóm, lần lượt thuộc các nhóm alkanes, d e fin e s, acetylenes, hydrocacbon thơm [arene], hydrocacbon alicyclic. Dầu m ỏ là hỗn hợp phức tạp của nhiều loại hydrocacbon v à m ột ít chất hữu cơ khác. Một m ẫu dầu m ò điển hình, gồm tói 200-300 loại hydrocacbon khác nhau. Sinh vật cũng tổng hợp được nhiều loại hydrocacbon, như chất sáp trên iá cây là loại hýdrocacbon C 25 C3 3 , carotenoit tổng hợp bởi thực vật bậc cao, tảo và vi khuẩn quang hợp cũng thuộc loại hydrocacbon không bão hòa. Biểu bì cùa côn trùng, chất tiết ờ da động vật có vú cũng có chứa hydrocacbon. Có loài lipoid của vi sinh vật chứa hydrocacbon m ạch dài. D o đỏ, chất béo trong xác động, thực vật, vi sinh vật, trong nước thải của các nhà m áy chế biển thực phẩm, nhà m áy thuộc đ a ... cũng là những nguồn hydrocacbon. Đồng thời trong các đầm lầy, ruộng nước nước bần, dạ cỏ của động vật nhai lại, luôn luôn diễn ra quá trình phân hủy kỵ khí chất hữu cơ sinh ra iríetan.

595

H ì n h 2 3 .4 5 : S ự p h â n h ủ y s i n h h ọ c [ b i o d e g r a d a t i o n ] c á c a l k a n [ t h e o . M . M a i e r v à c ộ n g s ự ].

Hình 23.46: Sự phân hủy sinh học aĩken [theo.M.Maỉer và cộng sự].

596

Dưới đây là m ột số ví dụ về các quá trình phân giải các hợp chất hydrocacbon nhờ vi sinh vật: - Oxy hóa metan:

- Oxy hóa etan, propan, butan: có thể thông qua m ột số vi khuẩn sử dụng m etan làm nguồn năng lượng và nguồn

c, biến

etan, propan, butan thành các axit hoặc keton tương

ứng, chúng sẽ phân hủy tiếp nhờ nhiều loại vi sinh vật khác nhau. - Oxy hóa các hydrocacbon bậc cao Oxy ban đầu của chúng cỏ thể cỏ 3 con đường: sinh ra axit cacbonxylic; sinh ra axit dicacbonxylic; sinh ra keton. Trong đó con đường thứ nhất hay gặp nhất. - O xy hóa alkan mạch thẳng: một số ví dụ:

Oxy hóa hydrocacbon m ạch vòng không có goc metyl ở đầu:

597

H ì n h 2 3 . 4 7 : S ự p h â n g i à i a l k a n v ò n g t h ơ m [ t h e o A i. A A l t e r v à c ộ n g s ự ] .

598

- Phân giải alkan vòng thơm: - Phân giải alkan thơm đa vòng:

Vi sinh vật có khả năng phân hủy qua trao đổi chất rất m ạnh mẽ, đa dạng hóa và với tốc độ nhanh cho nên được coi là con đuờng quan trọng nhất để khử hydrocacbon thơm đa vòng. Chủ yếu có 2 kiểu trao đổi chất: - Hyđrocacbon thơm đa vòng

ỉà nguồn c vả năng lượng đuy nhất.

- Hydrocacbon thơm đa vòng tiến hành cùng ừao đồi chất với các chất hữu cơ khác, chuyển hóa chất ô nhiễm thành những sản phẳm cuối cùng ổn định và không độc hại [như nước, CƠ 2 , rượu và axit đơn giản, sinh khối vi sinh v ậ t...]. 23,5.3.2. S ự p h â n h ủ y và chuyển hỏa của v ỉ sinh vật đổi vớ i các hợp chất hữ u cơ tồng h ợ p n h â n tạ o a-

Phân

hủy

nhờ

s in h

vật

các

hợp

c h ấ t P o ỉy c h ỉo r in a td

b ip h e n y ls

[P C B s ]

PCBs là những hợp chất clo hữu cơ tổng hợp nhân tạo, dùng làm chất ổn định, đã được ứng dụng rộng rãi [trong đầu bôi ươ n, đầu cách điện, chất tăng độ dẻo, chất tải nhiệt, sơn, mực in..]. PCBs độc đối với da, gan, thần kinh, xương, còn là m ột nhân tố có thể gây ung thư. PCBs rất ổn định, khó phân hủy trong m ôi trường. Bài viết đầu tiên về khả năng phân hủy nhờ vỉ sinh vật đối với PC B s được phát biểu vào năm 1974, đỏ là bài viết về các vi sinh vật phân lập từ đất cỏ khả nâng phân hủy PCBs. Năm 1978, m ột nhà khoa học N hật đa phân lập được 2 chủng vi khuẩn phân hủy PCBs từ mẫu bùn lấy m ột hồ ở W isconsin [Hoa Kỳ], đỏ là

A ỉc a lig e n s

sp. v à

A c in e to b a c te r

sp.

Chúng đều cỏ thể sinh enzym chuyển hóa PCBs thành diphenyl và clorobiphenyl, rồi hấp thu sau khi chuyển qua các đạng trung gian catechol. V i sinh vật vừa phân hủy được những chất PCBs, vừa sử đụng chúng ừo n g để trao đồi .chất. Các nhà khoa học đã gây đột biến đối với chùng vi khuẩn t S e r r a tia s p ., B a c illu s

P seudom onas

sp.,

sp để thu được các chùng cỏ khả năng khoáng hỏa PCBs thành C 0 2

vả nưổc.

599

Chit tnmggian càterhol

* d m trinh TCA'

Mr*

M—

Hình 23.48: Sự đồng hóa p-cỉorobiphenyì sau khi phân hủy từPCBs. [theo.MMaỉer và cộng sự], b - P h â n h ủ y n h ờ v i s in h v ậ t đ ổ i v ớ i c á c c h ấ t h o ạ i đ ộ n g b ề m ặ t

Thành phần cơ bản chất tẩy rửa là các chất hoạt động bề m ặt tổng hợp nhân tạo. Căn cứ tình trạng điện ly của các chất hoạt động bề m ặt trong nước, có thể chia thành 4 loại: dạng cation, dạng anion, dạng phi ion và dạng điện giải lưõng cực. Chất hoạt động bề mặt anion được ứng dụng phổ biến nhất, m à trong đỏ m uối alkyl benzen sulfonat [ABS] được dùng nhiều nhất.

Cấu trúc của ABS C hất h o ạt tính bề m ặt đầu tiên là ABS phi tuyến tính, gốc m etyỉ ư ê n m ạch nối alkyl ứ ờ ngại cho phân hủy sinh học. ABS trong nước có thể tồn lưu trên 600 giở. Đ ể cho chất hoạt động bề m ặt đễ bị phân hủy sinh học hơn, người ta đã chuyển kết cấu chúng thành dạng alkyl benzen sulfonat m ạch thẳng [Linear alkyl benzen sulfonat, LA S], nhờ vậy mà tốc độ phân hủy sẽ nâng cao rất nhiều. Hiện nay chất hoạt động bề m ặt chủ yếu ỉà các chất LAS.

HsC—[C H s^C H — CHỵ—[CH2]ỹ-CH3

sor Na+ [ jc f y - 6 - 9 ]

Cẩu trúc của LA S N gười ta đã phân lập được từ đất, nước, bùn hoạt tính các vi sinh vật sử dụng các chất hoạt động bề m ặt làm nguồn c và nguồn năng lượng duy nhất, chủ yếu gồm những loài trong các chi

P seudom onas,

P ỉe s io m o n a s , X a n th o m o n a s , A lc a lig e n s ,

N o c a r d i u m . A z o t o b a c t e r ...Chi A z o t o b a c t e r ,

ngoài loài

A z o to b a c te r

M ic r o c o c c u s ,

b e ije r in s k iiy

những loài tích cực tham gia phân hủy các chất hoạt động bề mặt. Nuôi cấy

đều là

A z o to b a c te r

từ

nguồn nước bẩn có chứa chất hoạt động bề mặt có ý nghĩa rất lớn, vì nhờ cố định N trong khí quyển, trong nước sẽ có thêm N hữu cơ, xúc tiến các vi sinh vật khác phát triển làm nâng cao tốc độ phân hủy chất tẩy rửa. Nhiều nghiên cứu cho thấy các chủng sp. và

B a c iỉỉu s

A ỉc a ỉig e n c e s

sp. mang tính chuyên hóa cao và có hiệu suất phân hủy cao đối với LAS

nên thường được ứng dụng để xử lỷ cảc nguồn nước bị chất hoạt động bề m ặt gây ô nhiễm. Từ mỏ dầu người ta đã phân lập được chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy chất natri dodecylbenzen sulfonat [SDS] ở nhiệt độ thấp và có hiệu suẩt phân hùy cao. Lâm Lực [Trung Quốc] từ vùng đất bị ô nhiễm dầu mỏ đa phân lập được 2 chủng W e e k s e lla 6

P a w u s o n in a s

52 và

. Hai chủng này cỏ thể dùng acetae am on làm nguồn N, ở 30°c, pH 7 và rất ít

glucoz, vẫn có thể làm sạch chất hoạt tính bề m ặt phi ion hóa AE-9. K hả năng phân hủy cùa vi sinh vật đổi với các chất hoạt động bề mặt phụ thuộc vào sự tồn tại của plasmid, những gen quyết định các enzym liên quan đến phân hủy LAS đều nằm ừ ê n plasmid.

C ẩ u tr ú c c ù a S D S .

601

c- Phăn hủy nhờ vi sinh vật đổi với chất dẻo C hất dẻo là loại cao phân tử tổng hợp nhân tạo đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới. N hững m ành vụn chất dẻo đo mang tính trơ sinh học, sẽ tồn tại lâu dài trong môi trường, hình thành m ối nguy hại lâu dài. M ột số chủng vi nấm , vi khuẩn, xạ khuẩn cỏ khả năng phân hủy các chất dẻo tổng hợp.. Chúng thực hiện qua 3 phương thức: - Tác dụng lý sinh— sự sinh tnrởng của tế bào vi sinh vật gây phá hủy cơ học tới vật dụng bẳng chất dẻo. - Tác dụng hóa sinh— sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật tác động lên chất dẻo. - Tác dụng trực tiếp do enzym — vi sinh vật sinh ra những enzym có tác động lên thành phần cao phân tử của chất đèo, dẫn đến sự phân giải oxy hóa. Chất dẻo bị ánh sáng làm lão hóa [quang giải] trước thì sau đó sẽ dễ bị phân hủy sinh học hơn nhiều. Trong đất, nhiều vi sinh vật cỏ thể sử dụng được những m ẩu vụn chất dẻo qua quang giải để sử dụng như nguồn thức ăn c , chủ yểu là các vi nấm thuộc chi Aspergillus. Ngoài việc nghiên cứu phân hủy vi sinh vật đối với chất dẻo người ta chú ý nhiều hơn đến việc sử dụng vi sinh vật để sản xuất ra các loại chất dẻo dễ bị phân hủy trong tự nhiên. Chất đèo sinh học có tên thương phẩm là Biopol đã được sản xuất từ vi khuẩn ưa kiềm Alcaligens eutrophus. Chúng sử dụng CH 2 O v à axit hữu cơ làm nguyên liệu để tổng hợp ra polyhydrocacbon este [phân tử gồm m ột chuỗi dài CHO]. Thay đổi điều kiện môi trường của vi khuẳn có thể chế tạo ra m ột loạt các biopol cao phân tử với độ cứng, độ dẻo, độ dai khác nhau.V iện nghiên cứu Hóa học thuộc Đại học công nghiệp Tokyo,đà nghiên cứu thay đổi m ôi tn rờ n g dinh dưỡng của A lcaligens eutrophus để bắt chúng tổng hợp ra loại chất dẻo này. Đại học M adison [H oa K ỳ] đã tách được từ A lcaligens eutrophus 3 gen điều khiển việc sản sinh, chuyển các gen này vào vi khuẩn Escherichia coli khiến chúng tổng hợp ra được polyhydrocacbon este. M ột nghiên cứu ờ Đại học M ichigan [Hoa Kỳ] đã chuyển gen từ A lcaligens eutrophus vào thực vật [nhóm rau cải], khiến cây cải cũng chế tạo được ra chất dẻo này. Theo dự đoán đến cuối thế kỷ 21 loại chất dẻo đễ bị phân nhủy này sẽ được sản xuất rộng lởn từ cây trồng. d - P h â n h ủ y n h ờ v i s in h v ậ t đ ổ i v ớ i th u ố c b ả o v ệ th ự c v ậ t

N hững vì sinh vật phân hủy được thuốc bảo vệ thực vật gồm cỏ vi khuẩn, xạ khuẩn, vi nấm và tào. Trong số này có chi vi khuẩn Pseudom onas là đáng chú ý hơn cả. Pseudom onas có thể phân hủy được DDT, m alation, phorat, diazinon, parathion-metyl, parathion, 2,4D , dalapon, sim azin... Công ty N ew castle [H oa K ỳ] thông qua việc nuôi cấy trên m ôi trư ờng làm giàu đã phân lập từ đất được chủng Psedom onas putida cỏ thể phân hủy được vinclozoUn. K hi vinclozolin tan trong đất sẽ bị phân hủy nhanh chóng. Tiêu Hoa

602

Thắng [Trung Quốc] từ đất của xưởng thuốc trừ sâu đã phân lập được chủng Pseudomonas sp. WS5 có thể phân hủy được tới 75% methamidophos với nồng độ 1000 m g/L ừong vòng 18 giờ. Bacillus sp. có thể phân hủy được DDT, parathion - m etyl, parathion... Thi Quốc Hàm [Trung Quốc] phân lập từ đất chủng Bacillus sp. có thể phân hủy được aldicarb.... Flavobacterium: phân hủy được nhiều loại thuốc BVTV như m alathion, parathion, parathion-metyl, diazinon, 2,4-D ....V ương N gân Thiện [Trung Quốc] phân lập được từ ruộng bông chủng Flavobacterium sp. P3-2 có thể phân hủy m ạnh mẽ đốí với parathionmetyl và isocarbophos,.... N hiều vi khuẩn thuộc chi Alcaligens cỏ thể phân hủy được không ít loại thuốc B V T V ....N gu V ân Long [Trung Quốc] từ nước thải xưởng sản xuất thuốc BVTV đã phân lập được chủng Alcaligens sp.Ỳ l 1 có thể phân hủy được khá nhiều loại thuốc BVTV khác nhau, như parathion, parathion-metyl, phenỉtothion... Ngoài ra, các vi khuẩn có thể phân hủy thuốc BVTV còn tìm thấy ở nhiều chi khác như A rthrobacter, Brevibacterium, Sarcina, S treptococcus...Các chi vi nấm có khả năng phân hủy thuốc BVTV gồm có Aspergillus,

Penicillium,

Rhizopus,

Trichoderma,

Fusarium ,

AlteARNria,

Cephalosporium, M ucor, Gliocladium, Neurospora, Rhizobium v.v ...T h i Quốc Hàm [Trung Quốc] đã phân lập được từ đất những chùng thuộc các chi Penicillium , Mucor, Aspergillus ... có thể phân hủy được chlorbenzuron N.3. ô n g cũng đã nghiên cứu cơ chế và con đường phân hủy của Penicillium đối với chlorbenzuron. Lưu N gọc Hoán [Trung Quốc] đã phân lập được chủng thuộc loài Aspergillus oA RNtus từ đất bị nhiễm lâu dài methamidophos có hoạt tính phân hủy cao đối với methamidophos, tỷ lệ phân hủy cao nhất có thể đạt tới 83%. Rõ ràng là vi sinh vật có khả năng phân hủy thuốc BVTV tồn tại khắp nơi.Tuy nhiên có loại bị phân hủy nhanh [ như

2 ,4 - Đ ] n h ư n g

cũng có những chất hầu như

không bị phân hủy [như 2,4,5-T]

Hình 23.49: Tốc độ phân hủy của 2,4-D và 2,4,5-T. 603 Á

2,4-D [axit 2,4-dichlorophenoxyaxetic] là chất diệt cỏ có hiệu suất cao, ít lưu lại ừong đất, phân hủy tương đối nhanh, chu kỳ bán hủy chỉ vào khoảng vài ngày hoặc vài tuần. Có hơn 10 loài vi khuẩn thông qua 2 hoặc 3 con đường khác nhau để phân hủy 2,4-D. V i sinh vật có thể phân hủy 2,4-D gồm cỏ:

A c h r o m o b a c te r , A r th r o b a c te r , P se u d o m o n a s,

C o r y n e b a c te r iu m , F la v o b a c te r iu m , N o c a r r d ìa , A s p e r g illu s , P e n ìc ilỉỉu m

...

D alapon [natri a ,a - dichloropropionate] là thuốc trừ cỏ dễ tan ừong nước, ít lưu lại trong m ôi trường, chu kỳ bán hủy là 15-45 ngày. N hững vi sinh vật có loài dùng dalapon làm nguồn c [nhóm sử dụng sơ cấp] có loài sử đụng sản phẩm trao đổi chất của các loài trên [nhóm sử dụng th ứ cấp] .DDT [D ichloro-D iphenyl-Tricloroetan] là thuốc trừ sâu có thể tồ n lưu lâu dài khổ nguy hiểm, chu kỳ bán hủy là trên nửa năm. D D T được tổng hợp từ năm 1874, đến năm 1939 thì phốt hiện ra khả năng diệt côn trùng và v ì vậy đã được sừ dụng rộng rãi ttong những năm đầu của Thế chiến II để điệt m uỗi truyền bệnh sốt rét và các côn trùng gây bệnh khác. Sau thế chiến II người ta đã sử đụng rộng rãi D D T để trừ sâu hại cây trồng. N hờ các nghiên cứu vè D D T m à P.H .M ủller đã được nhận giải thưởng N obel vào năm 1948. năm 1962 Rachal C arson cảnh báo k hả năng gây ung th ư của các thuốc trừ sâu tồn tại lâu dài trong thiên nhiên nh u D D T v à người ta đã gần như đã loại bò thuốc trừ sâu này. Đ ã có những bằng chứng cho thấy

A e r o b a c te r a e ro g e n s, H y d r o o m e o n a s

sp. có thể thồng

qua trao đổi chất m à chuyển hóa D D T thành các hợp chất đơn giản hơn sau đó tiếp tục được vi sinh vật phân hủy tiếp.

Cẩu trủc cùa DDT.

604

cẩu trức cùa 2.4D và 2,4,5T.

Sau đỏ tiếp tục được vi sinh vật phân hủy tiếp. Các vi sinh vật phân hủy m ạnh mẽ DDT còn có

B a c illu s , N o c a r d a , S tr e p to m y c e s .

Trong thiên nhiên, có rất ít những loài vi sinh vật phân hủy

2 ,3 ,4

-T., Chakrabartyk

khi phân lập vi khuẩn phân hủy 2,3,4-T đã thêm nhiều loại vi sinh vật chứa plasm id phân hủy CAM, TOL,SAL, pA C 21, pAC23. Sau khi nuôi cấy chung 8-10 tháng, đã chọn lọc được chủng

P se u d o m o n a s p u tỉd a

A C 110 có khả năng phân hủy 2,3,4-T với hiệu suất cao.

Trong tế bào của chúng cỏ chứa nhiều plasmid như pDG3, pDG4. N hiều vi khuẩn chuyển đổi plasm id trong

tuần có thể phân hủy 2,3,4-T từlOOOml/L xuống chỉ còn 500mg/L.

R.G.Haugland tiến hành đung hợp giữa vi khuẩn A ỉc a ỉỉg e n s e u tr o p h u s

P seu d o m o n a s

p u tid a A C M ữ O

và

JMP134 cho hiệu suất phân hủy 2,4,5-T cao. Khi chuyển plasm id của

chủng JM P13 sang chủng AC 1100, thu được chủng vi khuẩn tái tổ hợp R H J1, có thể cùng một lúc phân hủy cả 2,4-D và 2,3,4-T.

605

Chương 24

VI SINH VẬT TRONG MÔI TRƯỜNG NƯỚC

Nước chiếm 7/10 diện tích bề m ặt Trái đất, ừong đó 97,2% tổng lượng nước toàn

cầu là nước biển phân bố ở các đại đương. Lượng nước biển ước khoảng 13 000 X 1014 m3. Do có thể tích lớn như vậy nên nước biển thường không bị ô nhiễm , ngoại trừ vùng nước biển nằm ven bờ, nơi có hoạt động của con người, Phần nước còn lại là nước ngọt nằm trong lục địa, phân bố ở sông, suối, hồ, chòm băng địa cực, nước ngầm ... M ặc dù nước ngọt chiếm m ột phần rất nhỏ nhưng chúng lại có tầm quan ữọng thiết yếu vì là nguồn nước được sử dụng trong sinh hoạt. Ở nhiều nơi, nước ngọt đang bị ô nhiễm do các chất thải của sản xuất công nghiệp, sản xuất nông nghiệp và sinh hoạt, gây ảnh huở ng nghiêm ư ọ n g tới m ôi trường. M ôi trường nước biển v à nước ngọt là nơi sống của nhiều loại vi sinh vật. Các vi sinh vật này m ang nhiều đặc tính đặc trưng để thích nghi với m ôi trường sống đặc biệt này.

24.1. MÔI TRƯỜNG NƯỚC Trong m ôi trư ờng nước luôn tồn tại các chất khí, chất rán v à chất hòa tan. Sự chuyển động không ngừng củ a các chất làm cho nồng độ vật chất ờ từng vùng nước nhất định luôn thay đổi. Đ iều này đã tạo ra những đặc điểm rất đặc trưng cho quần thể vi sinh vật nước. V i sinh vật sống trong nước có thể nhanh chóng đáp ứng với sự biến động của m ôi trường v à luôn tìm đến những vùng nước thích hợp nhất. Q uần x ã vi sinh vật sống trong nước bị điều khiển bởi những chuyển động và hòa trộn của các chất đinh dưỡng, oxi và chất thải. Chẳng hạn như ở các hồ sâu và đại dương, chất hữu cơ ờ bề m ặt thường láng xuống đáy, đo đó vùng nước ở đáy rất giàu chất dinh dưỡng. V i sinh vật phân bổ ở dưới đáy sẽ phân hủy các chất hữu cơ thành các sản phẩm bao gồm chất khí v à chất hòa tan. Các chất này sẽ di chuyển lên ừ ên và thúc đẩy hoạt động của các vi sinh vật ở đó. H iện tượng tương tự có thể thấy ỏ các hồ nông phì dưỡng, màng sinh học - biofilm , thảm vi sinh vật, tuy nhiên khoảng chênh lệnh gradien nồng độ giữa các m ôi trường này rất nhỏ, ‘chỉ tính bằng Ịim.

606

Các môi trường nước, như đại đương, hồ, sông, trong cơ thể, trong đ ấ t . p h â n biệt về thể tích và diện tích bề mặt. Ngoài ra, môi trường nước còn khác nhau về độ pH [acid, kiềm hay trung tính] và nhiệt độ [dao động từ -15°c đến 113°C]. T.D. Brock và cộng sự đã phát hiện vi khuẩn

T h e r m u s a q u a tic u s

trong suối nước nóng tại Công viên quốc gia Yellow Stone,

vi khuẩn này là nguồn sản xuất ra enzim vật ưa nhiệt độ cao như

Taq

P y r o ỉo b u s fu m a r ii

polymerase dùng cho phản ứng PCR. Vi sinh

thì được phân lập từ các rãnh thuỷ nhiệt ở thềm

đại dương. Rãnh thủy nhiệt lả những vết nứt trên bề mặt Trái đất mà tại đó có dòng nước nóng phun ra. Ở đảy đại dương, rãnh thủy nhiệt có đặc trưng là phun ra khỏi đen chứa các chất khoáng có hàm lượng lưu huỳnh và các hợp chất của lưu huỳnh cao. Đây là m ột trong các nguồn khai thác của các nhà nghiên cứu, nhàm phục vụ cho các mục đích thực tiễn, khoáng chất. Do các đặc trưng của môi trường nước và vi sinh vật nước nên việc phân lập và nuôi cấy vi sinh vật nước trong phòng thí nghiệm gặp rất nhiều khó khàn. Chính vi vậy nên nhiều vi sinh vật biển vẫn là điều bí ẩn đối với con người. Vi sinh vật nói chung và vi sinh vật biển nói riêng cỏ khả năng sinh ra các chất có hoạt tính sinh học và là đối tượng nhất là y học. M ột số chất kháng sinh mới tìm thấy có nguồn gốc từ nước [hình 24.1]. Hiện tại, nhiều kỳ thuật mới đang được áp dụng để thu mẫu vi sinh vật m à không gây stress về nhiệt độ và áp suất. Các nhà khoa học Nhật và M ỹ đã thiết kế các thiết bị đặc biệt để có thể nuôi cấy các vi sinh vật sinh trưởng ờ áp suất

1000

atm.

H ìn h 2 4 . ỉ : M ộ t s ổ c h ấ t h ó a tr ị li ệ u c ó n g u ồ n g ố c t ừ b iể n .

[a] Goniodomỉn A - tác nhân chổng nấm nhóm macrolide; [b] Didemnin B - tác nhân chống ung thư và virut.[Theo Prescott-Harỉey-Kỉein, 2002]. H ầu hết các chất khảng sinh hiện sử dụng thường là cỏ nguồn gốc từ vi sinh vật đất, chủ yếu từ xạ khuẩn [Actìnomycetes], rồi đến từ nấm và vi khuẩn Gram dương. Hơn 100 sản phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật đã được dùng làm chất kháng sinh, tác nhân chổng ung thư và sản phẩm phục vụ nông nghiệp. Trong những năm gần đây, do nhu cầu tỉm kiếm các hợp chất mới sử dụng trong y học ngày càng tăng, nên vi sinh vật biển đang ngày

607

càng được quan tâm . M ột số các hợp chất m ới được tìm thấy là các vật chất chuyển hóa của vi tảo. N goài ra, người ta cũng quan tâm đến việc nuôi cấy các vi sinh vật biển cộng sinh, chẳng hạn n hư vi khuẩn lam Prochloron cộng sinh với các vật chủ lớn có thể nhìn thấy bằng m ắt thường. M ột loạt các hợp chất đáng chú ý khác vóả nguồn gốc chưa rõ ràng đã được tìm thấy. R ất nhiều hợp chất được cho là có nguồn gốc từ vi sinh vật nhưng cần tiến hành nghiên cứu thêm để làm sáng tỏ điều này. N hiều nhả sinh học nhận thấy rằng các vi sinh vật biển có thể cung cấp các hợp chất có hoạt tính sinh học rất đặc trưng, như chất độc, m à ở các vì sinh vật đất không thể có. Các nhà khoa học đang cổ gắng tìm hiểu kỹ hơn quần x ã vi sinh vật biển nhàm ứng dụng trong y học hiện đại. Tuy nhiên nghiên cứu trên đối tượng vi sinh vật biển là thử thách lỏn cho các nhà khoa học, vì không dễ dàng gì để có thể nuôi cấy các vi sinh vật này ừ ong phòng thí nghiệm. G ần đây m ột số các hợp chất mới cỏ hoạt tính sinh học đã được tìm ra. G oniodom in A, là tác nhân chống nấm chứa vòng m acroliđe, dược tách chiết từ G oniođom a [G onyaulax] sp. D idem nin B, tác nhân chống virut và ung thư, cũng được tách chiết từ Prochloron

[ h ì n h 2 4 .2 ] .

Hình 24.2: Vi khuẩn lam Prochloron.

24.1.1. Các loại khí trong môi trường nước 24.1.1.1. O xì

O xi thường được khuếch tán vào nước từ khí quyển. V ùng nước ở càng xa bề mặt hoặc xa bong bóng khí [air bubble] thì tốc độ khuếch tán của oxi vào nước càng thấp. Chính vì vậy m ôi trư ờng nước là m ôi trường có tổc độ khuếch tán oxi thấp [low oxy diffusion envứonm ent]. T ốc độ khuếch tán của oxi vào hầu hết m ôi trường nước chỉ bằng khoảng 1/4000 tốc độ khuếch tán của oxi trong khí quyển [hinh 24.3]. Phần oxi khuếch tán trong nước được gội là oxi hòa tan.

Vi sinh vật

"V\ > 1 f r ,,

Môi trường Enzym ho hấp tế bào

Ranh giới với bề mặt bong bóng

1Ũ0.Ũ&]

ỉ Ic x

1,000

Không khí

Nước

Tê bảo

'1 100

Mòi tnrờng lỏng

Í0

Ranh giới với tế bào

! I

Nồng độ tại vị trí enzym

ai Tốc độ khuếch tán của oxi

Hình 24.3: Sự khuếch tán của oxi trong nước. Oxi khuếch tán với tốc độ nhanh trong không khỉ vờ tốc độ chậm trong nước

1/4000 tốc

độ trong không khỉ]. Mũi tên lớn chi lốc độ khuểch tán trong không khỉ. Màu đậm nhạt thể hiện nồng độ oxi. Sau khi khuếch tản qua không khi, oxi sẽ vượt qua ranh giới giữa không khi và nước, sau đó khuếch tản vào nước với tốc độ chậm [mũi íên nhỏ]. Từ nước, oxi sẽ vượt qua màng tế bào đế liếp

xúc

với enzym nội bào.

N ồng

độ oxi [ppm - phần

tr iệ u ] đ ư ợ c

thể hiện bằng

tỳ

lệ logarit,

lượng oxi có mặt ở vị trí của enzym có thể it hơn ỉ/1 000 000 lượng oxi trong không khí. [Theo Prescott-Harỉey-Kỉein, 2002]. Độ tan của oxi trong nước phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Ở nhiệt độ cao và áp suất thấp, tốc độ khuếch tán và độ hòa tan của oxi giảm đáng kể [bảng 24.1]. Vì tốc độ khuếch tán của oxi ữ o n g nước bị hạn chế, nên nếu như tốc độ sử dụng oxi của vi sinh vật lớn hơn tốc độ khuếch tán của oxi thì sẽ hình thành các vùng nước có lượng oxi thấp [hypoxic] hay thiểu oxi [anoxic]. V ùng nước này sẽ là nơi sống và phát triển của các vi sinh vật kị khí quang đưỡng và hóa dưỡng. N gược lại nếu vi sinh vật sống trong m àng nước cực mỏng hay gần vùng có không khí thi môi trường này là môi trường khuếch tán oxi nhanh [high oxy diffusion environm ent], giống như trong đất.

609

B ả n g 24.1: Ả

n h h ư ở n g c ủ a n h i ệ t đ ộ v à đ ộ c a o đ ế n n ồ n g đ ộ o x i h o à t a n [ r n g /L ] [ T h e o P r e s c o tt-H a r le y -K le in , 2 0 0 2 ]

Độ cao 50 vởi mặt biển [m] Nhiệt độ [°C]

1000

2000

3000

14,6

12,9

1 0 ,2

1 2 ,8

1 1 ,2

11,4 9,9

11,3

8 ,8

15 25 30 35 40

1 0 ,0

9,9 8,9

9,1

8 ,1

8 ,2

7,3

7 ,5

6 ,6

7,1 6,4 5,9

6,9

6 ,1

5,4

7,9

8,9 7,9 7,1 6,4 5,8 5,3 4,9

2 4 . 1 . 1 . 2 . C a c b o n i c [ C O 2]

CO 2 là loại khí chủ yếu th ứ hai, đóng vai trò quan trọng ừ o n g các quá trình hóa học và sinh học. Chúng tham gia vảo sự kiểm soát pH m ôi trường. Trong dung dịch đệm yếu, pH được duy trì ổn định trong m ột phạm vi nhất định nhờ thay đồi tỷ lệ giữa H C 0 3\ H 2 CO 3 và C O 2 [hình 24.4]. N ước cất không đệm có pH khoảng từ 5,0 đến 5,5; được quyết định bởi lưọrng CO 2 hòa tan trong nước cân bằng với không khí. N gược lại, đối với nước có đệm ở pH 8 , CO 2 hấp thu từ không khí vào nước sẽ tồn tại chủ yếu ở dạng HCO 3 " [hình 24.4]. Khi vi sinh vật tự dưỡng Jrong nước [chẳng hạn như tảo] sử dụng C 0 2 thì sẽ làm tăng pH của nước.

5.9

a.a

lũ

S.0

1ŨUQ

Hình 24.4: Mối liên hệ giữa pHvấ c o 2 hòa tan.

610

pH môi trường chịu cmh hường cùa hàm lượng C 02 hòa tan và tỳ lệ của C 02 so với ion HCO/ và CO} '. [Theo Prescott-Harìey-Kỉein, 2002]. 2 4 .1 .1 .3 , N i t ơ , h y d r o v à m e t a n

M ột số loại khí khác cững đóng vai trò quan trọng trong m ôi trường nước là nitơ, hyđro và m etan [CH 4 ]. Khí nitơ được vi khuẩn cố định nitơ sử dụng. K hí hydro vừa là khí thải và vừa là cơ chất quan trọng cho m ột số vi sinh vật. Tỉnh tan trong nước của ba loại khí này khác nhau, trong đó CH 4 có tính hòa tan thấp nhất. N gay sau khi được sinh ra từ môi trường kị khí, m etan sẽ khuếch tán lên trên và đi vào khí quyển. Do đó mà CH 4 là m ột khí thải lý tưởng vì có thể nhanh chóng loại bỏ chúng ra khỏi m ôi trường nước, tránh hiện tượng tích lũy chất thải gây độc như trường hợp chất thải là axit hữu cơ và am oniac [NH3].

24.Ỉ.2. Chất dinh dưỡng trong môi trường nước N ồng độ chất dinh dưỡng trong môi trường nước rất đa dạng, có thể là rất thấp tính theo fig chất hữu cơ/lít cho đến rất cao giống như ừong m ôi trường nuôi cấy ở phòng thí nghiệm [g/L]. N ồng độ chất dinh dưỡng'cao thường xuất hiện ở các môi trường ô nhiễm, tại các nhà máy xử lý nước thải... Sự thay đổi nồng độ chất dinh dưỡng có thể dẫn sự thay đổi quần xã vi sinh vật sống ờ đó, có thể chuyển từ vi sinh vật thích ứng nồng độ dinh dưỡng cao sang vi sinh vật thích ứng nồng độ dinh dưỡng thấp và ngược lại. Tốc độ thay đổi nồng độ chất dinh dưỡng cũng rất đa dạng. Ỏ đại dương rộng lớn, để thay đổi nồng độ chất dinh dư&ng cần hàng ừ ăm hoặc có khí hàng nghìn năm. N gược lại, ở các vùng đầm lầy và cửa sông thi tốc độ thay đổi lại khá nhanh, chính vi vậy cửa sông là nơi sống của quần xã vi sinh vật rất phức tạp thích ứng nhanh chóng với sự thay đổi nồng độ chất dinh dưỡng. Cột W inogradsky, do nhà khoa học người N ga Sergei N ikolaievich W inogradsky phát minh, dùng để chứng m inh mối tương tác của ví sinh vật và građien nồng độ ừong môi trường nước [hình 24.5]. Cột là bình thủy tinh hình trụ, bên trong chứa 3 lớp: lớp đáy là bùn [lấy từ đáy hồ hoặc sông] đã bổ sung Na 2 S 0 4, N a 2 C 0 3 và giấy vụn; lớp giữa là bùn thô và lớp trên cùng là nước [lấy ờ hồ hoặc sông]. Cột được đậy kín và để gàn ánh sáng [tạo điều kiện cho quá trình quang hợp]. Lúc đầu số lượng vi sinh vật không nhiều, sau một thời gian [ 2

- 3

tháng] thỉ sổ lượng vi sinh vật tăng lên rất nhiều, m ỗi loại vi sinh vật phát

triển m ạnh m ẽ ờ m ột khu vực nhất định trong bình.

Thành phần:

Y ~

"Nước

Vi sinh vật và phản ứng chính:

Vùng màu:

Nước ỊVAu ntiar [giàu02]

Tào Tà cát và vi khuẩn lam

Tảo và vi sinh vật oxi hóa HiS Beggiơtoa Thiobacìllus Thiothrix

W § M Ê Ê { 'ì

Quang dị dưỡng: Rhođospiriỉỉum Rhodopseudomonas

Bùn

] í‘

Chromatium Chlorobium

Cellulose -> sản phẩm lên men [Clostridium] Sản phẩm + S042‘-> H2S [Desulfovibrio]

Bùn, SO42', COj2\ giấy [cellulose]

Hình 24.5: Cột Winogradsky. Mô hình vi mô mô tà mối liên hệ giữa vi sinh vật và chất dinh dưỡng theo gradien nồng độ thảng đứng. Sàn phẩm lên men và s 2' đỉ chuyển từ vùng dưới lên, oxỉ đi chuyển từ trên xuống. Mô hình này giống hồ cỏ ỉởp lẳng cặn giàu dinh dưỡng. Ảnh sáng được cung cấp tới vùng kị khí phía dĩỉới giúp cho vi sinh vậí quang dưỡng ờ đỏ phát triển. [Theo Prescotị-Harỉey-Klein, 2002]. Ở đáy cột, xenluloz ờ dạng giấy vụn bị nhóm vi khuẩn sản phẩm lên m en. Vi khuẩn

D e s u ỉfo v ib r io

C lo s tr id iu m

phân hủy thành

sử dụng sản phẩm lên m en làm chất khử, SO 4 '

làm chất oxi hóa và sinh ra sàn phẩm phụ là H 2 S. H 2 S sẽ khuếch tán lên vùng nước bên trên, tạo nên gradien nồng độ H 2 S trong cột. Tiếp theo là sự phát triển m anh mẽ của vi khuẩn quang tự duõng kị khí

C h ỉo r o b iu m

và

C h r o m a tiu m

, do đó tạo vùng cỏ màu xanh

ôliu [olive] và tím . V i khuẩn quang tự dường này sử đụng H 2 S là chất khử cho điện tử, CO 2 [từ N a 2 C Ơ 3 ] là nguồn cacbon. Bên trên là lượng phong phú của các vi khuẩn tía không lưu huỳnh thuộc chi

R h o d o s p ir iu m

và

R h odopseudom ona.

V i khuần quang dị dưỡng này sử

dụng chất hữu cơ là nguồn cho điện tử và thường hoạt động ở vùng có nồng độ s 2* thấp hơn. Ở phần trên cùa cột, có m ặt cả oxi [do khuếch tán từ trên xuống] và H 2 S, là nơi hoạt

612

động của các ví sinh vật thích nghi khác, như vi khuẩn

B e g g ia to a

và

T h ỉo th r ỉx ,

chúng sử

dụng hợp chất lưu huỳnh dạng khử [H 2 S] là chất khử và oxi là chất oxi hóa. Phần trên cùng là nơi sổng của tảo cát và vi khuẩn lam. Vi sinh vật trong cột hoạt động tích cực m ột chiều vì nguồn chất khử ban đàu [xenluloz] lả có hạn. Khi dùng hết chất khử này, toàn bộ thành phần trong cột sẽ chuyển sang dạng oxi hóa, do đỏ mà vi sinh vật quang dưỡng phụ thuộc s 2" và các vi khuẩn kị khí khác sẽ không còn khả năng tồn tại trong hệ sinh thái vi mô này.

24.1.3. Chu trình dinh dưỡng trong môi trường nước Sinh vật phù du [plankton] là quần xã vi sinh vật sống trôi nổi trong nước, gồm 2 loại: thực vật phù du [tảo, vi khuẩn lam] và động vật phù du [vi khuẩn dị dưỡng, động vật nguyên sinh]. H ầu hết chất hữu cơ trong lớp nước bề mặt có nguồn gốc từ hoạt động quang tổng hợp, chủ yếu do thực vật phù du. Vi khuẩn ỉam

Synechococcus

là thực vật phù du rất

phổ biến, m ật độ của chúng có thể lên tới 104 đến 105 tế bào/m L ở bề m ặt nước. Loại vi khuẩn lam siêu nhỏ này có thể chiếm tới

- 80% tổng số sinh khối thực vật phù du.

Sình vật 'bậc cao

Động vật phủ du

Động vật nguyên sinh

- > v A

: ;' ĩ f c

CO2 và chất khoáng

Kitov Phospho

Hình 24.6: Sơ đồ vòng dinh dưỡng của vi sinh vật trong nước [màu đỏ]. 613

Ở vòng này phần lớn chất hữii cơ là do thực vật phù du tổng hợp được qua quá trình quang hợp, sau đó được giải phóng dưới dạng chất hữu cơ hòa tan [DOM]. Chất hữu cơ hòa tan được vi khuẩn sử dụng, chuyển thành chất hữu cơ không tan [POM]. Động vật nguyên sinh sẽ tiêu hóa một phần vi khuẩn. Sau khi tiêu hóa, một phần chất dinh đường trong vi khuẩn và động vậí nguyên sinh bị khoáng hóa và quay trở ỉọi vòng dinh dưỡng vì sinh vật nhờ hoạt động của thực vật phù du. Do đó, chì một phần nhỏ chất d i n h dưỡng là sẵn có cho sình vật bậc cao sử dụng. Mũi tên chỉ hướng đi của chất dinh dưỡng và vị trí phân bố cùa sinh vật trong vòng, N - nitơ, p - photpho. [Theo Prescott-Harỉey-Kỉein, 2002]. Trong quá trình sinh trưởng và cố định CƠ 2 thành hợp chất hữu cơ, thực vật phù du thu nhận nguồn nitơ và photpho từ nước. Thành phần chất dinh dưỡng ữ ong nước ảnh hưởng tới tỷ lệ cacbon: nitơ: photpho [C: N: P] trong thực vật phù du, tỷ lệ này gọi là tỷ lệ Redfield [đặt theo tên nhà sinh học biển A lfred c . Redfield]. K hi chất dinh dưõng dồi dào, tỷ lệ C: N: p ở hầu hết thực vật phù du lã 106:16:1. Tỷ lệ R edíĩeld đóng vai trò quan trọng ừong theo dõi quá trinh động học của các chất dinh dưõng [nhất là sự khoáng hóa và sự cố định các chất] v à ừ o n g nghiên cứu các nhân tố hạn chế sinh trưởng vi sinh vật [nhất là sự m ẫn cảm của quá trình quang hợp đối với việc bổ sung nitơ, lưu huỳnh và sắt từ khí quyển vào nước]. Khi thực vật phù du phát triển thì chất hữu cơ cố định được nhờ quá trình quang hợp sẽ đi vào vòng dinh dưỡng vi sinh vật [thực vật phù du còn được gọi là sinh vật sản xuất] [hình 24.6]. V òng dinh dưõng vi sinh vật [m icrobial loop] là chu trình dinh dưỡng xảy ra trong quần thể vi sinh vật. Chất hữu cơ cố định được sau đỏ sẽ được sử dụng và trở lại dạng CO 2 v à chất khoáng. C ụ thể là chất hữu h òa cơ tan [DOM ] [axit am in , đường, axit hữu cơ, axit n u c le ic ...] do thực vật phù đu giải phóng ra sẽ là nguồn thức ăn cho vi khuẩn dị dưõng. N hư vậy, chất hữu cơ hòa tan đã được chuyển thành chất hữu cơ không tan [POM ] [các đại phân tử tham gia cấu trúc tế bào như thành tế bào, m àng tế b à o ... ]• V i khuẩn dị dưõng lại là nguồn thức ăn của sinh v ật ăn m ồi có kích thước lớn hơn như động vật nguyên sinh, động vật đa bào. C O 2 và chất khoáng có nguồn gốc từ sinh vật ăn m ôi lớn sẽ quay trở lại vòng dinh dưỡng vi sinh vật nhờ hoạt động của thực vật phù dư. Sự quay vòng nhanh chóng của chất dinh dưỡng giữa sinh vật sản xuất và sinh vật bậc cao hơn như cá làm giảm đáng kể năng suất sinh học của hệ sinh thái. N ghiên cứu cho thấy ở m ôi trường nghèo đinh dưõng thi nguồn cacbon bị thất thoát lớn hơn là ờ m ôi trường phì dưỡng. V òng đinh dưỡng vi sinh vật hoạt động m ạnh mẽ nhất ứ ong m ôi trường hiếu khí vì ở đó có sự phát triển của cả vi khuẩn quang hợp và sinh vật bậc cao. Khi có quá nhiều chất hữu cơ trong nước, nước thườ ng có m ùi khó chịu do hoạt động cùa vi sinh vật kị khí, điều này ức chế sự tồ n tại củ a sinh vật bậc cao như cá. Liệu pháp chính là phải hạn chế nguồn

614

hữu cơ đầu vào, khôi phục đần tình trạng môi và cá.

tr ư ờ n g ,

tạo điều kiện sống sót cho động vật

Các khu nuôi động vật, đặc biệt là những nơi gần cửa sông và ven biển là m ôi trường có nguồn chất hữu cơ phong phú, do đó ảnh hưởng tới nồng độ oxi và hoạt động của vòng dinh dưỡng vi sinh vật. Hàng năm, ở các cơ sở nuôi gia súc bò, lợn và gia cầm ở M ỹ và các nơi khác trên Thế giởi thải ra khoảng í triệu tấn phân chuồng.

24.2. QUẰN XÃ VI SINH VẬT NƯỚC Nước cung cấp m ôi trưởng sống và hoạt động cho rất nhiều vi sinh vật [bảng 24.2]. Đa dạng vi sinh vật nước do nhiều yểu tố tạo nên, bao gồm: loại chất dinh dưỡng, nồng độ chất dinh dưỡng, nồng độ oxi, sự có mặt của các chất oxi hoá và chất khử ừong môi trường nước. Thêm vào đó, khi ánh sáng xuyên tới vùng nước kị khí bên dưới sẽ tạo điều kiện cho m ột số vi sinh vật đặc biệt có khả năng quang hợp phát triển. Trong phần này sẽ trình bày về những trường hợp đặc biệt của vi sinh vật thích nghi với môi trường nước. B ản g 24.2:

S i n h v ậ t n h â n s ơ th ư ờ n g g ặ p ở m ô i tr ư ờ n g n ư ớ c b iề n v à n ư ớ c n g ọ t. [ T h e o P r e s c o tt-H a r le y -K ỉe ỉn , 2 0 0 2 ]

Nhóm

Chi

Nhóm

Chi

Quang tự dưỡng

C h ĩo r o b iu m

Hóa tự dưỡng

B la s to b a c te r

C h ỉo r o h e r p e to n

C a u lo b a c te r

C h r o m a tỉu m

F le x ib a c te r

P e ỉo d ic ty o n

F le x ith r ix

T h io d ỉc ĩy o n

G e m m o b a c íe r

T h io p e d ia

H y p h o m ic r o b iu m L e u c o th r ix

Sphaerotiỉus Quang dị dưỡng

C h ỉo r ọ ỷ ĩ e x u s

Hóa dị dưỡng

B e g g ia to a

H e ỉio b a e te r iu m

G a ỉỉio n e ỉla

H e ìio th r ix

T h ìo p ỉo c a

R h o d o c y c lu s

T h io th r ix

R h o d o m ic r o b iu m

T h io v u h tm

R h o d o p seu d o m o n a s R h o d o s p ir ilỉu m

M ột trong những khám phá hấp đẫn nhất gần đây là sự tồn tại của m ột số lượng lớn vi khuẩn siêu nhỏ ừong m ôi trường nước, nhất là nhóm qua màng lọc có kích thước lỗ là 0,2 um].

S p h in g o m o n a s

[cỏ thể dễ dàng đi

có thể tích tể bào khoảng 0,08

Ịjm3, chiếm đại đa số trong môi trường nước [và trong đất], m ật độ của chứng có thể lên tới

615

10 12 - 10 13 tế bào/gam hoặc m L nước, chiếm m ột phần đáng kể trong tổng sinh khối trong m ôi trường. C húng có thể sử dụng nhiều loại hợp chất hữu cơ khác nhau và có thể phát triển trong m ôi trường nghèo dinh dưỡng. Do có kích thước nhỏ bé nên lượng thức ăn chúng tiêu thụ cũng rất ít. Đặc tính này giúp cho

có thể sống sót trong rất

S p h in g o m o n a s

nhiều loại m ôi trường khác nhau. M ột loại vi sinh vật biển khác thường khác là vi khuẩn

T h io m a r g a r ìta n a m ỉb ie n s is ,

tên của chúng có nghĩa là “Hòn ngọc lưu huỳnh của N am bia” [sulfiia pearl o f Nambia]. N gười ta tìm thấy vi khuẩn này ở ngoài khơi N am ibia, bờ biển phía Tây của Châu Phi. Bên trong tế bào vi khuẩn chứa rất nhiều hạt lưu huỳnh dự trữ m àu trắng [hình 24.7]. Vi khuẩn này được coi là vi khuẩn lớn nhất hành tinh. Đường kính trung bình của tế bào từ 100 - 300 [im [đôi khi lớn tới 750 [am]. Vi khuẩn này sử dụng S ' 2 là chất khử và N O 3 ' là chất oxi hoá. Chúng thường sống trong lớp bùn giàu s 2' dưới đáy biển. Vậy chúng thu nhận nguồn NƠ 3 ‘ bàng cách nào? Khi xảy ra bão, lớp nước biển phía ừên chứa N O 3 ' sẽ trộn lẫn với lóp bùn ở đáy. Vi khuẩn này nhanh chóng thu lấy N O 3 " vào ừong tế bào và dự trữ trong các không bào lớn, các không bào này cỏ thể chiếm tới 98% thể tích tể bào. N ồng độ NO 3 ’ trong không bào có thế đạt tới 800 mM. Các hạt lưu huỳnh được phân bố ở m ép tế bào, nằm ngay dưới màng sinh chất. Khi không có bão, vi sinh vật sử dụng lượng N C V dự trữ. Các vi sinh vật đặc biệt này đóng vai trò quan trọng trong vòng tuần hoàn lưu huỳnh và nitơ tại môi trường sinh sống của chúng. C húng giúp loại bỏ các khí độc trong nước, tạo môi trường thân thiện cho cá v à các động vật biển khác phát triển.

H ìn h 2 4 .7 : V ỉ k h u ẩ n lớ n n h ẩ t h à n h tin h T h ỉo m a r g a r ita n a m ib ie n s ỉs , T ể b à o c ỏ đ ư ờ n g k i n h t r u n g b ì n h t ừ ỉ 0 0 - 3 0 0 fs m [ đ ô i k h i l ở n t ở i 0 , 7 5 m m ] , g ấ p 1 0 0 l ầ n k í c h th ư ớ c c ù a v i k h u ẩ n th ô n g th ư ờ n g . V i k h u ẩ n đ ộ c b iệ t n à y s ử d ụ n g

nõng lượng và 2002].

N O i

s2'

[ở lớp nước phía trên] là chất nhận điện tử.

t ừ lẳ n g c ặ n ở đ á y ỉà n g u ồ n

[T h e o

Prescott-Harìey-Kleỉn,

Hĩnh 24.8: Vi khuẩn Thỉopìoca. Thiopỉoca là sình vật khác thưởng, chủng có khả nâng thu nhận 2 nguồn vật chất có vị trí phân bố riêng biệt [S2' từ bùn và NO ị từ lớp nước bên trên] [a] Từng bó vì khuẩn nằm giữa bề mặt hiểu khí và bùn kị khí bên dưới; [b] Tể bào Thiopỉoca chứa các hạt lưu huỳnh ở đầu nhọn. [Theo Prescott-Harìey-Kỉein, 2002]. M ột kiểu thích nghi quan trọng của vi sinh vật trong nước là có khả năng sử dụng các nguồn vật chất nằm ở các vị trí khác nhau hay ở cùng vị trí nhưng trong m ột thời gian rất ngán [trong cơn bão]. M ột trong những vi khuẩn có khả năng thu nhận các nguồn chất nằm ở các khu vực khác nhau lả

T h io p ỉo c a

spp. Vi khuẩn

T h io p ỉo c a

sống thành bó

được

bao

quanh bời m ột vỏ chung [hình 24.8]. Chúng được tìm thấy ở bài ngầm ngoài bờ biển Chile,

đây là vùng nước có nồng độ oxi thấp nhưng nồng độ NO 3' cao và tiếp giáp với bùn ờ đáy có nồng độ s 2’ cao. Tế bào vi khuẩn có đường kính từ 15 - 40 |am và dài khoảng vài cm, do vậy mà chúng cũng là m ột trong những vi khuẩn lcm nhất hành tinh, c ấ u trúc dạng sợi giúp chúng có thề trượt sâu xuống 5 -1 5 cm trong lớp bùn giàu s 2*bên dưới dể thu nhận s 2\ M ột số vi sinh vật lại thích nghi với nơi sống ở bề mặt nước. Đ ây là các vi sinh vật không chuyển động Sphaerotữus và chi

C a u ỉo b a c te r

và

bacteria] ưa khí như

L e u c o th r ix ,

H y p h o m ic r o b iu m . F le x ith r ix

và

và vi khuẩn sinh sản nhờ nảy chồi thuộc

Ngoài ra, m ột loạt các vi khuẩn trượt [gliding

F le x ib a c te r

có thể trượt trên bề m ặt nước để thu nhận

chất hữu cơ. Đây là các vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, mặc đù đôi khi chúng cũng có thể thực hiện quá trình phản nitrat hóa như trường hợp cửa

H y p h o m ìc r o b iu m .

N goài ra, vi khuẩn

cũng có thể hình thành các khuẩn lạc trên m ặt nước, tạo điều kiện cho các vi sính vật khác bám vào, dẫn đến sự hình thành màng sinh học có cấu trúc phức tạp. Vi nấm [m icrofungi] thường sống ở đất, quà, thức ăn; ngoài ra chúng còn sinh trưởng ừong môi trường nước ngọt và m ôi trường nước biển. Nấm sính bào tử động thích nghi với

617

m ôi trường nước, bao gồm C h y tr id ia ỉe s

O o m y c e te s

[ sinh sàn vô tính bằng bào tử động 2 roi] và

[sinh sản vô tính bằng bào tử động 1 roi]. N ấm

C h y ír id ia ỉe s

đóng vai trò quan

trọng trong m ôi trường vì chúng thực hiện quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ chết. Chúng cũng gây bệnh lùn ở khoai tây và ký sinh ở động vật không xương sổng, đặc biệt là giun tròn v à m uỗi. N goài ra nhiều nấm C h y tr ìd ỉa ỉe s

C h y tr ỉd ìa ỉe s

còn làm chết tảo. G ần đây nấm

được tìm thấy trong tế bào da của động vật lưỡng cư. Sự ký sinh này làm cho

ếch vả cóc bị chết ở nhiều nơi trên Thế giới như Mỹ, ú c , và Trung Mỹ. N ấm thuộc loài

B a tr a c h o c h y tr ỉu m d e n d r o b a tid is

C h y tr id ia le s

là m ột trong những nấm chủ yếu làm chết ếch.

T n r a c n a e tu m

A a to tp o a

L a m o n /ltn

O tỲ M tữ tp a r a

A c tín o ề p o r *

[a]

[b] H ìn h 2 4 .9 : C á c n ấ m c ó k h ả n ă n g h ìn h th à n h b à o t ử d ư ớ i n ư ớ c . N ấ m n ư ớ c n à y g i ữ v a i t r ỏ q u c m t r ọ n g t r o n g p h â n h ủ y c á c c h ấ t h ữ u c ơ p h ứ c tạ p , n h i r l á c â y

r ơ i ở s u ố t h ồ . C h ú n g h ìn h th à n h b à o t ứ đ ín h đ ặ c b iệ t [4 b à o t ừ đ in h c h ụ m đ ầ u ], [a ] c ấ u tr ú c b à o t ử đ ỉn h ; [b ] S ợ i n ấ m đ â m s â u v à o t r o n g l ả đ a n g b ị p h â n h ủ y . B à o t ử m ớ i đ ư ợ c h ìn h th à n h , g ià i p h ó n g v à o n ư ở c , b ả m v à o b ề m ặ t lá , l ặ p l ọ i c h u t r ì n h [ T h e o P r e s c o t t - H a r ỉ e y - K ỉ e i n , 2 0 0 2 ] .

M ột nhóm nấm quan trọng khác là nấm sợi có khả năng hình thành bào tử dưới nước gồm cả nấm thuộc nhỏm

H y p o m y c e te s .

N ăm 1942

c.T. Ingold đã tim thấy m ột loại nấm

hình thành cấu trúc bào tử đính đặc biệt [4 bào tử đính xếp chụm đầu [tetraradiate]] [hỉnh 24.9a]. Sinh thái của các nấm nước này rất thú vị. Sợi nấm sinh dưỡng đâm sâu vào và phân hùy lá, bào từ đính được hình thành bên ngoài lá từ sợi sinh dưỡng [hình 24.9b]. Sau đó bào tử sẽ phát tán nhờ nước, thường xuất hiện ở bọt nước bề m ặt. Khi tiếp xúc với ỉá

cây, bào tử bám vào và phát triển thành sợi nấm. Loại nấm có kiểu thích nghi độc nhất này có ý nghĩa lớn trong quá trình phân huỷ hợp chất hữu cơ, đặc biệt là lá cây. Các côn trùng nước thường chỉ ăn lá có nấm mọc bên ừong nghĩa là lá đã được sơ chế. M ột trong những phát hiện đáng chú ý là sự tồn tại của nhóm vì sinh vật đặc biệt đó là vi khuẩn cổ [Archaea]. B ằng phương pháp so sánh chuỗi rARN [thành phần bảo thủ ữong quá trình tiến hóa], người ta xác định được có khoảng

1 /3

sinh vật phù du siêu nhỏ ở

đại dương [tế bào có kích thước nhỏ hom 2 Ịim] là vi khuẩn cổ. Vi khuẩn cổ là nhóm tể bào nhân sơ đặc biệt, bề ngoài giống vi khuẩn nhưng m ột số thành phần cấu tạo và rA RN lại gần vói tế bào nhân thật hơn. N hiều vi khuẩn cổ sống được trong điều kiện bất lợi như suối nước nóng, rãnh thủy nhiệt đáy biển, nơi có nồng độ muối cao và độ axit cao.

5|im H ìn h 2 4 .1 0 : P h á t h iệ n v i k h u ẩ n c ố b ằ n g p h ư ơ n g p h ả p s ử d ụ n g đ ầ u d ò . Đ ầ u d ò đ á n h đ ẩ u h ụ ỳ n h q u a n g đ ư ợ c s ử d y n g đ ể p h á t h iệ n v i k h u ẩ n c ố [ h ìn h tr ê n ] tr o n g tổ n g s ố t ế b à o n h â n s ơ [ h ì n h d ư ớ i ] ở m ẫ u n ư ớ c b i ề n s â u b ằ n g k ỉ n h h i ể n v i. [ T h e o P r e s c o t t - H a r l e y - K ỉ e i n ,

2002]. V i khuẩn cổ và vi khuẩn phù du có mặt trong cả môi trường nước ngọt, nước biển và ở đảy đại dương. Sử dụng kỹ thuật FISH có thể phát hiện các nhóm vi khuẩn khác nhau trong cùng m ột mẫu. Trong kỹ thuật này, đầu dò [đoạn ngắn A D N ] đặc hiệu đổi với từng loại [vi khuẩn cổ và tế bào nhân sơ tổng số] được đánh dấu bởi các m àu huỳnh quang khác nhau, sau khi lai tại chỗ [in situ] với phân tử đích, đầu dò sẽ được phát hiện bằng các bước sóng kích thích khác nhau [hình 24.10]. M ật độ vi khuẩn nhiều hom ở vùng bề m ặt, nhưng từ độ sâu

100

m ứ ở xuống đáy thì vi khuẩn cổ chiếm ưu thế [hình 24.11]. N hìn chung, hơn

90% các tể bào bát m àu thuốc nhuộm và có thể được phát hiện bằng cách sử đụng các đầu dò và bước sóng khác nhau.

619

Hình 24.11: Sự phân bố của vi khuẩn cổ ớ đại diỉơng. Vi khuẩn cổ vò vi khuẩn phân bố tới đọ sâu 3400 m ở Thải Bình Dương, đáng chủ ý ĩà vi khuẩn cổ chiếm một phần lớn trong sổ các sinh vật phù du siêu nhó quan sát đirợc ở vùng ngay dirới bể một. [Theo Prescott-Harỉey-Kìein, 2002]. Môi trường nước còn có chứa m ột ỉượng lớn virưt. Các virut có mật độ cao hơn 10 lần so với vi khuẩn và hầu hết virut sống trong nước là thực khuẩn thể. Các virut phù du là một phần quan trọng của quần xã vi sinh vật biển. Chúng có thể gây ánh hưởng tới hoạt động cùa vòng đinh dưỡng vi sinh vật và tham gia vào sự chuyển gen ngang giữa các vi khuẩn và điều khiển sự đ a dạng của quần xã vi sinh vật. Vi sinh vật luôn chuyển động v à luôn được bổ sung vảo môi trường nước. Vi sinh vật biển cỏ thể đi vào khí quyển v à quay trở lại biển tại vị trí khác nhờ sự chuyển động không ngừng của không khí. V i sinh vật ở sông có thể di chuyển hàng ngàn dặm từ vùng núi cao đến đại dương. Ở các hồ, sự tháo nước v à bổ sung nước có thể xảy ra. Ở đại dương, chuyển động v à tuần hoàn của nước có thể xảy ra qua hàng thế kỉ. V i sinh vật bám trên xác động vật và cá có thể chuyển động cùng cơ chất của chủng. Đôi khi, các xác động vật lớn như cá voi sẽ lắng xuống thềm đại dương sâu hàng ngàn mét. X ác cá voi nằm ở thềm đại dương, tạo cơ hội cho các động vật ăn thịt và vi sinh vật phát ưiển. Q uá trình phân hủy xác cá voi được chia làm nhiều giai đoạn [hình 24.12].

620

Vật chat có thế di chuyến đi rát xa trong môi trường mrớc. Chất dinh dường và vi sinh vật có thể được chuyển đến khu vực mà bình thường chúng không có mặt, tạo ra ốc đảo với quần xã vi sinh vật bị biến đổi. [ơ] Giai đoạn ăn thịt cùa sinh vật di cư [0 - 6 tỉ' ~Tg]; [b] Giai đoạn phát triển cùa vi sinh vật

hóa tự dưỡng [ 1- 2 năm]; [c] Giai đoạn phái triền cùa sinh vật cơ hội. [Theo Prescott-Harley-Kỉein, 2002]. Giai đoạn đầu là quá trình ăn thịt của các sinh vật di cư, kéo dài khoảng từ 0 2

tháng. Giai đoạn 2 kéo dài 1 -

nãm, trong đó s 2' được giải phóng từ xương tạo điều

kiện cho sinh trưởng của vi sinh vật hoá tự dưỡng. Sau 2 [b

3 năm, là giai đoạn phát triển m ạnh của các sinh vật cơ hội. Các giai đoạn này dẫn đến sự tăng lên liên tục lượng sinh vật ở đại dương, đặc biệt là cảc vi sinh vật ở các nơi khác. Bụi và lắng cặn từ các vùng đất ở xa liên tục rơi vào nirớc và băng, đây là kết quả của gió và bão. Thông qua các quá trình vận chuyển nhờ khí quyển, các vi sinh vật

thường xuyên chuyển động xuyên suốt các vùng trên Trái

Hình 24.12: sổ phận cùa xảc cá voi ờ đáy đại dương.

đất, Nghiên cứu gàn đây cho thấy vi sinh vật phân lập trong các lắng cặn ở đáy biển sâu giống với vi sinh vật

sống trên bề m ặt đất. M ột ví dụ khác là bụi từ vùng Sahara của Châu Phi dẫn đến sự phá hủy của rặng san hô vùng Caribbea, điều này xảy ra là do nấm và tảo trong đất có khà năng trôi đạt trong khí quyển tới các vùng khác nhau trên Trái đất. 24.3. M Ô I T R Ư Ờ N G N Ư Ớ C B IẺ N Môi trường nước biển ở đại dương chiếm 97,2% tổng lượng nước toàn cầu. Đại dương có độ sâu khá lớn, phần nước ở độ sâu 1000 m trở xuống chiếm 75% thể tích đại đương. N ơi sâu nhất của đại dương là 11 000 m. Phần nước dưới độ sâu 100 m thường có nhiệt độ ổn định là 3°c. Cứ xuống sâu 10 m thì áp suất nước biển tăng 1 atm, ở nơi sâu nhất của đại dương áp suất có thể đạt tới sấp xỉ 1000 atm. M ôi trường nước biển còn được đặc trưng bởi độ m ặn [3,3 - 3,7%]. Sự hòa ưộn và chuyển động của nưóc biển là đo thủy triều, dòng chảy, chuyển động nổi lên theo nhiệt độ, g ió ... Vi sinh vật sống trong môi trưèmg nước biển chịu tác động cùa áp suất, có thể thấy được mổi tương quan giữa vi sinh vật và áp suất [hình 24.13]. M ột số vi khuẩn có khả năng

621

tồn tại ưong phạm vi dao động án suất từ 0 - 400 atm, tuy nhiên chúng thường phát triển tốt nhất ở áp suất khí quyển. N hiều vi khuẩn sinh truởng tố t ở áp suất cao v à được gọi là vi s in h v ậ t ư a á p

[barophile].

V i s in h v ậ t ư a á p tr u n g b ìn h

[moderat barophỉle] sinh trưởng tốt

nhất ở 400 atm , tuy nhiên chúng có thể tồn tại ở 1 atm.

V i s in h

vật ưa ảp

cực đoan

[extrem e barophile] chi có thể phát ừ iển ở áp suất cao. Sự thay đổi áp suất có ảnh hưởng rất lớn tới các quá trình sinh học của vi sinh vật như phân bào, lắp ráp tiên m ao, tổng hợp A D N , vận chuyển chất qua m àng, sinh tổng hợp p ro tein ... Các protein hình thành kênh vận chuyển vật chất ờ m ảng thường hoạt động có hiệu quả ở m ột áp suất nhất định. V i sinh vật biển còn chịu ảnh hưởng của ánh sáng. N gười ta chia đại dương thành 2 vùng: vùng có ánh sáng [có thể quang hợp] và vùng không có ánh sáng [không thể quang hợp]. H ầu hết chất dinh dưỡng ở đại dương xuất hiện trong vùng nước từ bề m ặt tới độ sâu 300 m. Đây là vùng ánh sáng có thể xuyên tới, ở đây có sự phát triển của thực vật phù du [tảo và vi khuẩn lam]. Sinh khối thực vật phù du từ từ rơi xuống đáy đại dương trông giống như “tuyết biển”. C huyến đi này của thực vật phù du thường kéo dài ít nhất m ột tháng. Chỉ có 1 % chất hữu cơ cỏ nguồn gổc quang tổng hợp tới được thềm đại dương, phần còn lại bị phân huỷ ứ ong quá trình roá xuống. N guồn dinh dưỡng tại đáy đại dưomg rất hạn chế vì vậy đây là vùng tồn tại các vi sinh vật có khả năng phát triển trong điều kiện nghèo dinh dưỡng.

E 3

‘S ‘p Q

H ìn h 2 4 .1 3 : S ự p h â n b ố c ủ a v i s in h v ậ t v à á p s u ẩ t ở m ô i tr ư ờ n g b iể n , S ự p h â n b ố c ủ a v i s in h v ậ t d ự a v à o k h ả n ă n g c h ịu ả p s u ẩ t ở c á c đ ộ s â u k h á c n h a u : c h ịu áp, u a á p , c ự c ư a á p . Ả p s u ẩ t c a o n h ấ t là Ị 1 0 0 a tm ở n ơ i s â u n h ấ t c ủ a đ ạ i d ư ơ n g . Ả n h s ả n g c h i x u y ê n q u a ĩ ở p n ư ở c m ò n g ở v Ù T ỉg s á n g . [ T h e o P r e s c o t t - H ơ r ỉ e y - K l e i n , 2 0 0 2 ] .

622

Chu trình cacbon ở trong môi trường biển vẫn chưa được nghiên cứu kỹ, tuy nhiên một điều rõ ràng là vi sinh vật có ảnh hưởng lớn tới chu ừình cacbon ở đây [hỉnh 24.14]. Phần lớn cacbon hữu cơ tan có tuổi trung bình dự đoán là hơn 1000 năm. Chẩt hữu cơ ở đáy biển cũng có độ tuổi tương tự. Ngoài cacbon hữu cơ tan, m ột lượng khổng lồ cacbon tồn tại dưới dạng tinh thể m etan hydrat trong lắng cặn đại dương. Ở thềm đại dương có độ sâu dưới 500 m, ừong m ôi trường nhiệt độ thấp và áp suất cao, phân tử nước kết tinh tạo dạng

tổ

ong bền vững và khép kín để giữ khí metan bên trong,

cỏ

tới 10 000

tỉ X

1000 kg

cacbon tồn tại dưới dạng kết tính metan hydrat trên toàn Thế giới [gọi là m ỏ m etan hydrat], gấp 80 000 lần nguồn khí tự nhiên dự trữ hiện nay trên Thế giới. Chu trình nitơ và lưu huỳnh cũng đóng vai trò quan trọng ứong m ôi trường nước biển và tác động lớn đến các quá trình ở mức độ toàn cầu. Hàm lượng nitơ trong nước biển thường dao động, ở vùng nước biển chứa nồng độ oxi thấp thì sẽ xảy ra hiện tượng phản nitrat hóa [sử dụng N O 3 ' và N O 2 ' là chất oxi hỏa và giải phóng nitơ vào khí quyển] đẫn đến làm giảm tỷ lệ N: p ừong nước. Ngược lại, sự cố định nitơ xảy ra m ạnh mẽ sẽ làm tăng lượng nitơ trong nước. Điều này cho thấy nitơ chứ không phải photpho đã hạn chế các hoạt động sinh học trong m ôi trường biển. Chu trình lưu huỳnh ở đại dương cũng có tác động lớn đến các quá ư ình ở m ức độ toàn cầu. Dimetylsulfite [DM S], được tổng hợp bởi tảo, có thể được giải phóng vào khí quyển và chiếm 90% tổng sổ hợp chất chứa lưu huỳnh bay hơi trong chu trình. Khi D M S bị oxi hoá thì sản phẩm cuối của chúng có thể ảnh hưởng đến độ axit của khí quyển cũng như nhiệt độ Trái đất và sự hình thành mây. N hư trình bày ở trên, tinh thể metan hydrat được tìm thấy ở điều kiện nhiệt độ thấp và áp suất cao ở nhiều đại dương. M ột số vi khuẩn ưa lạnh có khả năng sử dụng tinh thể metan hydrat, sau đó lại là nguồn thức ăn cho

H e s io c a e c a m e ta n ic o ỉa .

Trong quần xã vi

khuẩn phức tạp ở đại dương, vi khuẩn cổ là sinh vật thực hiện quá trinh chuyển hoá CH 4 trong điều kiện nồng độ hydro thấp và cỏ m ặt SO 4 2'. Đây là quá trinh phần hủy CH 4 [ngược vởi quá trinh sinh C H Ạ M ột phần lớn m ôi trường nước biển được bao phủ bởi băng. Ở vùng địa cực vào m ùa đông thì lớp băng này bao phủ 7% bề mặt Trái đất. Vi sinh vật có khả năng sinh trưởng ở vùng nằm giữa băng và nước biển [hình 24.15]. N gười ta phát hiện thấy m ột lớp vi sinh vật ở phần dưới tảng băng nơi tiếp giáp với nước biển. Các vi sinh vật có m ặt ở đây thuộc các chi P s y c h r o fle x u s , ỉc e o b a c te r , P o ỉib a te r

và

P o ia r o m o n a s , M a r in o b a te r ,

P s y c h r o m o n a s a n ta r tic u s .

623

Khíquyỉn

Hấp thu và giâĩ phóng co* Thời gian irở tại khi quyển Ngày-tháng

K ẵm - th ế kỳ

H ì n h 2 4 . 1 4 : C h u t r ì n h c a c b o n ở đ ạ i d it ơ n g . V i s in h v ậ t ở đ ạ i d ư ơ n g tá c đ ộ n g đ ế n c h u tr ìn h c a c b o n to à n c ầ u v à m ố i liê n h ệ g iữ a đ ạ i d ư ơ n g v à k h i q u y ế n . H ầ u h ể t s ụ b i ể n đ o i c ù a c a c b o n x ả y r a ở v ù n g n ư ớ c b ề m ặ t, c h ấ t h ữ u c ơ k h ô n g t a n [ P O C ] , c h ẩ í h ữ u c ơ h ò a t a n [D O C '] v à m e t a n h y d r a t ỉ à n g u ồ n c a c b o n c h í n h ờ đ ợ i d ư ơ n g . Đ ạ i d ư ơ n g c ò n c h ứ a H C O / v à C O ĩ h ò a ta n c ỏ n g u ồ n g ố c t ừ k h i q u y ể n . M e ta r ị h y d r a t k íc h th íc h s ự p h á t tr iể n c ủ a m ộ t s ố d ạ n g v i s in h v ậ t v à s â u b ă n g n h iề u c h â n . [T h e o P r e s c o tu H a r le y - K ỉe in , 2 0 0 2 ]

Do Sự bổ sung chất hữu cơ từ đất liền nên sổ lượng vi sinh vật tổng số ở vùng bờ biển nhiều

hơn

là ở vùng giữa biển. Sự gia tăng dân số và m ở rộng thành thị tại các khu

vực ven biển đã dẫn đến hiện tượng ô nhiễm. Ở vùng nước ven biển [như biển Baltic, cừa biển Long Island Sound, vịnh Chesapeake và Đ ịa Trung Hải], do hạn chế trong hòa ưộn với các phần khác cùa đại dương nên có dấu hiệu tích lũy nhiều chất hừu cơ v à vi sinh vật có hại. Điển hình là quá trình ô nhiễm ảnh hưởng đển động vật có vỏ ở các vùng biển bị đô thị hóa. Vài năm trước đây, động vật có vỏ có thể đánh bát được khá đễ dàng sau những trận mưa. Tuy nhiên hiện nay thi cần phải chờ khoảng 1 tuần sau m ưa mới có thể đánh bắt

đê loại bỏ các vi sinh vật gây ô nhiễm. Điều này tác động đển đời sống của cư dân sống nhờ đánh bắt động vật có vỏ.

Hình 24.15: Vi sinh vật trong lớp băng ở biển. Thỏi băng lấy từ Nam Cực tiếp giáp với nước biển. Dài tối [mũi tên] là quần xã vi sinh vật. [Theo Prescott-Harỉey-Kỉein, 2002]. Ở vịnh M exico, tại châu thổ sông M ississippi, việc giải phóng chất dinh dưỡng từ các thành phố vào sông thúc đẩy sự phát triển của vi khuẩn và làm cạn kiệt oxi. Điều này tạo nên “vùng chết”, đó là vùng không có oxi, diện tích vùng này rất lớn có thể lớn hơn bang New Jersey của Mỹ. Khi nồng độ oxi giảm xuống, động vật có vỏ không thể sống sót, dẫn đến phá huỷ nền kinh tế của các vùng sổng nhờ vào nuôi hải sản. M ột vấn đề khác liên quan đến nước biển là sự phát triển m ạnh mẽ của tảo hay còn gọi là hiện tượng “nở hoa” của tảo. Hiện tượng này xảy ra trong điều kiện nước phì dưỡng và khí hậu phù hợp [ẩm, nắng, yên tĩnh]. Trong điều kiện nêu trên thi tảo hoặc vi khuẩn lam phát triển mạnh mẽ dẫn đển hiện tượng nở hoa [hiện tượng này thường xuất hiện theo chu kỳ ở biển và hồ]. Khi xảy ra sẽ làm giàm chất lượng nước vỉ nưỏc thường có váng, mùi khỏ chịu và không còn thích hợp cho mục đích giải trí và thậm chí còn nguy hiểm cho đánh cá, du thuyền và bơi lội. Trường hợp xấu nhất là sự nở hoa của tảo độc, còn gọi là “thuỷ triều đỏ” [red tit]. Sự xuất hiện của thuỷ triều đỏ ở Thái Bình D ương ngoài bờ biển trung tâm California đã làm cá heo bị chết hàng loạt. Loại tảo chính gây nên sự thiệt hại lớn cho động vật biển này là

P s e u d o - n i t z s c h i a [,h ì n h 2 4 . 1 6 ] .

Động vật trung gian chính là cá cơm

biển. Cá cơm ăn tảo, tảo chứa lượng lớn chất độc thần kinh neurotoxin, axit domoic. Cá heo ăn phải cả cơm nhiễm độc sẽ bị chết.

625

Hình 24.16: Tảo Pseudo-nitzschia. Ngoài hiện tượng thủy triều đỏ, tảo còn gây ra m ột sổ vấn đề khác. V í dụ điển hình là loại tảo có roi

P fie s te ia p is c ỉc ỉd a

[hình 24.17], loại tảo này tiết độc tố gây tê liệt và chết cá

ờ vùng biển từ tiểu bang M aryland sang phía N am cùa b ờ biển Đại Tây D ương của Mỹ. Ngoải ra, nếu người tiếp xúc với độc tố này sẽ bị chóng m ặt và m ất trí nhớ.

p fle s te ia

có

m ột chu trình sống vô cùng phức tạp, bao gồm 24 giai đoạn. Ổ giai đoạn té bào sinh dưỡng có roi [flagellated vegetative cell], khi cá bơi về phía tảo, tảo sẽ tấn công cá. ra ít nhất

chất rất độc:

chất làm cá bị choáng,

P fie s te ia

sinh

chất gây thương tích cho cá [hình

24.18]. Loại tảo có roi này trư ớc đây sử dụng các loại tảo khác là thức ăn chính, nhưng đến nay thì lả kẻ tiêu diệt cá, lươn, cua, v à các động vật khác. Việc tăng nồng độ chất dinh dưỡng trong nước được cho là nguyên nhân làm tăng sự phát triển của tảo.

H ì n h 2 4 .1 7 : T ả o p / i e s t e i a p is c ic id a .

626

Hình 24. ỉ 8: Thương tích ớ cá do Pfiesteia gây nên.

vết thitơng ở cả mòi dầu [menhaden] ỉà do sự ký sinh cùa tảo Pfiesteia pìscicida.

Chú ý:

người cũng bị mẫn cám với chất độc, chất độc gây chóng mặt, mẩt tri nhớ vò hư hòng chức năng vận động [cho nên cần phải đeo găng tay dầy]. [Theo Prescott-Hctrley-Kỉeìn, 2002]. Vi sinh vật trong nước biển còn chịu tác động của quá trinh chuyển động của không khí ở mức toàn cầu. Sự chuyển động cùa bụi đất trong khí quyển v à các hoạt động sản xuất công nghiệp ảnh hường đến sinh trưởng và tỷ lệ Redfield của thực vật phù đu. Ở phía Bắc Thái Bình Dương, nguồn sắt trong nước rất hạn hẹp, nguồn sắt được bổ sung vào nước qua quá trình sa m ạc hoá hay còn gọi là thoái hoá đất [desertification] và các cơn bão bụi ở vùng trung tâm Châu Á. Ngược lại, ở phía Bắc Đại Tây D ương thì nguồn nitơ bị hạn chế, nguồn ni tơ được bổ sung từ khí quyển do hoạt động của con người. Tỷ lệ N : p ở vùng nước đáy biển Bắc Đại Tây D ương đang tăng lên và làm thay đổi tỷ lệ Redfield của thực vật phù du.

24.4. MÔI TRƯỜNG NƯỚC NGỌT Môi trường nưỏc ngột nằm ừong đất liền tồn tại ở hai dạng chính: lỏng và đỏng băng. Môi trường đóng băng thường được coi như là sa mạc của vi sinh vật, tuy nhiên điều này không chính xác vì m ột số loại vi sinh vật vẫn có khả năng phát triển. M ôi trưởng lỏng rất đa dạng về đặc tính vật lý và hỏa học, điều này ảnh hưởng đến các thông số của vi sinh vật sổng ở đó. M ồi trường nước ngọt dạng lỏng được chia thành 2 loại: động [sông, suối, cửa sông, kênh] và tĩnh [ao, hồ, đầm lầy, hệ thống nước đóng kín]. M ôi trường nước ngọt khác với m ôi trường nước biển ở rất nhiều điểm.

24.4.1. Hồ và ao Hồ và ao là m ôi trường nước ngột thuộc hệ tĩnh, đa dạng về độ sâu [có thể từ vài m ét đến 1000 m] và diện tích bề m ặt [có thể từ vài m 2 đến 100 000 m2]. N goài ra hồ và ao còn da dạng về dòng chảy của nước, sự tích lũy chất dinh dưỡng, sự sẵn có cùa nguồn ánh sáng, sự hòa trộn của các cột nước. H ồ được chia thành 2 khu vực chính: gần bờ v à giữa

627

hồ. M ặc dù nước ở hồ là dạng tĩnh, tuy nhiên vẫn nhận thấy quá trình động học của hồ đo dòng chảy vào và ra, sự hòa trộn do gió và do thay đổi nhiệt độ. M ột số hồ chứa nước mặn như Great Salt Lake ở Utah. M ột sổ hồ có thành phàn hóa học rất đặc biệt như giàu M gSƠ 4 , N a 2 B 4 Ơ 7 hay N aH C Ơ 3 . Ở phần này chù yếu tập trung vào các hồ nước ngọt thường gặp. D inh dưỡng trong m ỗi hồ là khác nhau, m ột số hồ nghèo chất dinh dưõng còn số khác thì giàu chất đinh dưỡng [hình 24.19]. Hồ nghèo dinh dưỡng thì nước tồn tại ờ dạng hiếu khí quanh năm , sự thay đổi nhiệt độ theo m ùa không dẫn đến hiện tượng phân lớp theo nồng độ oxi. N gược lại, ở hồ giàu dinh dưỡng, chất hữu cơ kểt tủa xuống đáy. N ước ờ hồ này được phân lớp theo nhiệt độ, lớp nước ấm bên trên là vùng hiếu khí còn lớp nước lạnh bên dưới là kị khí. G iữa

lớp nước này tồn tại m ột vùng có nhiệt độ thay đổi rất

nhanh gọi là vùng biến nhiệt [thermocline]. Tại đây ít khi xày ra sự hòa Ưộn giữa 2 ỉớp nước. Vào m ùa xuân và thu, lớp nước hiếu khí bên trên và lớp nước kị khí bên dưới sẽ thay đổi vị trí do nhiệt độ và ừọng lượng riêng thay đổi, dẫn đến có hiện tượng hòa trộn giữa

lớp nước. Sau khi xảy ra sự hòa trộn thì các vi khuẩn và tảo có khả năng di chuyển theo các cột nước và tìm môi trường sống thích hợp nhất cho chúng. Khi bổ sung m ột lượng lớn chất dinh dưỡng vào hồ, hiện tượng phì dường xuẩt hiện và thúc đẩy sự sinh trường của thực vật, tảo và vi khuẩn. Trong hồ, nguồn nitơ và photphat luôn bị hạn chế nên việc bổ sung hợp chất chứa nitơ và photphat vào hồ sẽ gây ảnh hường lớn tới hệ thống nước ngọt này. Tùy thuộc vào thể tích của hồ v à tốc độ bổ sung chất dinh dưỡng m à thời gian để hồ trờ thành giàu dinh dưỡng có thể rất nhanh hoặc sau vài thế kỷ.

[b]

628

Hô có nông độ dinh dưỡng khác nhau, từ nghèo đến rất giàu dinh dưỡng, [a] Hồ nghèo dinh dưỡng có nông độ oxi bão hòa và sỏ lượng vị sinh vật hạn chế; [b] Hồ giàu dinh dưỡng chia 3 ỉởp: lớp nước hiếu khí, lớp nước kị khí vò lẳng tụ ờ đáy. Vỉ sinh vật quang dưỡng hcu huỳnh sổng ớ lớp nước kị khỉ. [Theo Prescott-Harỉey-Kỉem, 2002]. Neu bổ sung photphat vào nước nghèo dinh dưỡng, vi khuẩn lam sẽ là vi khuẩn chính trong quá trình tích lũy chất dinh dưỡng, thậm chí ngay cả khi không bổ sung nguồn nitơ. Đó là do m ột số vi khuẩn lam, nhất là A n a b a e n a ,

N o s to c

và

năng cố định nitơ ờ điều kiện hiếu khí. Ngoài ra, vi khuẩn lam

C y lin d r o s p e r m u m ,

O s c iỉỉa to r ìa

có khả

có khả năng sử

dụng H2S là chẩt cho điện tử để quang dưỡng, do vậy chúng có thể cố định nitơ ngay cả trong điểu kiện kị khí. Thậm chí ngay cả khi nitơ và photphat cùng được bổ sung thì vi khuẩn lam vẫn có khả năng cạnh tranh với tảo.Vi khuẩn lam hoạt động tốt hơn ờ pH kiềm [8,5 - 9,5] và ở nhiệt độ cao [30 - 35°C]. Tảo nhìn chung thích họp vói pH trung tính và nhiệt độ thấp hom vi khuẩn lam. Vi khuẩn ỉam cũng có thể làm tăng pH môi trường bằng cách sử dụng c c >2 vói tần suất cao dẫn đến môi trường không còn phù hợp cho tảo phát triển. Ngoài cơ chế nêu trên, vi khuẩn lam còn cạnh tranh vói tảo bằng nhiều cơ chế khác. Nhiều vi khuẩn lam sản sinh hydroxamat, chất này sẽ bám vào sắt làm cho chất khoáng quan trọng này sẽ không còn sẵn có để phục vụ sự sinh trưởng cùa tảo nữa. Vi khuẩn lam còn có khả năng kháng các sinh vật ăn mồi vì chúng có khả năng sinh chất độc. Ngoài ra, một số vi khuẩn lam tổng hợp hợp chất gây mùi ỉàm giảm chất lượng nước uống. Cả vi khuẩn lam và tảo đều đóng góp phần rất

lớ n

vào hiện tượng “nở hoa”, nhất là ở

hồ giàu đinh dưỡng. H iện tuợng này có thể kéo dài trong nhiều năm cho đến khi chất dinh dưỡng bị lấy ra khỏi hồ hoặc lắng xuống đáy. Để cải thiện tình huống này có thể tiến hành nạo vét, lấp kín lớp kết tủa hoặc bổ sung chất gây lắng tụ để thúc đẩy quá trình kết tụ xuống đáy. 24.4.2. S ô n g v à s u ố i Sông và suổi là m ôì truờng khác với hồ và ao vì sự chuyển động của các thành phần trong đó chủ yếu là theo chiều ngang. Sự phân lớp theo chiều thẳng đứng là rất hạn chế. Sông thường không sâu, chi vài mét, tuy nhiên có m ột số sông có vùng trũng sâu tới 50 m. Thể tích của sông và suối phụ thuộc vào mùa. Hầu hết vi sinh vật ở m ôi trường này tồn tại trên mặt nước, chỉ trừ m ột số sông lớn thì vi sinh vật có thể tồn tại lơ lửng ừong nước. Chất đinh dưỡng ừ ong sông và suối có nguồn gốc từ hoạt động quang hợp của các vi sinh vật tự dưõng {hình 24.20a] hoặc từ bên ngoài như từ vùng đất ở

bên bờ, lá cây, và các chất hữu

cơ từ bên ngoài rơi vào [hình 24.20b]. Vi sinh vật hoá hữu cơ dưỡng ờ sông và suối sẽ chuyển hoá chất hữu cơ và cung cấp năng lượng cơ sở cho hệ sinh thái. Trong hầu hết

629

trường hợp, lượng chất h ữ u cơ được bổ sung vào sông và suối thường không lớn hơn năng lực oxi hoá chất hữu cơ của vi sinh vật, đo đó sông và suối luôn duy trì trạng thái sạch. N ăng lực chuyển hoá chẩt hữư cơ của vi sinh vật ờ sông và suối là có hạn. Nếu đưa quá nhiều chất h ữ u c ơ vào sông và suối sẽ dẫn đến hiện tượng nước thỉếu oxi. H iện tượng này xảy ra ở sông và suối chảy qua vùng thành phố v à khu nông nghiệp. V iệc đưa chất thải sinh hoạt chưa được xử lý hoàn chỉnh hoặc chất dinh dưỡng từ m ột vị trí nhất định nào đó vào sông dẫn đến ô nhiễm , thì ô nhiễm này được gọi là ô nhiễm từ điểm nguồn [point source o f pollution]. V iệc bổ sung các chất hữu cơ từ các điềm này sẽ gây ra những thay đổi rất đặc trưng và đoán trước được về số phận của quần xã vi sinh vật và nguồn oxi [hình 24.21]. V í dụ điển hình của ô nhiễm không từ điểm nguồn [non-point source o f pollution] là ô nhiễm do dòng chảy từ cánh đồng và trại nuôi, đó là hiện tượng “n ở hoa” của tảo ờ m ôi trường nước giàu dinh dưỡng.

H ì n h 2 4 . 2 0 : N g u ồ n c h ấ t h ữ u c ơ ở s ô n g v à s t iổ ì . C h ẩ t h ữ u c ơ c ỏ t h ể đ ư ợ c tổ n g h ạ p tr o n g n ư ớ c h a y t ừ b ê n n g o à i đ ư a v à o . [a ] N g u ồ n h ữ u c ơ t ự t ổ n g h ợ p tr o n g n ư ớ c n h ờ q u ả tr ìn h q u a n g h ợ p ; [b ] N g u ồ n h ữ u c ơ t ừ b ể n n g o à i đ i v à o s ô n g v à s u ố i. [T h e o P r e s c o tt-H a r le y -K ìe ìn , 2 0 0 2 ].

K hi hạn chế nguồn chất dinh dưỡng bổ sung, tảo sẽ sinh trưởng và sử dụng khoáng chất được giải phóng từ các chất hữu cơ. T ảo thực hiện quang hợp và giải phóng oxi vào ban ngày và tiến hành hô hấp vào ban đêm , dẫn đến hiện tượng thay đổi nồng độ oxi trong ngày. Cuối cùng thi lượng oxi đạt trạng thái bão hoà, nghĩa là két thúc quá trình tự làm sạch.

Song song với việc bổ sung chất dinh dưỡng, việc loại silic [Si] ra khỏi m ôi trường này thông qua việc xây đập hoặc nạo vét đáy sông ỉàm ảnh hưởng đến hệ sinh thái ờ sông, suối. Điển hình như việc xây dựng đập tại “cổng sắt” trên sông D anube [nằm trên biển Black Sea 600 dặm] dẫn đến việc giảm lượng silic xuống còn 1/60 của lượng silic trước đây. Việc giảm lượng silic dẫn đến kiềm chế sinh trưởng của tảo silic vì tỷ lệ silic/NCV bị thay đổi [silic cần cho sự hình thành vỏ của tảo silic]. Chính vì vậy, tảo silỉc ở biển Black Sea không thể phát triển và cố định chất dinh dưỡng. Kết quả là lượng N O 3 ' tăng 600 lần và xuất hiện sự phát triển không ngừng của tảo độc. Vì thế, sự cân bằng của sông có thể bị thay đổi m à khó có thể tính trước được khi xuất hiện các con đập [cỏ hcm 36 000 con đập trên Thế giới và còn nhiều nữa đang được xây dựng ở Trung Quốc], đẫn đến tác động lên các hoạt động của vi sinh vật nước và foàn bộ hệ sinh thái. Chính vì ảnh hưởng xẩu của các con đập dối với hệ sinh thái nên người ta đang cố gắng làm thùng cấu trúc này để các quá trình tự nhiên ữong nước xảy ra bình thường, tạo điều kiện cho cá di cư lên bên ừên, nơi m à chúng mất cơ hội tồn tại hàng thập kỷ nay.

Nguồn nhiễm

Oxi tan % bão

Đảp ứng của vi sinh vật

Sính trưởng của vỉ sinh dịđưOng Giải phỗng chất khoáng Sinh trưởng của ’táo

Dòng chảy [thời gian/khoảng cách so với điểm nguồn]

H ì n h 2 4 .2 1 . Đ ư ờ n g c o n g o x i h ò a t a n . K h i b ể s u n g c h ấ t d in h đ ự ỡ n g , v i sin h v ậ í v à h o ạ t đ ộ n g c ù a c h ủ n g c ó th ể tạ o g r a d ie n n ồ n g đ ộ th e o k h ô n g g ia n v à th ờ i g ia n . V i d ụ đ iể n h ìn h là đ ư ờ n g c o n g đ i x u ổ n g c ù a o x ì g â y r a d o c h ấ t th ả i h ữ u c ơ đ ư ợ c đ u a v à o h ệ th ố n g s ô n g s ạ c h . S a u g ia i đ o ạ n t ự là m s ạ c h , q u ầ n x ã q u a n g d u & n g s ẽ p h á t tr iể n m ạ n h m ẽ v à h ìn h th à n h s ự th a y đ ổ i n ồ n g đ ộ

OXK [ T h e o

P r e s c o tt-H a r ỉe y -K ỉe in , 2 0 0 2 ].

24.4.3. Vi sinh v ật tro n g lớp băng nước ngọt N ước ngọt là thành phần của sông băng và những tảng băng lớn ở vùng Bắc Cực và N am Cực. M ặc dù cách xa nơi ở của con người, khu vực này cũng đóng vai trò quan trọng vì là nơi sống của vỉ sinh vật, đảng chủ ý nhất là các hồ sâu đỏng bâng ở vùng Bắc Cực. M ột ví đụ quan trọng là hồ M cM urđo Dry Valley, có lớp băng dày 3 -

m, lắng tụ do gió

m ang tới nằm trong các lớp băng khác nhau. Khi mùa hè tới, băng tan, vùng ỉắng tụ là nơi vi sinh vật phát triển. Con người rất quan tâm đến vi sinh vật sống trong băng ờ Bẳc Cực và N am Cực. Liệu chúng là những quần thể cô lập và khác biệt? M ột trong những nơi sống đóng băng đáng chú ý là ở m ặt hồ V ostok ở Nam Cực. Lớp băng dày 3600 m năm bên ừên có tuổi đời 420 000 năm , điều này chứng tỏ hồ đã nằm dưới lớp băng này từ 500 000 đến 1 000 000 năm. J ừ đấy xuống sâu 120 m băng nữa mới là hồ. Hồ có kích thước tương tự như hồ O ntario, nhưng sâu hơn, độ sâu của hồ là 500 m. Các nhà khoa học đang tích cực tìm kiếm và nghiên cứu vi sinh vật sống trong môi trường đóng băng nước ngọt lâu đời nảy. 24.5. N Ư Ớ C VÀ S ự T R U Y É N B Ệ N H Nước là môi trường tiềm ẩn nhiều tảc nhân gây bệnh, vấn đề này đã được con người nhận thức từ rất lâu. D ần chứng là vua A lexdander [356-323 trước CN] đã dùng bình bàng bạc để đựng nước, do đó có thể phòng tránh hiệu quả m ột số bệnh có nguồn gốc từ nước. Ngoài ra, lịch sử còn ghi chép lại về trường hợp tác nhân gây bệnh trong nước uổng gây ảnh hưởng xấu tới sửc khỏe cùa người nông dân thời đế chế La m ã [27 trước CN]. M ặc dù nhận thức về sự có m ặt của tác nhân gây bệnh trong nước đã được phả cập từ rất lâu, nhưng hiện nay nước thải chưa qua xử lý vẫn thường xuyến được đưa vào nguồn nước mà con người sử dụng. Đê bảo vệ sức khỏe cộng đồng, nước thải cần được tiến hành xử lý trước khi đưa vào nguồn nước tự nhiên.

24.5.1. Tác nhân gây bệnh trong nước và quá trình lọc nước Vi khuẩn và động vật nguyên sinh là tác nhân gây bệnh chủ yếu có m ặt trong nước. Khi chúng ta sử dụng nước chưa xử lý hoàn chỉnh cho mục đích giải trí [như bể bơi, công viên n ư ớ c...] hoặc ăn đồ hài sản chưa nấu chín thì sẽ có nguy cơ bị nhiễm bệnh. Bệnh truyền nhiễm từ nước có thể gây hậu quả nghiêm trọng cho cộng đồng, nhất là những người bị bệnh thoả hiệp m iễn dịch [im m unoìogicaỉly com prom ised individual].

24.5.1 A. Tác nhân gây bệnh tồn tại trong nước M ột số tác nhân gây bệnh quan trọng có m ặt trong nước được trình bày ở bảng 24.3. Tác nhân gây bệnh có thể là vi khuẩn, virut, hoặc động vật nguyên sinh [ G i a r d i a , C r y p t o s p o r i d i u m , C y c l o s p o r a . . .] M ột bệnh nghiêm trọng do động vật nguyên sinh gây ra làm cho T hế giới quan tâm là bệnh viêm m àng não sơ cap đo am ip [prim ary amebic m eningoencephalitis]. Thủ phạm của

632

bệnh này là N a e g ỉ e r i a f o w l e r i , N . a e r o b i a và N . i n v a d e s . Khi nhiễm vào cơ thể, chúng sẽ tân công vào hệ thân kinh trung ương. Bệnh này thường xuyên xuất hiện ở trẻ em và thanh niên, đôi tượng hay đi bơi ở hô hoặc hay đi lướt ván. Sau khi xâm nhập vào cơ thể qua đường mũi, động vật nguyên sinh sẽ tiến tới não và gây viêm não. Bệnh có nguy cơ tử vong. Động vật nguyên này phát triển tốt ở nước ấm và nước nóng từ nhà máy công nghiệp. B ảng 24.3:

T á c n h â n g â y b ệ n h tồ n tạ i tr o n g n ư ớ c

[ T h e o P r e s c o tt-H a r le y -K le in , 2 0 0 2 ]

Sinh vật Vi k luân Aeromonas hydrophiỉa Campylobacter

Helicobacter pylori L e g io n e lla

pneumophila Leptospira Mycobacterium P seudom onas

Nơi sống

Đặc điểm đặc ỉrưng

Tự do

Liên quan đến bệnh viêm dạ dày-ruột, viêm mô bào ... Nguyên nhân chính của bệnh tiêu chảy, thường có mặt ở gia cầm chế biến, đặc trưng là vi ưa khí [microaerophile] Có thề gây viêm dạ dày typ B, loét dạ dàymột, ung thư tuyến dạ dày Phát hiện thây ờ cột ông làm lạnh, máy bay hơi nước, máy cô đặc, vòi hoa sen ... Gây chảy máu, vàng da Quả trình điều trị phức tạp Gày nhiễm tai và các bệnh liên quan cho người đi bơi Phổ biến ờ nhiều loại nước

Chìm, động vật

Tự d o ,... Tự do, động vật nguyên sinh Động vật Động vật, tự do Tự do

a e r u g in o s a

Salmonella enteriditis

Đường tiêu hỏa của động vật Tự do Tự do ở nước ven biển

Vibrio cholera Vibrio parahaemolyticus Động vật, môi trưởng Yersinia enterocolitica Động vật n ịuyên sinh Khu vực thải bùn cống Acanthamoeba Cryptosporidium

Nhiều loài động vật nuôi và hoang dẳ

C y c lo s p o r a

N ư ớc,...

c a y e ta n e n s is

G ia r d ia ỉa m b lỉa

Hải ly, cừu, chó, mèo

N a e g le r ia fo w l e r i

Nước nóng, bể bơi, hồ

Tỉm thấy ờ nhiều loại nước và ở cửa sông Gây tiêu chảy cho người ăn động vật có vỏ Gây viêm dạ dày-ruột Gây bệnh viêm não hạt đo amip, viêm giác mạc và loét giác mạc Gây viêm ruột non kết cấp, nghiêm trọng với người bị thỏa hiệp miễn dịch, bào nang kháng với chất tẩy trùng hóa học, không mẫn cảm với kháng sinh Gây tiêu chảy kéo dài [trung bình 43 ngày], tự hồi phục ở vật chù bình thường, mẫn cảm khi xừ lý tức thời với Bactrim Nguyên nhân chính gây tiêu chảy vào đầu mùa xuân, quan trọng ở nước lạnh vùng núi Hít vào dường mũi, nhiễm vào thần kinh trung ương, gây bệnh viêm màng não sơ cấp do amip

633

24.5.1.2. Quy trình làm sạch nước

Nước chưa xử lý

' v

L àm m ềm [k h ứ C a , M g]

k ■.

"* 1

'ứ

L àm tro n g

ĩ\

"1 3 *

Sục khí Oxi hóa hóa học Trao đổi ion Lắng tụ

ĩ ’

Khứ mùi và vi

§1

' "v$\

Tẩy trùng

■ ĩf%

Kết tủa hóa học: -H òa trộn -K ế t bông , í - Lằng -TV._ T ra o đ ổ i io n

ýi r 1 :%*.I}.: J 1

■■■•-t

ru.-. =v

:;ịfN :

Két bông hóa học:

-H òatrộn

“ 7_ - K ết bông -L ă n g L ọc

v>.=• y

H ì n h 2 5 .1 : C á c n h ã n t ổ b ê n t r o n g v à b ê n n g o à i à n h h ư ờ n g l ê n s ự s ì n h t r ư ở n g c ủ a v i s i n h v ậ t t r o n g th ụ c p h ẩ m . [T h e o P r e s c o tt-H a r ỉe y -K ỉe in , 2002%

25.1.1. Các nhân tổ bên trong [Intrinsic factors] Các thành phần cấu tạo nên thực phẩm là những nhân tổ then chốt bên trong ảnh hưởng tớì sự sinh trưởng của vi sinh vật, N êu như m ột thực phẩm về cơ bản có chứa cacbohydrat thì sự phá hỏng ít đẫn tới việc sinh ra các m ùi khó chịu. Vì thế các thực phẩm như bánh mỳ, m ứt, hay m ột số hoa quả đầu tiên bị hòng đo sự phát triển của nấm. Ngược lại, khi thực phẩm chứa m ột lượng lớn là protein hay chất béo [như thịt hay bơ] thì sự phá hỏng có thể tạo ra m ột lượng lớn m ùi khó chịu. Chỉ cần nghĩ tới trứng thối ỉà đủ hiểu chuyện này. Sự phân giải protein và phân giải kị khí của protein đã tạo ra m ột lượng lớn mùi hôi thổi của các hợp chất như ínđol, skatol, các am in cadaverin hữu cơ. Sự phân hủy của các thực phẩm chứa các chất béo cũng tương tự như thế. Chẳng hạn nhu sự sản sinh các chuỗi axit b éo ngắn từ chất béo làm cho bơ bị ôi và khó chịu. Đ ộ pH của thự c phẩm cững là m ột ừ ong các tiêu chí quan Ưọng. N ếu pH thẩp sẽ thích hợp hem cho sự sinh trường cùa nấm m en và nấm sợi. N ếu pH trung tính hay kiềm, như trong thịt th ì vi khuân sẽ chiếm ưu thế. Sự phá hòng thực phẩm phụ thuộc vào cơ chất chỉnh có m ặt trong đó. Sự có m ặt của nước cũng ảnh hưởng tới sự xâm nhập của vi sinh vật ừong thực phẩm . Làm khô thực phẩm , có thể khổng chế hoặc có thể loại bỏ quá trinh phá hủy thực phẩm . Sự có m ặt của nước được đo bằng đại lượng hoạt độ của nước [aw]. Đại lượng này đuợc tính bằng tỉ lệ giữa độ ẩm tương đổi ừong không khl trên m ột dung địch kiểm ừ a so với tỉ lệ đỏ của nước chưng cất. K hi thêm vào thực phẩm m ột lượng lớn m uối hay đường

thì hâu hết các vi sinh vật đều bị loại nước do hiện tượng co nguyên sinh [plasm olysis] và không thể sinh trưởng được nữa B ản g 25.1:

{ b ả n g 2 5 .2 ] .

S ự k h á c b iệ t tr o n g q u ả tr ìn h là m h ỏ n g c á c lo ạ i th ự c p h ầ m [T h e o P r e s c o tt-H a r ỉe y -K le in , 2 0 0 2 ]

Cơ chất

Tên thực phẩm

Các phản ứng hỏa học

Pectin

Hoa quả

Phân giải pectin

Metanol, axit uronic [làm mất cấu trúc về hình thái và dề bị thổi nhũn]

Protein

Thịt

Phân giải protein và nhóm amin

Axit amin, peptid, amin, H2 S, inđol [gây đắng, chua, gây nhớt, mùi khó chịu]

Carbohydrat

Các thực phẩm chứa tinh bột

Thủy phân tinh bột và lên men

Axit hữu cơ, COỉ, rượu... [làm chua và axit hóa]

Lipit

Bơ

Thủy phân, phân hủy axit béo

Glyxerol, axit béo hỗn họp [tạo mùi ôi, gây đắng].

B ảng 25.2:

Các sản phẩm điển hỉnh và tác dụng của chúng

M ố i ỉiê n h ệ g iữ a h o ạ t đ ộ c ủ a n ư ớ c tố i th iể u v ở ỉ c á c n h ó m v ỉ s in h v ậ t tr o n g

q u ả tr ìn h tà m h ỏ n g th ự c p h ẩ m . [T h e o P r e s c o tt-H a r le y -K le in , 2 0 0 2 ]

Các vi sinh vật Nhóm Cảc vi khuẩn làm hỏng thực phẩm Các nấm men làm hỏng thực phẩm Các nấm mốc làm hỏng thực phẩm Các vi sinh vật đặc trưng: Closứidium botulinum, typ E

Các vi sinh vật

0.9 0 . 88 0 . 80

Nhỏm Các vi khuẩn ưa mặn Các nấm mốc ưa khô hạn Các nấm men ưa thẩm thấu

0. 97 0. 97 0. 96 0. 96

Pseudomonas spp. Acinetobacter spp. Escherichia coli Enterobacter aerogens Bacillus subtilis Clostridium botulinum, typ A, B

0. 95 0.95 0. 94

Candida utỉlis Vibrio parahaemolyticus

0. 94 0. 94

Botrytis cinerea Rhizopus stolonifer

0.93 0. 93 0.93

Mucor spinosus

Các vi sinh vật đặc trưng: Candida scottii Trichosporon pullulant Candida zeylanoides Geotricum candiđum Trichothecium spp Byssochlamys nivea Staphylococcus aureus AlteARNria citri Pencillium patulum Eurotium repens Aspergillus conicus Aspergillus echinulatus Zygosaccharomyces rouxii Xeromyces bisporus

0. 75 0.61 0.61 0. 92 0.91 0. 90 -0.90 -0.90 -0.87 0 . 86 0. 84 0.81 0.72 0.70 0. 64 . 62 0.51

655

N gay trong những điều kiện ngược lại, vi khuẩn ưa áp và ưa khô cũng có thể phá hỏng thực phẩm . Vi khuẩn ưa áp [osm ophilic] sinh trưởng tốt nhất ưong m ôi trường có áp suất thẩm thấu cao, trong khi đó vi sinh vật ưa khô [xerophilic] chỉ thích hợp với môi trường có aw thấp và không thể sinh trưởng ừong điều kiện có aw cao. Thế oxi hóa khử của thực phẩm cũng có thể ảnh hưởng tới sự phá hỏng thực phẩm. Khi m ột sản phẩm thịt, đặc biệt là nước luộc thịt, thường có thế oxi hóa khử thấp. Những sản phẩm này sẵn là m ôi trường lý tưởng cho sự sinh trưởng của vi khuẩn kị khí, bao gồm cả

C lo s tr id iu m .

Cấu trúc vật lí của thực phẩm cũng có thể ảnh hưởng đến tiến trình và phạm vĩ làm hỏng thực phẩm . Sự xay nhỏ và phối ừ ộn thực phẩm như xúc xích và

h a m b u rg er

không chỉ

làm tăng diện tích bề m ặt thực phẩm , làm biến đổi cấu trúc tế bào m à còn góp phần làm tăng cơ hội nhiễm vi sinh vật vào thực phẩm. Điểu này có thể làm cho thực phẩm hư hỏng nhanh hơn nếu những thực phẩm đó không được bảo quản m ột cách thích hợp, Rau xanh và hoa quả có lớp vỏ ngoài có thể bảo vệ chúng khỏi hư hỏng. Thường những vi sinh vật gây hư thực phẩm cỏ loại enzym đặc hiệu giúp chúng thâm nhập qua lớp vỏ và m àng bảo vệ, đặc biệt là sau khi hoa quả và rau đã bị khô héo. N hiều loại thực phẩm có chứa các chất kháng khuẳỉĩ tự nhiên, bao gồm cả enzym và những phức chất ức chế hóa học. C um arin được tìm thấy ứ ong hoa quả và rau xanh cho thấy sự hoạt động như chất kháng khuẩn. Sữa bò và trứng cũng có chứa chất kháng khuẩn. Trứng giàu Lyzozym , có thể phân giải thành tế bảo vi khuẩn G ram dương. M ột số thực phẩm đáng lưu ý khác có hoạt tính kháng vi sinh vật như nước sốt cay được dùng khi ăn sò sống và các loại hải sản khác. N ước sốt làm bằng hạt tiêu và các loại nước sốt cay từ hạt tiêu đỏ dường n hư luôn có m ột lượng nhất định các chất kháng vi sinh vật. Thảo m ộc và gia vị thườ ng có m ột lượng chất kháng vi sinh vật đáng kể; nhìn chung vi khuẩn nhạy cảm h ơ n so với hầu hết các nấm . N gải đắng và hương thảo cũng là những loại gia vị có chứa nhiều n hất chất kháng vi sinh vật. Hợp chất aldehit và phenol được tìm thấy trong cây quế, cây m ù tạc, cây kinh g iớ i... N hững hợp chất này kìm hăm sự sinh trưởng của vi sinh vật. T hực phẩm quan trọng khác có khả năng ức chế các vi sinh vật Ịà tỏi, chứa chất allincin, v à cây đinh hương có chứa eugenol. T uy nhiên, những gia vị này cũng có thể ch ứ a những sinh vật m ang m ầm bệnh và làm hỏng thực phẩm . Coiiform, c e r e u s , C l P e r fr in g e n s

và

S a lm o n e lla

có thể phát hiện thấy trong h ầu hết các gia vị. Các vi

sính vật có thể bị loại bỏ hoặc giảm bớt khi k h ử trùng bằng etylen oxit. Phương pháp này có thể loại bò thực phẩm.

S a lm o n e lla

khỏi gia vị và giảm tới 90% các vi sinh vật thường làm hư hỏng

Trà xanh và trà đen chưa lên men có hoạt tính kháng vi sinh vật tốt hơn sau khi lên men do có chứa thành phần polyphenol. N hững loại trà đó hoạt động chống lại vi khuẩn, virut, nam và có thể có cả đặc tính chống ung thư. a. C á c n h â n tổ b ê n n g o à i [E x tr in s ic F a c to r s ]

N hiệt độ và độ ẩm tương đối là những nhân tố bên ngoài quan trọng có ý nghĩa quyết định việc thực phẩm có bị hỏng hay không. Ở độ ẩm tương đối cao, sự sinh trưởng của vi sinh vật bắt đàu trở nên nhanh hơn, thậm chí ngay cả ở nhỉệt độ thấp [ừong tủ lạnh, kho lạnh] m ột số vi sinh vật vẫn có thể phát triển. Khi thực phầm khô được bảo quản trong môi trường ẩm ướt, sự hấp thụ hơi ẩm có thể xảy ra ữên bề m ặt thực phẩm , có thể cho phép vi sinh vật sinh trưởng. Không khí bên ừong thực phẩm được bảo quản cũng rất quan trọng. N ồng độ CƠ 2 khi vượt quá giới hạn có thể làm giảm độ pH của dung dịch, dẫn đến ngăn cản sự sinh trường của vi sinh vật. Bảo quản thịt ở không khí có CO 2 cao hạn chế được vi khuẩn Gram âm, dẫn tới m ột quần thể chiếm ưu thế bời các L a c t o b a c i ì ỉ u s , Bằng cách sử dụng nguyên liệu đóng gới hiện đại cùng vói công nghệ chân không, lượng không khỉ bên ứong các thực phẩm đóng gói sẽ được kiểm soát. Không khí xung quanh thực phẩm chứa CO 2 từ 60% trở lên thỉ vi nấm phá hỏng thực phẩm sẽ không phát triển được. M ột lượng O 2 được giữ lại vì nếu tất cả khỉ O 2 bị loại khỏi thì những loại ua lanh như

C lo s tr id iu m g a s ig e n s e

có thể sinh trưởng được. Loại vi sinh vật này có thể sinh

khí ừong vòng 14 ngày ở 2°c, đẫn tới việc thực phẩm đóng gói bị phình to ra.

25.2. SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT VÀ QUÁ TRỈNH LÀM HỎNG THựC PHẨM Vì thực phẩm lả nguồn dinh dưỡng dồi dào, cho nên nểu có điều kiện bên trong và bên ngoài thích hợp, vi sinh vật sinh sẽ sinh trưởng nhanh chóng, biến những thực phẩm bổ dưỡng và ngon m iệng trở nên có vị chua, có mùi hôi hay được bao phủ bởi nấm. Sự sinh trưởng của vi sinh vật trên thực phẩm có thể dẫn tới sự thay đổi dễ nhìn thấy bởi các màu sắc phong phú do vi sinh vật sinh ra. M ột ữong những thống báo nổi tiếng về chuyện này đa được công bố tò năm 1263. Năm 1870, Bartolomeo Bizio m iêu tả loại vi khuẩn là tác nhân của hiện tượng tạo màu này. Đó là vi khuẩn

S e r r a tìa m a r c e sc e n s.

Thịt và những sàn phẩm bơ, với giá trị dinh dưỡng cao, chửa các carbohydrat dễ sử dụng, lipit và protein, là điều kiện lý tưởng cho vi sinh vật phát triển. Phân giải protein và thổi rữa là kết quả điển hình của sự phá hỏng thực phẩm ở cảc nguyên liệu giàu protein đó. Khi sữa không được tiệt trùng, quá trình làm hỏng sữa sẽ ừ ả i qua 4 bước, sự sản xuất ra axỉt bời

L a c to c o c c u s ỉa c tìs

subsp.

la c tis

có liên quan đển sự sinh trưởng của vi sinh vật

chịu được axit. N ấm m en và nấm sợi đo có khả năng phân giải các axit lactic tích tụ làm

657

cho lượng axit giảm đì. C uối cùng, các vi khuẩn phân giải protein bát đầu hoạt động, dẫn tới phá hủy m ùi vị thực phẩm . Sữa đó ban đầu m ờ đục, cuối cùng có thể trở nên trong suốt [ h ìn h 2 5 .2 ].

H ì n h 2 5 .2 : Q u á tr ìn h là m h ỏ n g c á c s à n p h ẩ m s ữ a . S ữ a tư ơ i [b ê n tr á i]

vò

s ữ a b ị v ó n c ụ c [b ê n p h ả i]. S ữ a v ó n c ụ c d o tr á i q u a 4 g ia i đ o ạ n tự

n h iê n c ủ a c á c v i s in h v ậ t là m h ỏ n g s ữ a . K ể t q u ả ỉà tạ o r a c á c c ụ c s ữ a v à d ịc h s ữ a . [T h e o P r e s c o ttH a r le y - K ỉe in , 2 0 0 2 ].

So vởi thịt và b ơ sữa, hầu hết hoa quả, rau xanh có ít protein và lipit hom nên sẽ bị hư hỏng theo kiểu khác. R au xanh b ị h ư hỏng là đo vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn gây thối E r w in ia c a r o to v o r a

tiết enzym thủy phân cacbohydrat. Khí thế oxi hóa khử cao và thiếu

điều kiện khử cho phép thì vi khuẩn hiếu khí và hiếu khí không b ắt buộc sẽ tham gia vào quá trình phân hủy. V i khuẩn dường như không đóng vai trỏ quan trọng trong sự phá hỏng ban đầu của h ầu h ết ừ á i cây m à chỉnh là vi nấm . N hững loại nấm này tiểt enzym và xâm nhập qua lớp vỏ bảo vệ b ê n ngoài. V iệc làm h ư hỏng cũng xảy ra tương tự như vậy với những sản phẩm từ cam quýt được chế biến đông lạnh. N hững sản phẩm này dường như ít hoặc không trải qua xử lý, việc làm hỏng chính do

L a c to b a c illu s

thơm của diacetyl. N ấm m en

và

L e u c o n o s to c

S a cch a ro m yces

và

gây ra, những vi khuẩn này tạo mùi

C a n d id a

cũng cỏ thể làm hỏng nước ép

trái cây. N ước ép trái cây cô đặc có hoạt độ của nước giảm [aw = 0.

đến 0. 83], và khi giữ

trong tủ lạnh khoảng -9°c, chúng có thể được bảo quản trong m ột thời gian dài. Tuy nhiên,

658

khi nước ép cô đặc được pha loãng với nước có chửa vi sinh vật, hoặc là nước ép được bảo quản trong vật chứa rửa không sạch thì sẽ bị hư hỏng. Tương tự như vậy, vi sinh vật trong nước ép cô đặc làm lạnh có thể bắt đầu quá trinh làm hỏng sau khi thêm nước vào. Nước ép dùng ngay cũng xuất hiện các vấn đề khác, như giá trị aw đủ cao sẽ cho phép vi sinh vật sinh trưởng. Điều này đặc biệt đúng khi cất giữ nước ép ở nhiệt độ lạnh. M ặc dù có thể dùng biện pháp khử trùng, nhưng hầu hết những người tiêu dùng nhạy cảm với sự m ất vị thơm ngon tự nhiên do khử trùng gây ra.

Hình 25.3: Sự làm hỏng thực phẩm. Khi thực phẩm không được bảo quản thích hợp, các vi sinh vật có thề gây hư hông. Ví dụ: [a] bánh mỳ, [b] ngô [Theo Prescott-Harley-Klein, 2002]. Vi nấm là vấn đề đặc biệt của cà chua. Thậm chí khi chỉ thấy vết thâm tím nhẹ nhất trên vò cà chua, nhưng nếu bóc ra, sẽ thấy sự sinh trưởng của nấm. N hững chi nấm được gặp thường xuyên bao gồm

A ỉte A R N r ia , C ỉa d o s p o r iu m , F u s a r iu m

và

S te m p h y ỉiu m .

Sự sinh

trưởng của chúng ảnh hưởng tới chất lượng của sản phẩm cà chua, bao gồm nước ép cà chua và nước sốt cà chua nấm. Vi nấm có thể sinh trưởng nhanh trên những hạt ngũ cốc nếu bảo quản trong điều kiện ẩm ướt

[h ìn h 25.

5]. Sự xâm nhập của

C la v ic e p s p u r p u r a

vào hạt gây ra sự nhiễm độc

ergotin. Chất gây ảo giác alkaloid được sinh ra bời nấm này có thể dẫn tới biến đổi tập tính, phát triển không đầy đù, và có thể chết nếu ăn phải hạt bị nhiễm khuẩn. Các tác nhân gây ung thư từ nấm bao gồm các aflatoxin v à các fum onisin. Aflatoxin được tạo ra ở hầu hết các sản phẩm quả và hạt ẩm ướt thông thường. A flatoxin được phát hiện vào năm I960, khi nhiễm độc bởi nấm

1 0 0 ,0 0 0

con gà tây chết do ăn phải bột xay lạc [đậu phộng] bị

A s p e r g illu s fla v u s .

N hững hợp chất vòng phẳng hai chiều xen vào giữa

axit nucleic v à hoạt động như m ột đột biến dịch khung' chất gây ung thư. Đ iều này xảy ra đầu tiên trong gan, chủng được chuyển sang dạng dẫn xuất không ổn định.

659

Động vật, sau khi tiêu hóa thức ăn có aílatoxin BI và B2 sẽ biến đổi các chất này tạo thành aflatoxin MI và M2 [x e m h ì n h 2 5 . 4 ] . Nếu gia súc ăn phài những thực phẩm bị nhiễm aflatoxin này thì chúng cũng thể tồn tại trong sữa và các sản phẩm bơ sữa. Neu có cách sàng lọc nhanh aflatoxin trong ngũ cốc, ta có thể hạn chế sự xuất cảng các các loại ngũ cốc có nguy cơ bị nhiễm. Các loại aflatoxin chủ yếu và dẫn xuất của chúng cỏ thể được tách dễ dàng ra bởi sắc ký bản mỏng và có thể nhận biết được dưới ánh sáng của tia uv đo đặc tính phát huỳnh quang. Không chỉ có trong ngũ cốc, chúng còn được tìm thấy ở bia, coca, nho khô, và đậu tương xay khô.

H ì n h 2 5 . 4 : M ộ i s ổ l o ạ i Ạ Ị Ỉ a t o x in . K h i A s p e r g illu s f l a v u s v à m ộ t s ố n ấ m k h á c s in h tr ư ở n g tr ê n th ụ c p h ẩ m ,c h m g c ó th ể tạ o r a a f l a t o x i n g ã y u n g th ư . N h ữ n g c h ấ t n à y c ỏ 4 c ẩ u t r ú c c ơ b à n . [ a ] t h i ế t k ể đ á n h d ấ u d ự a t h e o m à u s ẳ c c ủ a h ợ p c h ấ t d ư ớ i tia c ự c tím s a u k h i tá c h t ù h ạ i v à tá c h c h iể t n h ờ s ắ c ký . H ợ p c h ẩ í B ị v à B ị p h á t h u ỳ n h q u a n g m à u x a n h d a tr ờ i v à h ợ p c h ẩ t G I v à G 2 c ó m à u x a n h

aflatoxin M được tìm thấy trong sữa động vật khi ăn phái aflatoxin typ B. K le ỉn , 2 0 0 2 ].

660

lá

c â y . [b ]. H a i l o ạ i

[T h e o

Prescott-Harỉey-

Cuối cùng, điều quan trọng là lượng aflatoxin được vô tình đưa vào qua đường tiêu hỏa của ca thể. Khẩu vị đối với một số loại khẩu phần ăn có vẻ cỏ liên quan tới sự phơi nhiễm aílatoxin: trung bình aílatoxin được đưa vào theo kiểu thực đơn điển hỉnh của người châu Âu là 19 ng/ngày [nanogram], trong khi đó cho thực đơn của người Viễn Đông được ước tính là 103 ng/ngày. Độ nhạy cảm với aflatoxin có thể bị ảnh hưởng do phơi nhiễm bệnh từ trước. Người ta đã phát hiện thấy những người bị viêm gan B nếu bị nhiễm aílatoxin thì có nguy cơ mắc ung thư gan cao hơn gấp 30 lần so với những người viêm gan B mà không phơi nhiễm aflatoxin.

COOH

Hình 25.5: cẩu tt'ucfumonisin. {Theo Prescoít-Harỉey-Kỉem, 2002]. Các fiunonisin do nẩm Fusarium moniliforme sinh ra, lần đầu tiên được phân lập được vào năm 1988, chất này gây nên bệnh viêm chất trắng não ngựa, phù phổi ở lợn, ung thư thực quản ở người. Fumonisin hoật động bằng cách phá vỡ sự tổng hợp, trao đổi chất của các shipgolipit, những hợp chất hoạt động hóa sinh quan trọng có ảnh huởng lên chức năng của tế bào. Có ỉt nhất 10 ỉoại fumonisin khác nhau, cấu trúc cơ bản,của fiimonisin FBI và FB2 được minh họa ở hình 25.5. Ngũ cốc và những thực phẩm chứa ngũ cốc như bột ngũ cốc, bột yến mạch thô, thường hay bị nhiễm Fusarium moniliforme. Fumonisin do nấm này sinh ra sẽ ức chế tổng hợp ceramid, một enzym thiết yếu trong việc sử dụng thích hợp các chất béo trong tế bào. VI thế điều quan trọng là phải bảo quản những sản phẩm này trong điều kiện khô, làm cho nấm không thể phát triển được.

Vi sinh vật nhân chuẩn có thể tổng hợp các chất độc khác thậm chí còn mạnh hơn cà aílatoxin và fumonisin. Chất độc từ tào nhiễm bệnh cho cá, ảnh hưởng cao hơn đến sức khỏe của động vật biển trong chuỗi thực phẩm; chúng cũng có thể làm nhiễm bệnh đển động vật thủy sinh có vỏ cứng [shellfish] và cá vây [fin fish], cuối cùng được tiêu thụ bởi con người. Hầu hết các chất độc được tạo ra bởi tảo giáp [dinoflageilates], và một vài tảo cát [diatoms]. Những bệnh chủ yếu của người do hậu quả từ chất độc của tào trong những sàn phẩm từ biển bao gồm chứng mất trí nhớ [amnesic], tiêu chảy, nhiễm độc thần kinh từ động vật thân mềm. {bảng 25. 3]. B ản g 25.3:

C á c tr iệ u c h ứ n g đ ộ c c ủ a m ộ t s ố tả o b iể n

[T h e o P r e s c o tt-H a r ỉe y -K le in , 2 0 0 2 ]

Hội chứng

NguyỄn nhân

Vector truyền

Loại độc tố

bệnh

Ngộ độc do bọn ký sinh ờ

Aỉexandrìum spp.

Động vật thân

nhỏm Động vật thân mềm

Gymnodỉnium spp.

mềm

Saxitoxin

Pyrodinium spp. Ngộ độc thần kinh do Động

Gymnodìnium breve

vật thân mềm Ngộ độc cá

Brevitoxin

Động vật thân mềm

Gambierdiscus toxicus

Ciguatoxin

Cá bám ờ mạch đá ngầm

Hội chứng quên vì ngộ độc do

Pseudonitzchia spp.

Động vật thân mềm

mềm Dinophysìs spp.

Động vật thân

Động vật thân mềm

Prorocentrum spp.

mềm

Hội chứng Estuary

Pfiesteia piscicidơ

Nước

Hội chứng ỉa chảy do ăn phải

Domoic axit

Động vật thân

Dinophysistoxin

Chưa biết

Hầu hết, những phức chất độc từ tảo biển là bền nhiệt, thưởng gây ra hiệu ứng hệ thống thần kinh ngoại biên, xảy ra thường trong vòng lgiờ sau khi ăn phải.

Hình 25,6: Các độc tổ tảo biển. Cẩu trúc hỏa học của các độc tổ tảo biển tác động tới con gười khi dùng các sản phầm hài sản hoặc nuớc: a. Satitoxin, b. Brevìtoxon, c. ciguatoxin, d. okadaic axit, e. domoic axit. [Theo Prescott-Harìey-Kỉeỉn, 2002]. 25.3. PHÒNG CHỐNG HƯ HỎNG THựC PHẨM [Controlling Food spoilage] Cùng với sự khởi đầu của ngành nông nghiệp, sự giảm phụ thuộc vào săn bắn, hái lượm thì nhu cầu bảo quản thực phẩm dư thừa cũng ưở nên vô cùng quan ừọng để tồn tại. Việc sử dụng muối để bảo quản thịt và sản xuất phomat từ sữa đã được thực hiện rất sớm, từ khoảng 3000 năm trước Công nguyên ở vùng Cận Đông. Sản xuất các loại rượu vang, bảo quản cá với thịt băng cách xông khói cũng rất phổ biến trong thời gian này. Mặc dù có truyền thống lâu đời để bảo quản thực phẩm khỏi bị hư hỏng nhưng đến tận thế kỉ XIX thì sự phả hỏng thực phẩm do vi sinh vật mói được nghiên cứu kỹ càng. Năm 1857, Louis Pasteur đã gây dựng nên thời kì mới của ngành Vi sinh vật học Ổng chi ra ràng vi sinh vật là nguyên nhân gây ra hư hỏng sữa. Công trình nghiên cứu của Pasteur trong suốt những 60 cùa thế kỷ XIX đã chứng minh rằng nhiệt độ có thể được sử dụng để khổng chế các vi sinh vật gây hư hỏng các loại rượu vang và bia. Các loại thực phẩm có thể được bảo quản bằng nhiều phương pháp khác nhau [bảng 25.4]. Điều đỏ rất cần thiết để loại bỏ hay là giảm thiểu các quần thể gây hư hỏng cùng với các vi sinh vật gây bệnh và để giữ lại giá trị của thực phẩm để đóng gói và bảo quản. Sự nhiễm bẩn thường xảy ra sau khi một gói hay một hộp thực phẩm được mờ ra khá lâu trước khi nó được sử đụng. Điều này tạo cơ hội lý tưởng cho sự sinh trưởng và lây lan các mầm bệnh.

663

Bảng 25.4: Cảc phương pháp cơ bản trong bảo quản thực phẩm Quá trình

Phương pháp Loại bỏ vi sinh vật

Tránh tạp nhiễm vi sinh vật, lọc, ly tâm

Nhiệt độ thấp

Bảo quản lạnh

Nhiệt độ cao

Làm bất hoạt một phần hoặc hoàn toàn các vi sinh vật [khử trùng Pasteur, đóng hộp]

Giảm hoạt độ nước

Loại bỏ nước, lạnh khô, thêm muối hoặc đường.

Bảo quản nhờ hóa chất

Bổ sung các chất ức chế đặc hiệu như: axit hữu cơ, nitrat, sulfua dioxit

Phóng xạ

Sử dụng các tia gamma và u v

ứ c chế các vi sinh vật gây hỏng nhờ vi sinh vật

Bồ sung vào thực phẩm các chất như bacteriocin do vi khuẩn sinh ra để loại trừ các vi sinh vật gây hư hỏng

25.3.1. Loại bỏ các vj sinh vật Các vi sinh vật có thể được loại bỏ khỏi nước, rượu vang, bia, nước ép hoa quả, các loại đồ uống nhẹ, và các chất lỏng khác bằng cách lọc. Cách này có thể làm giảm hoặc loại bỏ hoàn toàn vi sinh vật. Sử dụng màng lọc và ly tâm có thể đạt được hiệu quả tối đa. Đối với bia, người ta lọc chứ không khử trùng Pasteur nhăm giữ được hương vị tự nhiên cùa bia.

25.3.2. Nhiệt độ thấp Làm lạnh ở nhiệt độ 5°c sẽ ngăn cản sự sinh trưởng của vi sinh vật, mặc dù với sự bảo quản tối ấy thì nhóm ưa lạnh và nhóm chịu lạnh thậm chí vẫn sinh trưởng và làm hư hỏng thực phẩm. Sự sinh trưởng chậm của vi sinh vật ờ nhiệt độ dưới - 10°c đã được nghiên cứu, đặc biệt với nước ép hoa quả , kem, và một vài loại trái cây. Nhiệt độ thấp làm giảm số lượng của nhiều vi sinh vật nhưng không dẫn đến giảm đáng kể ờ tổng số quàn thể vi sinh vật.

25.3.3. Nhiệt độ cao Kiểm soát quần thể vi sinh vật trong các loại thực phẩm bằng phương pháp dùng nhiệt độ cao có thể làm hạn chế một cách đáng kể sự lây lan bệnh tật và hư hỏng thực phẩm. Lần đầu tiên quá trinh này được Nicholas Appert sử dụng vào năm 1809 khi cung cấp mọt phương pháp an toàn để bảo quản thực phẩm, đặc biệt là khi tiến hành đóng hộp sản phẩm thương mại {hình 25. 7].

Việc vận chuyển và cung cấp thực phẩm cho một lượng lớn binh sĩ đã gặp nhiều khó khăn. Do nhu cầu phài dự trữ thực phẩm trong điều kiện tác chiến và khí hậu khẳc nghiệt đã khiến cho chính phủ Pháp ừao giải thưởng 12. 000. 000 ửans vào năm 1975 cho người nào nghĩ được cách giữ được thực phẩm còn tốt trong điều kiện chiến trường. Cuối cùng giải thưởng được trao cho Nicholas Appert, một người thợ làm kẹo, do ông tìm ra cách đưa thịt và các sản phẩm khác vào dụng cụ, đóng kín lại rồi gia nhiệt. Nhờ thể sản phẩm được giữ ổn định được rất lâu. Mặc đù đã có công trình nghiên cứu đi trước của Leuwenhoek, nhưng Appert không có khái niệm gì về vi sinh vật để giúp cho việc giải thích tính hiệu quả cùa quy trình cùa mình. Dụng cụ của ông là những bình thuỳ tinh lớn, bít kín bằng nút bần và keo cá. Bằng sự quan tâm và sự chú ý đặc biệt để mô tả tỉ mỉ, ông có khả năng làm nóng các chai này trong nước đun sôi để tạo ra thực phẩm có thể bảo quản trong vài năm. Công trình của Appert lả cơ sở quan trọng cho những nghiên cứu sau Louis Pasteur.

Hình 25.7: Một quy trình đổng hộp. Kiểm soát cảc vi sinh vậtỊà một bước rổt quan trọng vổ bảo quản thực phẩm. Ngựời công nhân đổ đậu vào trong một bể lởn, sạch đề làm súp rau. Sau khi làm xong súp thì cho vào các hộp. Môi hộp có thể được ỉàm nóng, rồi hàn kin. Quá trình diễn ra ở nhiệt độ từ 11 0 - Ỉ2Ỉ°C để tiêu diệt các vi sinh vật gây hư hỏng đồ hộp.

Hình 25.8: Bào quản thực phẩm bằng đong họp. Kỹ thuật này được sứ dụng rộng rãi và rất hiệu quả. Đóng hộp không đủng cổ thể gây ra hư hòng hộp.

Thực phẩm đỏng hộp được đun nóng ừong các thùng đặc biệt ờ nhiệt độ 115°c trong khoảng thời gian từ 25 đến hơn 100 phút, thòi gian chính xác và nhiệt độ phụ thuộc vào bản chát cùa thực phẩm. Đôỉ khi đóng hộp không giết chết tất cả các vi sinh vật, mà chỉ các sinh vật làm hỏng thực phẩm [chảng hạn như giữ lại các vi khuẩn không có khả năng sinh trưởng do tính axit của thực phẩm]. Sau khi xử lý nhiệt các hộp được làm nguội nhanh , thường là bàng nước lạnh. Sự diệt vi sinh vật theo phương pháp tiệt trùng Pasteur đòi hỏi phải làm nóng thực phẩm tới nhiệt độ không cao lăm nhưng đủ giết chết phần lớn các vi sinh vật gây bệnh và làm giảm tối đa các sinh vật gây hư hòng thực phẩm. Trong quá trình chế biến sữa, các loại bia và các loại nước ép hoa quả bằng nhiệt độ thấp thỉ giữ ở nhiệt độ 62. 8°c trong vòng 30 phút. Cảc sản phẩm cũng cỏ thể được giữ ờ 71°c trong 15 giây, một

665

nhiệt độ cao, quy trình ngắn. Sữa có thể được xử lý ở 125°c trong 2 giây vói quy trình nhiệt độ siêu cao. Quy trình ngắn đưa đến kết quả là hương vị tăng và hạn sử dụng được kéo dài. Mặc cho những cố gắng để loại trừ các vi sinh vật làm hư hỏng thực phẩm trong quá trình đỏng hộp, nhưng đôi khi những thực phẩm đỏng hộp vẫn bị hư hỏng nặng [hình 25.8]. Điều này có thể do thực phẩm bị hư từ trước khi đỏng hộp, sản xuất dưởi tiêu chuẩn ữong quá trình đóng hộp và sự rỉ nước ô nhiễm vào hộp trong thời gian làm mát. Thực phẩm hư hỏng có thể bị biến đổi về những đặc tính như màu sắc, kết cấu, mùi vị, và hương vị. Các axit hữu cơ, các sulfit, và các khí [đặc biệt là CƠ2 và H 2S] cỏ thể được tạo ra. Đổi với sự hư hỏng do axit hỏa, không tạo thành khí và hộp thực phẩm không bị căng phồng ra, nhưng đồ chứa bên trong thì bị chua vì có mặt các axit sinh ra do lên men. Neu các vi sinh vật gây hư hỏng thực phẩm do tạo ra khí, thì cả đáy cùa hộp cũng bị phình lên. Axit trong các thực phẩm cỏ độ axit cao cỏ thể phản ứng với sắt của hộp để giải phóng ra hydro và hình thành chỗ lồi khí hydro. Sự tạo ra hydro sulfit bởi Desulfoto macuỉum có thể gây ra sulfiia độc. Sự loại nước, chẳng hạn như làm lạnh khô để tạo ra các loại thực phẩm đông lạnh, hiện nay là một cách thức rất phổ biến để loại trừ sự sinh trưởng của vi sinh vật. Quy trình hiện đại này nhiều khi được thay thế cho các quy trinh cũ trong đó ngũ cổc, thịt, cá, và các loại trái cây được làm khô.

25.3.4. Bảo quăn bằng phương pháp hoá học Rất nhiều các chất hoá học có thể được sử đụng để bảo quản các loại thực phẩm, và những chất này được quy định nghiêm ngặt bởi Cơ quan Quản lý Thuốc và Thực phẩm Mỹ [the Ư. Food and D rug Administration] và được liệt kê vỉ là được công nhận về mặt an toàn, hoặc bởi GRAS [bàng 25. 5].

Chủng bao gồm các axit hữu cơ đom giản, sulfit, etylen oxit natri nitrit, và etyl formate. Các chất hoá học này ảnh hưởng tới các vi sinh vật bàng cách làm bất hoạt một vài yếu tổ quan trọng của tế bào. Chẳng hạn, chúng có thể phá huỷ màng sinh chất, hay làm biến tính nhiều loại protein cùa tế bào. Nhiều hợp chất khác cản trở chức năng của axit nucleic, do đó đã ức chế tế bào sính trưởng. Hiệu quả của các hoá chất dùng để bảo quản còn phụ thuộc vào pH cùa thực phẩm. Chẳng hạn, natri propionat hầu như có hiệu quả ở pH thấp, khi chúng về cơ bản không bị phân ly và có khả năng được các lipit của vi sinh vật thu nhận. Các loại bánh mỳ, với giá trị pH thấp của chúng, có thể được bảo quản bới natri propionate. Các chất bảo quản hoá học còn được sử dụng đổi với các sản phẩm ngữ cốc, bơ sữa, rau và trái cây. Natri nitrit là một chất hỏa học được sử dụng để bảo quản dăm bông, nước sốt, thịt muối và các loại thịt xông khói do có thể ức chế sự phát triển của C l o s t r i d i u m botuỉinum và ức chế các bào tử nảy mầm. Điều này giúp chúng ta khỏi bị ngộ độc và giảm thiểu múc độ hư hỏng cùa thực phẩm. Ngoài việc giữ cho thịt khỏi bị hư hỏng,

khi niưit phân giải thành axit nitric, phản ứng với sắc tố heme còn làm cho thịt có màu đỏ. Nitrit hiện nay được thêm vào với một lượng rất nhỏ, và có thể sẽ không sử dụng chúng. Bảng 25.5: Các nhỏm hóa chất chính sử dụng trong bảo quản thực phẫm Các chất bảo quán

Nồng độ cao nhất

Hiệu quả tới các vi sinh vật

Propionic axit /propionats

0.32

Nấm sọi

Bánh mỳ, bánh ngọt, bơ, ức chế trong quá trình nhào bột

Axit sorbic/sorbats

0.2

Nấm sợi

Bánh mỳ, bánh ngọt, bo, ức chể trong quá trình nhào bột

Benzoic axit/benzoats

0. 1

Nấm men, Nấm sợi

Bơ thực vật, hoa quả đầm, nước táo, sốt cà

Parabensa

0. 1

Nấm men, Nấm sợi

CácHoại bánh quy, đồ uổng không chứa cồn, hoa quả dầmt salat

SCựsuIíĩt

200-3ooppm

Côn trùng, vi sinh vật

R! đường, hoa quả khô, rượu vang, nước chanh

Natri diaxetat

700ppm

Gia vị, các loại hạt

Etylen /propylene oxit Dehitroaxetic axit Natri nitrit Caprylic axit Etyi formate

0.32

Nấm men, Nấm mốc, sâu hại Nấm mổc Côn trùng Clostridia Nấm mốc Nấm men, Nấm mốc

65ppm 120ppm 50-200ppm

Thực pbầm

Bánh mỳ Dẳu tây, bỉ ngô Các sản phẩm từ thịt Đóng gói bơ Hoa quả khô, các loại hạt

.........................

25.3.5. Sự bức xạ Sự bức xạ, cả sự ion hoá lẫn không ion hoá, đều cỏ một lịch sử đáng chú ý liên quan đến bảo quàn thực phẩm. Bức xạ tia từ ngoại được sử dụng để kiểm soát các quần thể vi sinh vật trên bề mặt các thiết bị phòng thí nghiệm và thiết bị xử lý thực phẩm, nhưng nó không thể xuyên sâu vào thực phẩm. Phương pháp chủ yếu được sử dụng cho sự khử trùng thực phẩm bằng bức xạ là chiếu tia gamma từ một nguồn Coban 60. Sự bức xạ điện từ có khả năng xuyên thấu rất mạnh và phải được sử dụng với các thực phẩm ẩm ướt bởi lẽ sự bức xạ này tạo ra các peroxit từ bên ừong các tế bào vi sinh vật, dẫn đến sự oxi hoá các thành phần tể bào mẫn cảm. Quá trình chiểu xạ thực phầm được đặt theo tên của Nicholas Appert [radappertization], có thể tăng hạn sử dụng của thực phẩm biển, .các loại trái cây và rau xanh. Để tiệt trùng các sản phẩm thịt thường sử dụng từ 4. 5 đển 5. 6 megarad. Deinococcus radiodurans là một trong số các vi khuẩn kháng bức xạ mạnh, chúng có cấu

667

trúc thành tế bào phức tạp và mô hình sinh trưởng bộ bốn. Ohúng cỏ một sức chống chịu rất mạnh với liều lượng bức xạ cao, mặc dù là cơ chế này hiện vẫn còn chưa được hiểu rõ.

25.3.6. ứ c chế bằng các sản phẩm của vỉ sinh vật Ngày càng có sự tăng cường sử dụng các bacteriocin [chất diệt vi khuẩn do vi khuẩn sinh ra] để bào quản thực phẩm. Bacteriocin là các protein diệt khuẩn, chúng liên kết với các vị trí đặc hiệu trên tế bào, ảnh hường tới tính nguyên vẹn và chức năng của màng tế bào. Sản phẩm được phê chuẩn hiện nay là nisin. Nisin được sản xuất từ một số chủng Streptococcus ỉactỉs, m ột protein phân tử nhỏ k ị nước, không độc đối với con người v à tác động chủ yếu lên vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là Enterococcus /aecaỉis. Nisin có thể được đặc biệt sử dụng trong các thực phẩm có độ axit thấp để tăng sự bất hoạt Clostridium botuỉinum trong quá trình đóng hộp và ức chế sự nảy mầm của các bào tử sổng sót. Bacteriocin hoạt động bằng cách làm tiêu hao lực đẩy proton [PMF] của một số vi khuẩn mẫn cảm. Những hợp chất này có rất nhiều tên, phụ thuộc vào các sinh vật sản sinh ra chủng. Bacterỉocin hoạt động bằng sự hình thành các rãnh ưa nước trên bề mặt củã một số vi khuẩn mẫn cảm, giải phóng các phân tử có khối lượng thấp; điều này xảy ra giống như sự ức chế tổng hợp peptidoglican, tác động giống như chất tẩy rửa lên màng sinh chất. Bổ sung bacteriocin vào các loại thực phầm như phomat sẽ làm giảm số lượng vi khuẩn Listeria monocytogens từ 2 đến 3 lần đối với phomat đã được bảo quản 180 ngày. Các hợp chất tương tự cũng đã tim thấy ứong các sinh vật nhân chuẩn.

25.4. CÁC BỆNH DẢN ĐẾN TỪ THựC PHẨM [Food-borne Diseazs] Các bệnh dẫn đến từ thực phẩm có ảnh hưởng toàn cầu. Ở Hoa Kỳ, theo thông tin gần đây từ Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh [the Centers of Diseazs Control and Prevention], các bệnh liên quan đến thực phẩm hàng năm xảy ra tới 76 triệu ca, trong số đỏ chỉ có 14 triệu ca biết được tác nhân gây bệnh. Trong số này, có 325 000 ca phải vào viện và ít nhẩt có 5 000 ca tử vong mỗi năm. Từ năm 1942, số lượng các mầm bệnh đâ biết sinh ra trong thục phẩm tâng lên hơn năm lần. Đó có phải là những vi sinh vật mới hay không? Trong hầu hết các trường hợp, những mầm bệnh này là các tác nhân đơn giản mà chủng ta có thể mô tả được, dựa vào sự hiểu biết về sự đạng vi sinh vật. Hiện nay, được biết các virút Norwalk, vi khuẩn Campylobacter jejuni và Salmonella là các nguyên nhân chỉnh gây bệnh từ thực phẩm. Ngoài ra, vi khuản Escherichia coỉi 0157:H7 vả Listeria là các tác nhân gây bệnh liên quan đến thực phẩm rất đáng chủ ỷ. Có hai loại cơ bản về bệnh ỉiên quan đến thực phẩm là: bệnh lây nhỉễm từ thực phẩm và sự nhiễm độc thực phẩm. Tất

cả các loại bệnh sinh ra từ thực phẩm này lại đều liên quan đến vấn đề vệ sinh. Cho dù là lây truyền qua nước hay qua thực phẩm thì con đường phân - miệng vẫn là chủ yếu. Chảng

hạn như vòi rửa, côc chén, và thớt cũng đóng một vai trò nhất định trong con đường lây nhiễm phân - miệng. 25.4.1. Sự lây nhiễm từ thự c phẩm [Food-borne infection] Sự lây nhiêm từ thực phẩm có liên quan đến các mầir* bệnh sinh trường bên trong vật chủ, bao gồm sự xâm chiếm vào các mô và hoặc giải phóng các chất độc. Các bệnh chù yếu thuộc loại này được tóm tẳt trong bảng 25. 6. Bang 25.6: Một số bệnh nhiễm khuẩn sinh ra từ thực phẩm 1 Thò'i gian tồn tại Nguồn thực phẩm Bệnh Vi sinh vật trong thực phẩm và các đặc tính Bệnh do Salmonella

typhinmrinm, s. erỉteritidis

8—48 giờờtliịt Enterotoxin và Cytotoxin

Gia súc, cá, trứng, Các sân phẩm bơ sữa

Bệnh tiêu chảy do Arcobacter

Ârcobacter buizleri

Tiêu chày cấp, chửng co ruột hồi quy

Bệnh do Campylobacter

Campylobacterjejuni

Tinrờng từ 2-10 ngày Hầu hết các độc tố là bền nhiệt

Bệnh do Listeria

monocytogens

Bất định, liên quan đến viêm màng não, sảy thai

Sản phầm thịt, đặc biệt là thịt lợn, sữa

Escherichia coli

coỉi, gồm cà serotyp 0157:H7

24-72 giờ

Thịt bò tái, sữa chưa tiệt trùng

24-72 giờ

Sản phấni cùa trứng, bánh pudding

Bệnh do Shigella

Shigella sonnet, jiexneri

Các sản phẩm thịt, đặc biệt là sàn phẩm gia súc Sữa, thịt lợn, các sàn phẩm gia súc, rurớc

Bệnh do Yersinia

Yersinia enterocoỉitỉca

16—8 giờ Một số độc tổ bền nhiệt

Sữa, các sản phẩm thịt và phomát

Tiêu chảy do Plesiomonas

Pỉesiomonas shigeỉỉoides

1-2 giờ

Động vật thân mềm chưa chế biến.

Vibrio parahaeinolyticus

Vibrio parahaemoỉyticus

16—4S giờ

Hải sàn, động vật thân mềm

Bệnh nhiễm khuẩn Salmonella do sự hấp thụ nhiều loài Salmonella, đặc biệt là s. typhimurium và s. enteritidis. Viêm dạ dày ruột [gastroenteritis] là căn bệnh nguy hiểm liên quan tới các loại thực phẩm như là các loại thịt, trứng, cùng với các triệu chứng nặng

669

xảy ra sau một thời gian ủ bệnh ngấn, khoảng 8 giờ. Sự lây nhiễm Salmonella cỏ thể tăng lên do nhiễm bẩn từ các công nhân trong các nhà máy, cừa hàng. Campylobacter jejuni được coi là một trong những nguyên nhân đẫn đến viêm dạ dày ruột cấp tính ở người và có thể liên quan tới mọi lứa tuổi. Mầm bệnh quan trọng này thường được truyền từ các sản phẩm gia cầm không hoặc chưa được nấu chín. Chẳng hạn, sự lây truyền thường xảy ra khi các dụng cụ của bếp ăn vả các hộp chứa được sử dụng để chế biến thịt gà và sau lại sủ dụng để làm salat. Chỉ khoảng 10 tế bào Campylobacter jejuni sống cũng có thể đẫn đến tiêu chảy. Ngoài ra c. jejuni còn được truyền từ sữa chưa được xử lý và chúng đã được tìm thấy trong rất nhiều loại thịt đỏ. Nấu chín kĩ thực phẩm giúp chống lại sự lây nhiễm các bệnh. Bệnh do Listeria gây ra bởi Listeria monocytogens vẫn còn là đáng quan tâm, chẳng hạn như sự bùng phát bệnh xảy ra ờ Nam California vào năm 1985. Sự bùng phát này xảy ra đo khử trùng không đúng theo phương pháp Pasteur đối với sữa đùng trong sản xuất phomat kiểu Mexico, ít nhất 86 trường hợp lây nhiễm bệnh , trong đó 58 trường hợp cỏ liên quan đến các cặp mẹ và con, 47 người đã tử vong. Sự kiện này đã được phát hiện nguyên nhân là đo rò ri các hộp trong quy trình khử trùng theo phương pháp Pasteur. Các lỗ rò rỉ này đã cho phép các vi khuẩn lọt vào bên trong sữa chưa được xử lý rồi nhiễm vào sữa trước khi sản xuất phomat. Hiện nay, Eschirichia coỉi được coi là vi khuẩn gây bệnh từ thực phẩm đáng được lưu tâm. E. coli 0157:H7với kháng nguyên đặc hiệu thân [O] và kháng nguyên ỉông [H], được cho là đã nhận các gen độc, gây tiêu chảy từ Shigeỉỉa làm cho chúng cỏ khả năng gây ra bệnh mới. Chủng này được phát hiện đầu tiên vào năm 1982, hiện nay đa được nghiên cứu rất kỹ. Mầm bệnh lan truyền qua con đường phân - miệng với liều gây nhiễm chỉ khoảng 500 vi khuẩn. Bệnh tiêu chày ra máu do E. coỉi đã được tìm thấy ở các sản phẩm thịt như hamburger, xúc xích Ý, trong các đồ uổng nưỏc ép trái cây không được khừ trùng theo phương pháp Pasteur, trên các loại hoa quả, rau xanh và ở cả nước giếng chưa được xử lý, Tháng 8 năm 1997, khoảng 1,1 tấn hamburger đã bị thu hồi do một xí nghiệp chế biến thịt đã để nhiễm E. coli 0157:H7. Vài năm sau, một em bé đã tử vong ở Denver, Colorado sau khi uống phải nước trái cây khồng được khử trùng theo phuctng pháp Pasteur. Nhìn chung, ừẻ em là những người dễ mẫn cảm với loại mầm bệnh này. Phòng chống nhiễm E. coĩi 0157:H7 vào thực phẩm là điều vô cùng quan trọng từ khâu sản xuất cho đến khâu tiêu thụ. vấn đề vệ sinh phải được kiểm tra kĩ càng trong các lò mổ lớn, nơi đễ xảy ra sự tiếp xúc giữa thịt với phân. Thậm chí các loại trái cây và rau xanh cũng cần phải được quân lý một cách cẩn thận khi nhập khẩu vì có thể gây ra bùng phát bệnh. Tránh làm nhiễm khuẩn thực phẩm .qua tay và cảc dụng cụ, làm sạch thởt thái và các đồ đùng một cách thích hợp để làm giảm tổi đa sự lây nhiễm. Có thể giảm thiểu nguy cơ này bàng cách tiêu diệt các mầm bệnh bằng tia gamma, một phương pháp bảo quản thực phẩm sẽ được sừ dụng rộng rãi.

670

Một tác nhân lây nhiễm khác đang là mối lo láng toàn cầu trong vấn đề an toàn thực phâm là prion, tác nhân gây ra bệnh Creuzfeldt —Jakob [CJD]. Đây là một nhóm bệnh gây thoái hoá dan dân thân kinh được gọi là bệnh xốp não, xuất hiện ừong các trang trại nuôi bò và được gọi là bệnh bò điên. Hiện nay, do xảy ra nhiều bệnh CJD mới ở người nên lệnh câm nhập khâu thịt bò đã được ban hành ở rất nhiều khu vực. Phương thức chủ yếu lây truyên CJD giữa các động vật là do sử dụng các mô động vật có vú làm thức ăn cho động vật nhai lại. Hiện tại còn nhiều khó khăn ữong việc phát hiện những sản phẩm động vật bị cấm được dùng làm thức ăn cho động vật nhai lại. Thực phẩm được vận chuyển và tiêu thụ ờ trạng thái không nấu là nguồn chính gây nên sự lây nhiễm các bệnh. Đáng lưu ý hơn khi tiếp xúc với nước bị nhiễm bẩn tại bất cứ thời điểm nào của việc sản xuất và tiêu thụ. vấn đề này trở nên cấp bách hơn khi sự luân chuyển ngày càng tăng các sản phẩm tiêu thụ trên khắp thế giới, đặc biệt là các sản phẩm sống sẽ làm gia tăng sự lây nhiễm bệnh.

Hình 25.9. Phát hiện viruí dựa trên phương pháp nuôi cạy và phương phâp phân tứ. _ X J í'ĩ S T ’■ t r M , f uíỉ ° Ỉt/J! Th/m P5 ĩkht ù f khả L CứCí ĩnmẩt ; thì S vân ậl chi năng tạo thành vệt tan

Hình 25. ÌO. Cyclospora cayetạnemỉs, một dọng nhiêm qmn trọng ở thực phâm chưa chê biến. Cycĩospora cayetanensis thường CÓmột ở nưởc •*■ «V nhiẽT òi thêphan lập đ w c Z „ g Z : phẩm bị nhiễm do CÓchửa một nang họp tử với hào tư nang. bar-5fm.-

kiểm tra được sự có mội của nucleic axit. Cỏ linh lăng, các loại hạt đậu, cải xoong, đậu xanh, mù tạt, hạt đậu nành bị nhiễm bẩn có thể là các nguồn chủ yếu gây ra thương hàn và dịch tả. Các loại động vật biển thân mềm và một sổ loài cá cũng là những mối lo lắng đáng kể trong vấn đề an toàn thực phẩm. Nước thải chưa được xử lý có thể lây nhiễm vào các khu vực cá sinh trưởng, thêm nữa các mầm bệnh từ nước rihư Vibrio phổ biến trong các

671

nguồn nước ở các tháng ấm áp. Các loại virut cũng là vấn đề nan giải. Sò là loài lọc được khoảng vài lít nước mỗi ngày, từ đó dẫn đến sự tập trung tiềm tàng của ít nhất 100 loại virut đường ruột khác nhau. Phương pháp RT —PCR có thể dùng để phát hiện ARN của các virut trong sò. Tuy vậy, sự hạn chế của các kỹ thuật sinh học phân tử để phân biệt giữa các phân tử lây nhiễm và không lây nhiễm lại là một vấn đề lớn. Chẳng hạn, xử lý u v có thể bất hoạt rất nhiều ARN của virut mà không cần phải loại trừ tín hiệu RT —PCR cho dù các virut không còn tái sính trong môi trường thích hợp nữa. [hình 25. 9]. Các cơn mưa lớn ờ những vùng động vật thân mềm sinh sống có thể gây ra sự lan tràn mầm bệnh. Sự vận chuyển các sản phẩm nông nghiệp thô bàng đường hàng không đang là vấn đề đáng được lưu tâm. Một ví dụ điển hình là việc xuất khẩu quả mâm xôi từ Trung Mỹ vào Hoa Kỳ và Canada đã gây ra sự bùng phát nhiễm độc Cycỉospora cayetanensis, một loại động vật nguyên sinh đơn bảo gây tiêu chảy ờ người. Loài sinh vật này có chu trinh sống phức tạp, so với Giardia và Cryptosporidium, những loài lây nhiễm ngay sau khi rơi vào phân, thì Cycỉospora không lập tức lây nhiễm; sự hình thành bào tử và sự trưởng thành cần 12 tiếng sau khi giải phóng khỏi cơ thể.

25.4.2. Sự nhiễm độc từ thực phẩm [Food-borne Intoxications] Sự sinh trường của vi sinh vật trong thực phẩm có thể dẫn đến ngộ độc thực phẩm, các triệu chứng ngộ độc được biểu hiện ngay sau khi tiêu hoá thực phẩm. Chất độc được tạo ra ừong thực phẩm có thể liên kết với các tể bào vi sinh vật hoặc có thể được giải phóng ra khòi tể bào. Hầu hết các chủng Staphylococcus aureus gây viêm ruột có liên quan đến sự tổng hợp các ngoại độc tố. Do một số protein chịu được nhiệt nên việc đun nóng không thể đáp ứng được vẩn đề an toàn thực phẩm một cách triệt để. Tác động của các độc tố rất nhanh nên triệu chửng bệnh thường xảy ra ữong vòng 2 đến 6 giờ. Khoang mũi của người là nơi lưu chứa các s. aureus, thông thường vi khuẩn này được truyền từ tay người này sang người khác rồi lây nhiễm vào thức ăn. Sự sinh trưởng và tạo ra các độc tố ruột thường xảy ra khi thực phẩm bị nhiễm khuẩn để ở nhiệt độ phòng ứong vài tiếng. Ba loại trực khuẩn Gram dương là nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm là Clostridium botuỉinum, Clostridium perfringens và Bacillus cereus. Thực phẩm bị nhiễm Clostridium perfringens ngày càng ưở nên phổ biến. Những vi sinh vật này sính ra các ngoại độc tố, khi sinh trường đến mức 106 vi khuẩn ưên một gam thực phẩm hoặc cao hom mới dẫn đến khả năng gây bệnh. Chúng thường cư trú ở đất trồng trọt, nước, thực phẩm, chất điều vị và ở đường ruột. Các tế bào hình thành bào tử trong đường ruột. Độc tố ruột là một loại protein đặc biệt, được tạo ra trong suốt quá trình hình thành bào tử. Độc tố ruột có thể được phát hiện trong phân cùa người bị nhiễm độc. Thực phẩm nhiễm độc c. per/ringens rất phổ biến và xảy ra sau khi sản phẩm thịt được hâm nóng. Nếu thực phẩm

672

được làm nguội từ từ thì sự sinh trưởng của vi sinh vật có thể xảy ra. Ở 45°c, sau khi bắt đầu sinh trường 3 giờ, độc tố ruột có thể được phát hiện ra. Hàng loạt các triệu chửng: tiêu chảy, b u ồ n nôn, và co rút bụng có thể xảy ra ừong vòng 8 đến 16 tiếng. Khoai tây bỏ lò được bọc trong các giấy nhôm có thể là môi trường tốt cho các vi sinh vật gây bệnh, thậm chí ngay cả sau khi rửa sạch thì khoai tây vẫn có c. botuỉinum do chúng tồn tại trong đất từ trước. Nếu khoai tây bọc trong giấy nhôm không được cấp đủ nhiệt trong quá trình nướng thì các Clostridium vẫn có thể sống sót và nhanh chóng tạo độc tố sau khi bỏ ra khỏi lò. B. cereus cũng là mối lo lắng cho các thực phẩm chửa tinh bột. Chúng có thể gây ra hai loại bệnh khác nhau phụ thuộc vào loại độc tố sinh ra: một loại gây nôn và buồn nôn với thời gian ủ bệnh từ 1 đến 6 giờ, còn một loại thì gây ỉa chảy với thời gian ủ bệnh từ 4 đến 16 giờ. Loại gây nôn thường xuất hiện trong cơm, trong khi loại gây ia chảy lại xuất hiện nhiều loại thực phẩm khác nhau. 25.5. PHÁT HIỆN CÁC TÁC NHÂN GÂY BỆNH SINH RA TỪ T H ự C PHẢM Một vấn đề chính trong việc duy tri an to à n thực phẩra ỉà việc cần th iế t phải nhanh chóng tìm ra các vi sinh vật để hạn chế sự bùng phát, lây lan ừong cộng đồng. Quá trình này rất quan trọng do sự phân phối lan tràn các nguồn thực phẩm dễ ôi thiu. Các kĩ thuật nuôi cấy vi sinh đạt tiêu chuẩn có thể đòi hỏi hàng ngày đến hàng tuần để phát hiện một cách chắc chắn về các mầm bệnh. Việc phát hiện thường phức tạp do sự tồn tại của các mầm bệnh ít hơn so với các vi sinh vật bản địa. Hơn nữa, thành phần cấu tạo hóa học và vật lí khác nhau của thực phẩm có thể làm cho việc phân ỉập ừở nên khỏ khăn. Kĩ thuật kháng thể huỳnh quang, kỹ thuật ELISA, kỹ thuật miễn địch phóng xạ cho kết quả được công nhận. Những kĩ thuật này có thể được sử dụng để phát hiện ra lượng nhỏ các kháng nguyên gây bệnh đặc hiệu. Các kĩ thuật sinh học phân từ cũng được sử dụng thêm trong việc phát hiện các vi sinh vật gây bệnh. Các phương pháp này cho 3 mục đích: [1] phát hiện sự cỏ mặt của mầm bệnh một cách đặc hiệu; [2] phát hiện các loại virut không thể sinh trưởng một cách thuận lợi [3] phát hiện các mầm bệnh sinh trưởng chậm hoặc không thể nuôi cấy. Các mầm bệnh hiện nay cỏ thể được nhận điện bởi trình tự baza ADN và ARN với các mẫu dò đặc hiệu, thường từ 14 đến 40 bazơ. Chúng có thể được tạo nên nhờ các endonucleaz giới hạn hoặc bằng tổng hợp hóa học trực tiếp. Các mẫu dò được đánh dấu bằng cách kết hợp với các marker enzym, các đồng vị, hoặc phát quang/huỳnh quang. Ưu điểm chính trong việc sử dụng phương pháp này đỏ là độ đặc hiệu và tốc độ tìm kiểm các vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy.

to*3-d»oxy-6*ptKaphoglLỉConat« Pyruvat®

1 bite lynipha B hff t trò*f ttiyến lie tióá tró*|iềy

Bài Viết Liên Quan

Toplist mới

Bài mới nhất

Chủ Đề

to3-d»oxy-6ptKaphoglLỉConat« Pyruvat®

1 bite lynipha B hff t tròf ttiyến lie tióá tró|iềy