So sánh pcr và giải trình tự dna

PCR cơ bản sử dụng DNA sợi kép bình thường làm mẫu. Trong khi đó Real-time PCR chỉ cho hoạt động với RNA làm mẫu. qPCR là phiên bản tiên tiến nhất có khả năng hoạt động với cả DNA và RNA dưới dạng mẫu.

PCR và RT PCR chỉ xác định sự hiện diện hay vắng mặt của một đoạn gen cụ thể trong một mẫu. Tuy nhiên, qPCR có khả năng xác định sự vắng mặt hoặc hiện diện của một gen trong một mẫu nhất định. Cũng như nó có thể xác định số lượng vật chất di truyền. Vì lý do này, chúng tôi phân loại PCR và RT PCR là các kỹ thuật định tính. Trong khi qPCR là một kỹ thuật định lượng.

Nguyên tắc cơ bản đằng sau PCR, RT PCR và qPCR

• PCR dựa trên ý tưởng cơ bản về khuếch đại DNA bằng cách thay đổi vùng nhiệt độ.
• RT PCR phụ thuộc vào quá trình sao chép ngược. Tại đây, RNA mẫu được phiên mã ngược để tổng hợp cDNA.
• qPCR phụ thuộc vào thuốc nhuộm huỳnh quang và đầu dò phát huỳnh quang khi phản ứng diễn ra. Sự phát huỳnh quang này tiếp tục tăng theo sự gia tăng của sản phẩm PCR.

PCR, RT PCR và qPCR đã trở thành một phần bình thường của cuộc sống con người sau khi đại dịch covid bùng phát. Do đó, điều quan trọng là phải hiểu thấu đáo về các kỹ thuật sinh học phân tử này.

Mọi người chắc chắn bị nhầm lẫn giữa các thuật ngữ này và coi chúng là đồng nghĩa. Nội dung này nhấn mạnh sự khác biệt chính giữa ba kỹ thuật này.

Bảng So Sánh

ASIS FOR COMPARISON

PCR RT PCR

QPCR

Nghĩa

Kỹ thuật sinh học phân tử cơ bản để tạo ra một số bản sao của đoạn DNA mong muốn. Kỹ thuật PCR phức tạp nhưng hiệu quả để khuếch đại các đoạn RNA bằng quá trình phiên mã ngược. Một loại kỹ thuật PCR thành thạo và có hệ thống chủ yếu được sử dụng để định lượng axit nucleic.

Nguyên tắc

Khuếch đại mồi bằng enzyme DNA polymerase DNA bổ sung (cDNA) được tổng hợp bằng quá trình phiên mã ngược của khuôn mẫu RNA với enzyme phiên mã ngược. Đầu dò Thủy phân hoặc Huỳnh quang thông qua thuốc nhuộm xen kẽ Kiểu Định tính Định tính

Định tính

hóa học phía sau

không huỳnh quang Không huỳnh quang

Huỳnh quang

Bản mẫu

Sử dụng phân tử ADN sợi kép. Dùng phân tử ARN làm khuôn mẫu.

Cả DNA và RNA đều có thể được sử dụng làm khuôn mẫu.

Mồi

Các đoạn mồi xuôi và ngược đơn giản và không có nhãn được sử dụng. Mồi ngược không gắn nhãn được sử dụng để phiên mã ngược. Mồi chuyển tiếp và đảo ngược cùng với các đầu dò được dán nhãn được sử dụng.

Enzym cần thiết

DNA polymerase được sử dụng làm enzyme (chủ yếu là Taq polymerase) Enzyme phiên mã ngược và DNA polymerase. Enzyme phiên mã ngược và DNA polymerase.

Độ nhạy

Ít nhạy hơn Nhạy hơn Có độ nhạy cao Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu thấp Độ đặc hiệu cao

Độ đặc hiệu cao

Độ phức tạp Đơn giản Tổ hợp

Tổ hợp

Khả năng nhiễm

Cao khi các ống phản ứng được mở thường xuyên để thêm mẫu, hỗn hợp phản ứng cũng như để phát hiện kết quả thông qua điện di trên gel. Cao khi các ống phản ứng được mở thường xuyên để thêm mẫu, hỗn hợp phản ứng cũng như để phát hiện kết quả thông qua điện di trên gel.

Khả năng nhiễm bẩn rất thấp vì phản ứng và đánh giá kết quả được thực hiện trong hệ thống qpcr khép kín thống nhất.

Quy trình làm việc

Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, khuếch đại và điện di trên gel agarose. Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, phiên mã ngược và hình thành cDNA, khuếch đại, điện di trên gel agarose. Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng, sao chép ngược (nếu cần), khuếch đại, phát hiện thời gian thực

bước

Biến tính, ủ và mở rộng. Phiên mã ngược theo sau là PCR bình thường.

Phiên mã ngược, khuếch đại PCR theo sau là phát hiện thời gian thực.

Thu thập kết quả\ thu thập dữ liệu

Khi kết thúc phản ứng. Khi kết thúc phản ứng. Trong quá trình phản ứng (giai đoạn lũy thừa) phân tích kết quả Bằng cách chạy sản phẩm PCR trong điện di trên gel và hiển thị gel dưới U.V. Transilluminator. Bằng cách chạy sản phẩm PCR trong điện di trên gel và hiển thị gel dưới U.V. Transilluminator.

Với các Đỉnh hoặc Đồ thị của các bộ khuếch đại trong quá trình phản ứng.

Nghị quyết

Độ phân giải khuếch đại thấp. Độ phân giải khuếch đại cao. Độ phân giải khuếch đại rất cao. Các ứng dụng Khuếch đại axit nucleic, Chẩn đoán, v.v. Phân tích Biểu hiện gen hoặc phát hiện mRNA của virus, chẩn đoán bệnh do virus, xây dựng thư viện cDNA, v.v.

Nghiên cứu và phát triển, Phân tích bộ gen, Phát hiện ung thư, Kỹ thuật di truyền.

Định nghĩa phản ứng chuỗi polymerase (PCR)

• Vào những năm 1980, nhà hóa sinh người Mỹ “Kary Banks Mullis”(1944 – 2019), đã phát minh ra phản ứng chuỗi Polymerase (PCR). Kỹ thuật này đã cách mạng hóa hoàn toàn lĩnh vực sinh học phân tử. đặt tên
• PCR tạo điều kiện cho việc tạo ra hàng tỷ bản sao DNA giống hệt nhau. Vì vậy, nó có thể được coi là tương tự như “máy Photocopy”.
• Nó cho phép các nhà khoa học đánh giá, khuếch đại và phân tích các đoạn DNA rất ngắn ngay cả từ một lượng nhỏ mẫu. Nó đóng một vai trò quan trọng trong các lĩnh vực khoa học hiện đại như:
  • Công Nghệ Sinh Học
  • Sinh học phân tử
  • Pháp y
  • Di truyền học
• Kỹ thuật PCR khai thác enzyme DNA polymerase để hoạt động. DNA polymerase mang đặc tính duy nhất nhờ đó nó có thể tổng hợp chuỗi bổ sung bằng cách sử dụng DNA mẫu.
• Quá trình khuếch đại xảy ra trong một cỗ máy được gọi là ‘Thermocycler’. Máy điều nhiệt cung cấp phạm vi vùng nhiệt độ cần thiết cho phản ứng.

Hỗn hợp phản ứng PCR

Một loạt các thành phần được yêu cầu cho phản ứng PCR, mỗi thành phần có một vai trò cụ thể và quan trọng. Một số thành phần quan trọng là-

• Khuôn mẫu: Đoạn DNA mong muốn cần khuếch đại được sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng.
• Đệm PCR: Đệm PCR thường được sử dụng để tạo ra môi trường hóa học phù hợp cho phản ứng cũng như ngăn ngừa bất kỳ sự thay đổi nào về độ pH.
• MgCl2: Các ion MgCl2 hoạt động như một đồng yếu tố cho hoạt động của DNA polymerase, tức là nó nâng cao hiệu quả công việc của Taq polymerase.
• Mồi xuôi và ngược: Mồi là các trình tự oligonucleotide ngắn. Những đoạn mồi này được thiết kế đặc biệt theo gen quan tâm được khuếch đại.
• dNTPs: Enzyme DNA polymerase sử dụng deoxyribonucleotide triphosphate ở cuối sợi đang phát triển để tiếp tục quá trình kéo dài.
• Taq Polymerase: Taq Polymerase là enzyme DNA polymerase đóng vai trò là động cơ cho phản ứng PCR. Chức năng chính của nó là kết hợp các dNTP vào chuỗi bổ sung đang phát triển.
• Lưu ý: Taq polymerase là một loại enzyme chịu nhiệt được chiết xuất từ một loại vi khuẩn có tên là Thermus Aquaus. Enzyme này có khả năng chịu được nhiệt độ khắc nghiệt và do đó không bị biến tính ở nhiệt độ cao trong bước biến tính.
• BSA: Albumin huyết thanh bò đóng vai trò chất ổn định trong phản ứng PCR vì nó ổn định sự cản trở không mong muốn của một số enzyme cắt giới hạn tại thời điểm tiêu hóa DNA. Do đó, cuối cùng nó giúp tăng năng suất của các sản phẩm PCR.
• Nước MiliQ: Đây là dạng nước có độ tinh khiết cao vì không chứa tạp chất ở dạng ion, khoáng chất, nuclease, v.v., do đó cung cấp môi trường thích hợp để pha loãng các thành phần PCR.

Các bước trong PCR

PCR có một quy trình phức tạp được thực hiện theo ba bước cơ bản ở các nhiệt độ riêng biệt tương ứng.

Đó là

PCR Procedure 11

1. Biến tính: Đây là bước đầu tiên mà tại đó hai sợi DNA được tách ra khỏi nhau dưới tác động của nhiệt độ cao hơn. Nhiệt độ được nâng lên đến 92- 95o C, do đó các liên kết hydro giữa hai sợi bị đứt và DNA bị biến đổi thành dạng sợi đơn.
2. Ủ: Ở giai đoạn này, các đoạn mồi xuôi và ngược được gắn vào các chuỗi mẫu bổ sung tương ứng của chúng. Nhiệt độ ủ được quyết định theo nhiệt độ nóng chảy của tổ hợp mồi.
3. Extension: Đây là thời gian kéo dài của sợi mới. Khi nhiệt độ đạt đến mức tối ưu, tức là 72oC, Taq polymerase được kích thích để kết hợp các dNTP vào chuỗi đang phát triển. Thời gian cần thiết cho bước này phụ thuộc vào độ dài của sợi mẫu.

Ba bước này được lặp lại dưới dạng một chu kỳ quyết định, được lên lịch trước trong máy luân nhiệt. Số chu kỳ của phản ứng thay đổi tùy theo mẫu được sử dụng và năng suất sản phẩm cần thiết.

Phân tích kết quả

Ngay sau khi phản ứng PCR hoàn tất, kết quả có thể được hiển thị trực quan với sự trợ giúp của điện di trên gel agarose. DNA sẽ thu được ở dạng dải có thể nhìn thấy dưới tia cực tím. đèn chiếu sáng

Định nghĩa RT PCR

• RT PCR hoặc PCR phiên mã ngược là phiên bản sửa đổi và hiện đại hóa của PCR cơ bản. PCR cơ bản hỗ trợ khuếch đại chỉ những sinh vật có DNA làm vật liệu di truyền của chúng. Tuy nhiên, RT PCR loại bỏ nghĩa vụ này. RNA được sử dụng làm khuôn mẫu ban đầu trong trường hợp RT PCR, cho phép khuếch đại cũng như phát hiện RNA.
• Kỹ thuật RT PCR thường sử dụng sức mạnh của enzyme phiên mã ngược để biến RNA thành dạng cDNA bổ sung. Xác suất này đã được chứng minh là một công cụ tối ưu cho các nghiên cứu và chẩn đoán liên quan đến RNA.

Quá trình RT PCR cần có hai bước-

Bước 1: Phản ứng phiên mã ngược

Bước 2: Khuếch đại PCR

• Là một chuỗi đơn, RNA có bản chất rất không ổn định và do đó rất khó xử lý. Bước bổ sung của phản ứng RT giúp giải quyết vấn đề này.
• Trong bước đầu tiên, đoạn RNA được phiên mã ngược thành cDNA bổ sung của nó với sự trợ giúp của enzyme phiên mã ngược. Bây giờ cDNA này đóng vai trò khuôn mẫu trong bước khuếch đại PCR tiếp theo.

Các bước chính liên quan là:

1. Chiết xuất RNA: Đoạn RNA mong muốn được phân lập từ các tế bào hoặc mô của sinh vật. Quá trình này có thể được thực hiện bằng giao thức trích xuất tiêu chuẩn với TRIzole và có thể được kiểm tra bằng máy đo quang phổ. RNA cũng có thể được chiết xuất trực tiếp bằng cách sử dụng bộ dụng cụ chiết xuất RNA.
2. Thiết kế đoạn mồi: Lưu ý đến gen mục tiêu, các đoạn mồi được thiết kế. Các đoạn mồi này có tính đặc hiệu cao và có khả năng phát triển và duy trì trạng thái song công với mẫu.
3. Tổng hợp cDNA: Bây giờ, phản ứng RT được sử dụng để sao chép các gen mục tiêu bằng cách phiên mã ngược RNA. Điều này dẫn đến sự hình thành cDNA bổ sung, cDNA này được khuếch đại hơn nữa bằng cách sử dụng khuếch đại PCR thông thường.
4. Khuếch đại PCR: Ở đây, cDNA mới được hình thành đóng vai trò là khuôn mẫu cho quá trình khuếch đại PCR cơ bản.

Lưu ý: Chất lượng, số lượng và độ tinh khiết của mẫu RNA là tiêu chuẩn chính để thực hiện RT PCR vì đây là một kỹ thuật cực kỳ nhạy cảm.

Định nghĩa về thời gian thực hoặc qPCR

• Biến thể PCR này chủ yếu được sử dụng để định lượng axit nucleic và do đó được gọi là PCR định lượng. Đây là PCR duy nhất có thể khẳng định chính xác lượng DNA hoặc RNA có trong mẫu tương ứng.
• qPCR là một phương pháp có nguồn gốc từ hạt nhân dựa trên thuốc nhuộm huỳnh quang, đầu dò phóng xạ và hầu hết các chất đánh dấu được dán nhãn đồng vị. Nguyên tắc cơ bản đằng sau qPCR là việc sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang và đầu dò được dán nhãn hỗ trợ phát hiện lượng sản phẩm khuếch đại tăng theo tỷ lệ.

Các phương pháp tiếp cận chính của qPCR

Có hai cách tiếp cận chính cho qPCR –

• Phương pháp dựa trên máy xen kẽ sử dụng thuốc nhuộm SYBR Green. Thuốc nhuộm này liên kết với các đoạn DNA mới được tổng hợp và phát ra huỳnh quang. Cường độ của huỳnh quang này tiếp tục tăng theo cấp số nhân với sự gia tăng của các bộ khuếch đại, có thể được nhìn thấy dưới dạng đồ thị và các cực đại.
• Phương pháp tiếp cận dựa trên đầu dò sử dụng đầu dò TaqMan PCR. Điều này cần một đầu dò oligonucleotide fluorogen bổ sung cùng với thuốc nhuộm chất khử và thuốc nhuộm huỳnh quang báo cáo được gắn vào nó.

Ưu điểm của qPCR

Có hai lợi thế quan trọng của kỹ thuật này

1. Nó cho phép sử dụng cả DNA và RNA làm mẫu. Nếu RNA được sử dụng làm khuôn mẫu, thì trong trường hợp đó, PCR phiên mã ngược sẽ trở thành bước đầu tiên của qPCR. Hình thức PCR hợp tác này thường được gọi là ‘RT-qPCR’.
2. Nó xác định kết quả định lượng trong chính quá trình, tức là trong thời gian thực của quá trình khuếch đại, và do đó, loại PCR này còn được gọi là ‘PCR thời gian thực’.

Một nhược điểm duy nhất của qPCR là chỉ có thể khuếch đại và phát hiện một loại sản phẩm cụ thể trong một mẫu tại một thời điểm.