Trong những năm gần đây, nhờ áp dụng công nghệ mới, người ta đã rút ngắn thời gian cần thiết để đưa một giống mới có khả năng cho năng suất cao, ổn định phẩm chất vào trồng qui mô lớn. Trong đó, kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật đã được đưa vào các chương trình chọn giống, nhân giống hiện đại.
- Điều kiện nuôi cấy tế bào thực vật
- Quy trình nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy mô
- Thực hành nuôi cấy mô
Lợi điểm của phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật:
- Tạo ra các cây con đồng nhất và giống với cây mẹ, tránh trường hợp bị thoái hóa giống đối với cây trồng thuộc nhóm thụ phấn chéo.
- So với kiểu nhân giống vô tính thông thường [chiết, giâm, ghép cành], nhân giống bằng nuôi cấy mô có ưu điểm là có thể nhân một số lượng lớn cây con từ một các thể ban đầu trong một thời gian ngắn.
- Có thế tạo ra cây con sạch bệnh nhờ áp dụng việc chọn lọc vật liệu ban đầu một cách chặt chẽ hoặc làm cho vật liệu ban đầu trở nên sạch bệnh.
- Không chiếm nhiều diện tích, không bị ảnh hưởng bởi thời tiết, điều kiện ngoại cảnh.
- Việc trao đổi giống được dễ dàng.
Điều kiện nuôi cấy tế bào thực vật
Yêu cầu cơ bản nhất của một phòng nuôi cấy mô là phải bảo đảm vô trùng. Khái niệm vô trùng này bao gồm vô trùng môi trường nuôi cấy, vô trùng phòng nuôi cấy và cả sự bảo đảm sao cho mẫu nuôi cây được hoàn toàn vồ trùng. Điều đó đòi hỏi hai thiết bị cần thiết:
- Thiết bị tiệt trùng hay nồi tiệt trùng [autoclave]; thiết bị này được dùng để thanh trùng môi trường và cả dụng cụ thí nghiệm. Thiết bị tiệt trùng có thể theo nguyên tắc nhiệt từ hơi nước hoặc nhiệt từ không khí khô.
- Buồng nuối cấy hay phòng nuôi cấy: phải được tiệt trùng bằng tia tử ngoại và được vệ sinh liên tục sau mỗi lần thao tác. Có thể làm vệ sinh bằng dung dịch formol 40%.
Các yêu cầu cở bản của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật:
- Khi thiết lập phòng nuôi cây mô thực vật phải bảo đảm được tính liên tục thuận lợi cho các thao tác, các giai đoạn trong suốt quá trình nuôi cấy mô.
- Đảm bảo được vệ sinh [tính vô trùng] của sản phẩm cuối cùng.
- Chuẩn bị môi trường đúng cách, chọn đúng môi trường cho từng loại thực vật và từng giai đoạn nuôi cấy.
- Chọn và xử lý mô thích hợp trước khi nuôi cấy.
Quy trình nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy mô
Hiện nay, người ta xây dựng quy trinh nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy mô khác nhau tùy từng loại cây. Ta có thể viết qui trình chung như sau:
Thực hành nuôi cấy mô
Thiết bị dụng cụ
Các thiết bị của phòng thí nghiệm vô trùng:
+ Nồi hấp vô trùng.
+ Tủ cấy vô trùng.
Các thiết bị căn bản:
+ Tủ lạnh,
+ Tủ sấy.
+ Cân phân tích.
+ Máy đo pH.
+ Máy cất nước.
+ Bếp đun môi trường.
+ Kính lúp 2 mắt.
Các thiết bị trang bị cho phòng sáng nuôi cây:
+ Kệ để bình mô có gắn đèn.
+ Máy điều hòa nhiệt độ
Dụng cụ thủy tinh và vật dụng nhỏ:
+ Ống nghiệm 150 x 24mm.
+ Bình tam giác 300ml.
+ Gòn không thấm.
+ Pippette các loại.
+ Becher 250ml, 500ml, 1000ml.
+ Ống đồng 1000ml.
+ Bếp đun mõi trường.
十 Nồi nấu môi trường bằng inox.
+ Piĩice, dao mổ và các dụng cụ khác.
一 Các hóa chất khử trùng mẫu vật：
4- Benzalkonium chloride [0,01 – 0,1%]
+ Calcium hypochỉoride [9 – 10%].
+ Hydrogen peroxide [3 – 12%],
+ Silver nitrate [1%]*
+ Sodium hypochloride [0,5 – 5%].
+ Alcool tuyệt đối-
—Các hóa chất pha mỏi trường nuôi cấy:
Ví dụ: môi trường Murashige – Skoog [MS] gồm các thành phần sau:
| NH4N03 | 1650 | mg/1 |
| KNOS | 1900 | mg/1 |
| CaCl2.2H20 | 440 | mg/1 |
| KH2PO4 | 170 | mg/1 |
| MgS04.7H20 | 370 | mg/1 |
Na2EDTA
FeSCXi
MnS04. 4H20 H3PO4
ZnS04. 4H20 KI
CuS045H20 C0CỈ2. 6H2O
37,3 mgA
27,8 mg/1
22,3 mg/1
6,2 mg/l
8,6 mg/1
► Acid amin và Vitamin:
2,0 – 100 – 1, 0 – 30,0 – 63
mg/1 – mg/1 – mg/I – mg/1 – mg/I
Glycin Inositol Thiamin HC1
+ Các chất điều hòa tăng trưởng; IAA, IBA, NAA, cytokine, gibbereliin.
4. Phương phảp tiến hành
- Điều chế môi trường nuôi cấy: Để việc pha chê môi trường được dễ dàng, người ta thường sử dụng các dung
dịch đậm đặc hóa chất đế dưa vào trong thành phần cúa môi trường, gọi là “dung dịch mẹ”. Có thể điều chế dung dịch mẹ chỉ có 1 hóa chất hoặc gồm nhiều hóa chất. Người ta thường dùng 5 dung dịch mẹ:
-1 dung dịch mẹ bao gồm tất cả các muối khoáng đa lượng [macro—elements] ngoại trừ muối Calcium [để tránh sự trầm hiện]; có thể làm đậm dặc chúng 100 lần,
-1 dung dịch mẹ gồm muôi Calcium [X 100].
—1 dung dịch mẹ gồm các muôi vi lượng [micro elements [xlOO],
-1 dung dịch mẹ gồm các vitamin nhóm B [X 1000],
-1 dung dịch mẹ gồm Fe 一 EDTA [X 100].
-1 dung dịch mẹ gồm các vitamin nhóm B {X 1000], ngoại trừ Myo-inositol sẽ dược hòa tan trong lúc điều chế môi trường.
-Đối với chất điều hòa tãng trưởng, người ta pha chế 1 dung dịch mẹ có nồng độ là 0,1 g/I hoặc 0,1 mg/1.
Môi trường được pha chế theo các bước sau:
- Pha loãng ĩũiẰốì khoáng [macro và micro elements], kẽ đến điều chỉnh thể tích bằng ống đong.
- Đo pH, điều chỉnh pH với KOH và HC1 N/10t thông thường pH từ 5,5 đến 5,8 tùy yẽu cầu.
- Thêm đường, agar vào, lắc đều.
- Đun nóng môi trường cho đến lúc sôi hoàn toàn trong lúc lắc liên tục môi trường.
- Khi agar tan hoàn toàn, thêm các vitamin, các chất điều hòa tăng trưởng và các chất khác.
- Lắc đều môi trường.
- Phân phối môi trường vào các bình chứa bằng thủy tinh dùng cho sự nuôi cấy.
- Khử trùng môi trường cấy: môi trường cấy được khử trùng bằng autoclave ở 120°c trong 20 phút-
- Chọn lựa và khử trùng mô thực vật
Tất cả các bộ phận của thực vật đều có khả năng nuôi cấy, nhưng để thành công, ta sử dụng đôt của cây.
Thực hành: Chọn những đoạn thân non, khỏe mạnh của cây sung Mỹ, cắt thành từng do’t.
Khứ trùng mô cấy: Tùy từng loại cây mà ta chọn loại hóa chất và thời gian khử trùng khác nhau. Cách khử trùng tiêu biếu:
—Rửa kỹ mẫu bằng nước sạch.
-Rửa mẫu bằng xà phòng 3 lần.
—Rửa sạch xà phòng bằng nước cất,
-Ngâm alcool 70° trong 丄 phút.
一 Rửa sạch alcool bằng nước cât vô trùng.
-Ngâm mẫu vào dung dịch hypochloride calcium 6% trong 25 phút.
-Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho sạch hypochloride calcium.
- Chuẩn bị cấy; Để chuẩn bị cấy, tiến hành các thao tác sau đây:
-Dùng bông gòn tẩm alcool 70°, lau kỹ tất cả các thành đứng và ngang ở bên trong tủ cấy, lau bàn làm việc của tủ cây.
-Phun alcool 7Ữ° tất cả các góc kẽ tủ cấy.
—Mở đèn cực tím [UV], 5 phút sau mở quạt gió, tắt đèn cực tím,
-Đốt tất cả các dụng cụ sau khi nhúng chúng vào alcool 90°.
-Các dụng cụ được ngâm vào một cái ly có chân chứa alcool 90°.
-Đưa vào tủ cấy: đèn cồnfgiấy khử trùng để trong 1 túi [giấy nhôm hoặc bao bì], các hộp petri đã khử trùng, các bình nuôi cây có chứa môi trường cấy.
- Các thao tác khi làm việc trong tủ cấy vô trùng:
一 Trước khi làm việc cần rửa tay bằng xà bông tiệt trùng, kế đến ỉau tay bằng alcool 70° rồi rửa lại bằng nước vô trùng.
-Thay đổi thường xuyên các dụng cụ trong tủ cấy, các dụng cụ này được khử trùng thường xuyên [nhung vào alcool 90° rồi đốt], việc thay đổi dụng cụ thường được thực hiện sau khi làm việc trên 2 đến 5 mô thực vật,
一 Một khi mô đã sẵn sàng,chủng ta lấy chúng đi nhờ
- cái pince năm giữa ngón cái, ngón trỏ và ngón giữa, Đồng thời ngón út và ngón áp út của cùng bàn tay giữ lấy nút ống nghiệm [hoặc bình tam giác] để không đặt nút xuống mặt bànT nếu không sẽ dễ nhiễm trùng nút ảnh hướng đến bình nuôi cây.
- Đặt mô thực vật trên môi trường cấy trong một thời gian ngắn Dhâ^t, sự nhanh nhẹn là một trong những điều kiện thành công cưa các sự nuôi cấy.
一 Hở qua ngọn lửa một cách có hệ thống cổ các bình nuôi cấy, đậy nút lại,
Bình thường, các bình nuôi cây được đặt trong “phòng sáng” trên các kệ;
-Cường độ ánh sáng: 12w/m2 [khoảng 2.500 lux].
-Nhiệt độ được điểu chỉnh từ 20 đến 25°c.
-Thời gian chiếu sáng 16 giờ trong ngày.
Một khi các bình nuôi cây được đặt trong phòng sáng, ta cần kiểm tra sự nhiễm trùng của chúng, 1 tuần sau khi cấy.
Skip to content
Thành phần của môi trường nuôi cấy tế bào thay đổi tùy theo từng loại thực vật, loại tế bào, mô, cơ quan được nuôi cấy, các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của mẫu cấy cũng như mục đích nuôi cấy. Tuy nhiên môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật đặc trưng đều chứa các thành phần sau:
– Các nguyên tố đa lượng [muối nitơ, phốt pho, magie, canxi, kali, lưu huỳnh] : là thành phần không thể thiếu được vì chúng tham gia cấu thành các cơ quan tử trong cơ thể thực vật.
– Các nguyên tố vi lượng [muối sắt, kẽm, đồng, mangan, coban, molipden, bo, iot] . Các nguyên tố này tuy có hàm lượng thấp nhưng có vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự phát triển của thực vật ở giai đoạn xuân hóa, ngoài ra chúng còn là thành phần của enzym, xúc tác cho các phản ứng sinh hóa trong cơ thể. Ví dụ thiếu sắt tế bào mất khả năng phân chia, thiếu bo gây thừa auxin làm mô nuôi cấy có biểu hiện mô sẹo hóa mạnh nhưng lại xốp, mọng nước và tái sinh kém, molipđen tác động trực tiếp lên quá trình trao đổi đạm trong tế bào thực vật.
– Nguồn cabon: khi nuôi cấy in vitro thì các tế bào thực vật không có khả năng quang hợp nên đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon để tạo năng lượng cho các quá trình sinh lí, sinh hóa diễn ra bình thường trong tế bào. Đường sucrose là nguồn cacbon tốt nhất thường được sử dụng với nồng độ 2 – 3%. Đường có thể bị caramen hóa nếu bị hấp khử trùng quá lâu và sẽ ức chế phản ứng với các hợp chất melanoidin, một chất sẫm màu có phân tử lượng cao, ức chế sự phát triển của tế bào.
– Các vitamin: mô và các tế bào nuôi cấy tuy có tổng hợp được vitamin nhưng không đủ nên thường phải bổ sung vitamin vào môi trường nuôi cấy chủ yếu là: thiamin [B1] đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi cacbon và tham gia vào thành phần tổ hợp enzim xúc tác quá trình oxi hóa khử dehydrogenase xúc tác việc tách hydro ra khỏi các axit hữu cơ; pyridoxin [B6] tham gia vào thành phần các enzym khử cacbon và thay đổi vị trí nhóm amin trong các axit amin; myo – insitol giúp cải thiện sự tăng trưởng của mô, có vai trò trong sinh tổng hợp thành tế bào. Vitamin rất nhạy cảm với sự tăng trưởng của mô nuôi cấy, vitamin được sử dụng ở nồng độ thấp, nó có vai trò quan trọng trong sự tổng hợp tế bào.
– Các chất có nguồn gốc tự nhiên phức tạp: nước dừa, dịch chiết muối, dịch chiết cà chua, dịch chiết nấm men, dịch thủy phân cazein,… cũng được sử dụng trong nuôi cấy in vitro vì thành phần của chúng có nhiều chất thúc đẩy tăng trưởng tế bào và mô nuôi cấy. Nước dừa bổ sung vào môi trường các loại đường, protein, các axit hữu cơ, các axit amin, các chất kích thích sinh trưởng, các vitamin và các chất quan trọng khác có tác dụng tốt trong tăng trưởng của mô.
– Các chất làm rắn môi trường: agar là một polysaccarit thu được từ một số tảo thuộc ngành tảo đỏ. Agar được sử dụng để làm rắn môi trường, tạo giá thể nâng đỡ cây. Tùy đặc điểm nuôi cấy và chất lượng agar mà nồng độ sử dụng thay đổi từ 0,8 – 1,0%. Nếu sử dụng với nồng độ quá cao sẽ làm môi trường quá cứng và ảnh hưởng tới sự khuếch tán cũng như hấp thụ dinh dưỡng của mô, tế bào. Nếu như agar không tinh sạch thì nó có thể làm đục màu môi trường do các chất cặn trong agar gây nên. Agar có thể ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm bởi vì agar là một sản phẩm lấy từ tảo biển, nó có thể có những tác động sinh lí trên mô thực vật. Ngoài agar, một số hợp chất khác cũng đã được thử nghiệm thành công để làm rắn môi trường như Gerlit [là một polysaccarit tinh và trong suốt được hình thành trong quá trình lên men của Pseudomonas.
– Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: phytohoocmon là thành phần quan trọng bậc nhất của môi trường nuôi cấy. Nhờ những chất này mà các nhà nghiên cứu có thể điều chỉnh quá trình phát sinh hình thái thực vật in vitro. Trong nuôi cấy mô tế bào hai nhóm chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng rộng rãi là auxin và xytokynin:
-
Auxin là chất điều khiển sinh trưởng chủ yếu kích thích sinh trưởng tế bào làm tăng phân bào, gây hiện tượng ưu thế ngọn, kích thích sự hình thành rễ. Nhóm auxin bao gồm IAA, IBA, α – NAA, 2,4 – D có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp kích thích ra rễ, ở liều lượng cao auxin sẽ phát động sự tạo mô sẹo và thường gây nên các đột biến . 2,4 – D thường được sử dụng rộng rãi trong việc phát sinh mô sẹo; IAA, IBA, α – NAA thường được sử dụng trong việc phát sinh rễ
-
Xytokynin là nhóm các phytohoocmon dẫn xuất của adenin nó liên quan chặt chẽ đến quá trình phân bào, kích thích phân hóa chồi từ mô cấy. Các xytokynin thường dùng trong nuôi cấy là kinetin, BAP, zeatin giúp tạo số lượng chồi nhiều nhưng có kích thước nhỏ, có thể gây ra hiện tượng mọng nước [thủy tinh thể và kìm hãm sự tạo rễ] . Theo Skoog và Miller, tỷ lệ auxin/xytokynin cao thường có xu thế kích thích quá trình tạo rễ bất định, kéo dài chồi, ngược lại tỷ lệ trên thấp thì sẽ đẩy mạnh biệt hóa chồi và ức chế sự phát triển chồi, nếu tỷ lệ trung bình thì mô sẹo sẽ được hình thành.
-
Ngoài ra trong nuôi cấy mô tế bào người ta còn sử dụng nhóm phytohoocmon khác là GA [Gibberellic axit] . Gibberelin điển hình là GA3có tác dụng kích thích kéo dài lóng đốt và sự sinh trưởng của cây, phá vỡ trạng thái ngủ nghỉ của cây,… Nhưng so với auxin và xytokynin thì nhóm GA rất ít được sử dụng vì có biểu hiện ức chế sinh trưởng và phát sinh hình thái thực vật in vitro, đặc biệt là với mô thực vật một lá mầm, GA3 được đưa vào môi trường trong những trường hợp cần thiết để kéo dài những chồi bất định hoặc kích thích tái sinh chồi ở một số loài thực vật .
– pH của môi trường là một yếu tố quan trọng. Sự ổn định pH của môi trường là yếu tố duy trì trao đổi các chất trong tế bào. Ngoài ra sự bền vững và hấp thụ các chất phụ thuộc vào pH môi trường, đặc biệt mẫn cảm với pH môi trường là NAA, gibberellin và các vitamin. Sự hấp thụ các hợp chất sắt cũng phụ thuộc vào pH. pH môi trường thường ở 5,5 – 5,8 trước khi khử trùng. Giá trị pH đầu tiên của môi trường ảnh hưởng không nhỏ tới sự sinh trưởng và tổng hợp của tế bào. Khi pH môi trường thấp sẽ hoạt hóa các enzym hydrolase, dẫn tới kìm hãm sinh trưởng đồng thời kích thích sự già hóa của tế bào trong mô nuôi cấy. Giá trị pH đầu tiên của môi trường nuôi cấy luôn luôn ở trong khoảng 5,5 – 5,9. Vì hầu hết trong môi trường nuôi cấy đều không có chất đệm nên giá trị pH sẽ thay đổi trong quá trình khử trùng môi trường và trong quá trình nuôi cấy. Giá trị pH giảm nhanh chóng xuống 4,0 – 4,5 trong vòng 24 – 28 giờ sau khi cấy tế bào vào môi trường nuôi. Những thay đổi này liên quan đến sự hấp thụ amonium của tế bào.Tuy nhiên, giá trị pH sẽ tăng lên sau vài ngày và giữ ở mức độ ổn định 5,0 – 5,5 do có liên quan đến sự hấp thụ nitrate.
//hoachattekco.com/
- Nhắn tin qua Zalo
- Nhắn tin qua Facebook