Đánh giá hàm lượng ps trong linh chi năm 2024
|
TÓM TẮT Nghiên cứu này nhằm mục đích đánh giá khả năng kháng khuẩn của hệ vật liệu nano tổ hợp mang kháng sinh Ag-TiO2-Doxycycline-Alginate (TiO2 - Ag/ DO /Alg) đối với vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus - tác nhân chính gây bệnh hoại tử gan tụy cấp trên tôm Chân trắng. Trong nghiên cứu này, hệ vật liệu nano TiO2- Ag/ DO /Alg được tổng hợp tại Viện Khoa học Vật liệu – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chủng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus được phân lập từ 60 mẫu tôm bệnh trên cơ sở triệu chứng bệnh, đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh thái. Kết quả thử nghiệm cho thấy hệ nano TiO2-Ag /DO/Alg có hiệu lực diệt khuẩn V. parahaemolyticus tốt và vượt trội hơn kháng sinh DO thông thường (p<0.05). Hệ nano với nồng độ 50ppm cho đường kính vòng kháng khuẩn lớn hơn so với kháng sinh DO ở nồng độ 1000ppm (p<0.05).Từ khóa: TiO2-Ag /DO/Alg, Vibrio parahaemolyticus, bệnh AHPNS Công trình này công bố kết quả nghiên cứu cấu trúc, độ bền và bản chất liên kết hóa học của các cluster silic pha tạp Si2M với M là một số kim loại hóa trị I bằng phương pháp phiếm hàm mật độ tại mức lý thuyết B3P86/6-311+G(d). Theo kết quả thu được, đồng phân bền của các cluster pha tạp Si2M có cấu trúc tam giác cân, đối xứng C2v và tồn tại hai trạng thái giả suy biến có cùng độ bội spin (A1 và B1). Kết quả thu được cho thấy liên kết Si-M được hình thành chủ yếu từ sự chuyển electron từ AO-s của các nguyên tử Li, Na, K, Cu, Cr sang khung Si2 và sự xen phủ của các AO-d của nguyên tử Cu, Cr với AO của khung Si2. Kết quả nghiên cứu các cluster Si2M (M là Li, Na, K, Cu, Cr) cho ra kết luận rằng cluster Si2Cr là bền nhất. Cốt liệu cao su được nhận định sẽ giúp tăng khả năng kháng nứt do co ngót của vật liệu xi măng. Tuy nhiên hiện không nhiều các nghiên cứu sử dụng cốt liệu phế thải này trong lớp móng cấp phối đá dăm (CPĐD) gia cố xi măng (GCXM). Nghiên cứu này sử dụng cốt liệu cao su cỡ hạt 1÷3 mm thêm vào CPĐD Dmax25 gia cố 4% xi măng với tỉ lệ 1%, 2% và 5% khối lượng cốt liệu khô. Các loại CPĐD-cao su GCXM này được thí nghiệm đánh giá các chỉ tiêu cường độ và đặc biệt triển khai thi công thí điểm 2 loại CPĐD GCXM sử dụng 0% và 2% cao su. Kết quả cho thấy CPĐD GCXM trộn thêm 1% và 2% cao su đạt cường độ yêu cầu làm lớp móng trên. Ngoài ra, đã quan sát được 2 vết nứt rộng khoảng 1 mm xuất hiện ở ngày thứ 30 trên lớp móng GCXM không trộn thêm cốt liệu cao su trên toàn bộ bề rộng lớp móng (3,25 m), trong khi đó CPĐD GCXM thêm 2% cao su không xuất hiện vết nứt. Điều này chứng tỏ cốt liệu cao giúp CPĐD GCXM giảm co ngót và hạn chế nứt do co ngót. Nghiên cứu góp phần thúc đẩy sử dụng cốt liệu cao su được... Nghiên cứu sử dụng dịch trích vỏ quả lựu được thực hiện để đánh giá khả năng ức chế tinh thể Calcium oxalate, gồm 03 giai đoạn chính là hình thành, phát triển và ngưng tụ. Mẫu vỏ quả lựu được ly trích bằng phương pháp ngâm dầm với ethanol 80% để tạo cao chiết. Phần trăm ức chế hạt nhân tinh thể Calcium oxalate của cao chiết vỏ quả lựu được xác định bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 620 nm; trong khi đó, hiệu quả ức chế phát triển tinh thể Calcium oxalate của cao chiết được đánh giá bằng mật độ quang của mẫu thử ở bước sóng 214 nm trong thời gian 600 giây. Hiệu quả ức chế ngưng tụ tinh thể calcium oxalate của cao chiết được xác định bằng cách đo lường mật độ quang ở bước sóng 620 nm vào các khoảng thời gian 30, 60, 90, 180 và 360 phút. Kết quả nghiên cứu cho thấy, độ ẩm của mẫu đạt 71,89% và hiệu suất cao chiết đạt 4,59%. Cao chiết vỏ quả lựu có sự hiện diện của các hợp chất flavonoid, alkaloid, saponin, terpenoid, tanin và phenol. Cao chiết vỏ quả lựu có khả năng ức chế hình... Để hoàn thành đề tài khóa luận tốt nghiệp này không chỉ có sự cố gắng, nổ lực của chính bản thân, mà còn cần đến sự động viên và giúp đỡ nhiệt tình của thầy cô, gia đình và bạn bè. Đặc biệt là sự quan tâm giúp đỡ của thầy cô giáo bộ môn. Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo trường Đại học Duy Tân cùng quý thầy cô tại Trung tâm Sinh học Phân Tử, Trung tâm Hóa học tiên tiến, các thầy cô khoa Dược và các thầy cô giáo bộ môn công nghệ sinh học đã luôn tạo mọi điều kiện, ủng hộ và hỗ trợ chúng em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Đặc biệt, em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PSG TS. Nguyễn Huy Thuần, Trung tâm Sinh học Phân tử, Trường Y Dược, Đại học Duy Tân, là người đã trực tiếp hướng dẫn em thực hiện khóa luận này. Thầy đã tận tình hướng dẫn và luôn tạo mọi điều kiện, truyền đạt kiến thức quý báu, ủng hộ em trong quá trình nghiên cứu. Đó là hành trang quý báu cho sự nhận thức và hiểu biết của em ngày hôm nay. Sự giúp đỡ của thầy cô chính là nguồn động viên tinh thần rất lớn để em theo đuổi và hoàn thành đề tài này. Em xin chân thành cảm ơn đến cô TS. Dƣơng Thị Thuấn, thầy TS. Nguyễn Thành Trung đã hỗ trợ, bổ sung và góp ý để em hoàn thành tốt bài nghiên cứu. Em xin chân thành cảm ơn thầy TS. Hà Hải Anh, cô DS. Tạ Thị Thanh, thầy CN. Trần Minh Đức, cô ThS Phạm Thị Yến Nhi và thầy TS. Lê Văn Thuận đã tạo điều kiện cho em sử dụng trang thiết bị và hóa chất để tiến hành thí nghiệm. Em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến chị trợ lý nghiên cứu Phạm Thị Anh Thƣ và anh Ngô Gia Huy đã hướng dẫn, trao đổi các vấn đề xảy ra trong quá trình tiến hành thực nghiệm và hỗ trợ nhiệt tình để em hoàn thiện tốt bài khóa luận này. Cảm ơn em Nguyễn Duy Khƣơng – sinh viên K26 đã nhiệt tình giúp đỡ và tham gia trao đổi về các vấn đề trong quá trình thí nghiệm. ii Em xin chân thành cảm ơn thầy TS. Hồ Thanh Tâm giúp em đọc lại toàn bộ nội dung của bài luận văn và chỉ ra sai sót, giúp em hoàn thiện tốt hơn bài luận văn của mình. Cuối cùng, một tình cảm sâu sắc nhất từ tận đáy lòng, em xin gửi đến gia đình, những người luôn là nguồn động viên to lớn nhất cho em, luôn tạo mọi điều kiện để cho em được học tập và nghiên cứu trong suốt những năm vừa qua. Bước đầu tham gia vào việc nghiên cứu không tránh khỏi những sai sót, em kính mong nhận được sự góp ý của quý thầy cô để đề tài của em được hoàn thiện hơn. Với lòng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu của đó. Đà Nẵng, ngày tháng năm 202 3 Sinh viên thực hiện Nguyễn Phƣớc Huyền Trang iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là nghiên cứu của cá nhân tôi và được sự hướng dẫn của PGS TS. Nguyễn Huy Thuần. Các nội dung nghiên cứu trong đề tài “Định lượng một số thành phần hoạt chất cơ bản và bước đầu đánh giá hoạt tính sinh học có trong dịch chiết nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) thu hái ở huyện A Lưới (Thừa Thiên Huế)” của tôi là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được cá nhân thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ nguồn gốc. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung bài tiểu luận của mình. Sinh viên thực hiện Nguyễn Phƣớc Huyền Trang iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... i LỜI CAM ĐOAN .................................................................................................. iii MỤC LỤC ............................................................................................................... iv DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ................................................. vi DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ................................................................ x ĐẶT VẤN ĐỀ .......................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ................................................................................... 3 1. Đại cƣơng về nấm ........................................................................................ 3 1.1. Hình dạng đại thể của nấm ..................................................................... 1.1. Cấu tạo của tế bào nấm .......................................................................... 1.1. Hình thức sinh sản .................................................................................. 1.1. Phân bố và nguồn gốc ............................................................................ 1.1. Phân loại ................................................................................................. 1. Tổng quan về nấm Linh chi ........................................................................ 6 1.2. Giới thiệu về nấm Linh chi ..................................................................... 1.2. Phân bố ................................................................................................... 1.2. Đặc điểm sinh học................................................................................... 1.2. Thành phần hóa học và các hợp chất có trong nấm Linh chi ................ 1.2. Các tác dụng quan trọng của nấm Linh chi trong y dược học ............. 1. Các sản phẩm từ nấm Linh chi ................................................................ 15
v vi DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ABTS : 2,2′-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) AIDS : Acquired immune deficiency syndrome CaCO 3 : Calci carbonat CCl 4 : Carbon tetrachloride C-telopeptide : Carboxy Terminal Telopeptide DC : Dịch chiết DPPH : 2,2-diphenylpicrylhydrazyl ĐC : Đối chứng
vii ROS : Reactive oxygen species TNF- : Tumar necrosis factor- UVBU : ltraviolet B UVU : ltraviolet VSV : Vesicular Stomatitis Virus viii DANH MỤC CÁC BẢNG x DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊHÌNH VẼ,ĐỒ THỊ TÊN HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ TRANG 1 Sơ đồ phân loại nấm theo ngành, lớp, phân lớp 5 1 Hình ảnh nấm Linh chi 6 1 Hình ảnh tổng quan của nấm. 8 1 Hình ảnh tổng quan dưới kính hiển vi của nấm Linh chi. 9 1 Khung cấu trúc cơ bản của polysaccharide trong nấm. 11 1 C triterpen đượấu trúc hóa hc phân lọc củập ta lanosterol và ba trong sừ nấm Linh chi. ố nhiều 12 1 Cấu trúc của Ganoderic acid A và Ganoderic acid DM. 13 1 Một số sản phẩm từ nấm Linh chi. 17 2 HìnhThiên Hu ảnh nế).ấ m Linh chi thu hái ở huyên A Lưới (Thừa 18 2 Sơ đồ tạo phức hợp của phản ứng phenol-sunfuric acid. 20 2 Công thức hóa học của DPPH. 25 2 Phản ứng hấp thu gốc tự do của DPPH. 25 2 Phản ứng làm giảm lực khử iron (III) chloride. 27 3 A. Dịch chiết nấm Linh chi; B. Cao chiết Linh chi. 31 3. Hình ảnh phản ứng tạo màu của glucose ở các nồng độ từ 0,1 - 0,8 mg/ml. 31 3 Đồ thị phương trình đường chuẩn của glucose. 32 xi - 2.3. Khảo sát một số hoạt tính sinh học có trong cắn dịch chiết .................
Việt Nam là đất nước thuộc vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, lượng mưa dồi dào và độ ẩm cao. Đây là điều kiện thuận lợi cho các loại sinh vật phát triển, tạo ra hệ thực vật rất phong phú và đa dạng bao gồm các loại thực vật bậc cao, nấm ăn và nấm dược liệu. Đến nay, mặc dù chưa có sự thống kê đầy đủ về sự đa dạng thành phần các loài nấm ở Việt Nam, tuy nhiên, các dẫn liệu khoa học đã được công bố cho thấy Việt Nam có nhiều loại nấm quý hiếm [1]. Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) còn gọi là Tiên thảo, nấm Trường thảo, Vạn niên nhung, thuộc họ nấm Lim. G. lucidum thường sinh trưởng ở nơi rừng núi cao, đặc biệt là những khu rừng có nhiều cây lá rộng, chúng được xem là một loại dược liệu quý, cây thuốc quan trọng tại các nước Đông Nam Á [2]. Trong những năm gần đây, các nhóm nghiên cứu trong và ngoài nước đã công bố nhiều kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học chính trong nấm Linh chi có các hoạt tính sinh học đáng chú ý như điều trị và hỗ trợ điều trị nhiều bệnh tật liên quan đến sức khỏe của con người: bệnh tim, cao huyết áp, bệnh gan, ung thư, tiểu đường [54]. Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về nấm Linh chi nhưng chúng tôi nhận thấy nấm trồng ở các vùng địa lý khác nhau (mọc tự nhiên hoặc nuôi trồng) có thể có sự khác nhau về thành phần hoạt chất và hoạt tính sinh học. Do đó, chúng tôi nghiên cứu sơ bộ về định lượng các thành phần và bước đầu đánh giá một số hoạt tính sinh học từ dịch chiết nấm Linh chi (G. lucidum), với đề tài: “Định lƣợng một số thành phần hoạt chất cơ bản và bƣớc đầu đánh giá hoạt tính sinh học có trong dịch chiết nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) thu hái ở huyện A Lƣới (Thừa Thiên Huế)” nhằm cung cấp thêm dữ liệu khoa học về hoạt tính sinh học quý của nấm Linh chi ở Việt Nam và góp phần mở rộng tiềm năng sử dụng loại dược liệu này. Đề tài này gồm ba mục tiêu sau:
1.1.2. Bào quan Bào quan có ty thể (mitochrondia), không bào (vacuole), vi thể (microbodies), ribosome, bộ máy Golgi, v... được hệ thống lưới nội chất (endoplasmic reticulum) và vi ống (microtubule) nâng đỡ và sắp xếp [2] [55]. 1.1.2. Nhân. Nhân được bao bọc bởi màng nhân, trên màng nhân có nhiều lỗ nhân, trong nhân có hạt nhân (nucleolus). Nhân tập trung nhiều ở phần ngọn và thường chỉ có 1
1.1. Phân bố và nguồn gốc Nấm phân bố trên toàn thế giới và phát triển ở nhiều dạng môi trường sống khác nhau, kể cả sa mạc, nơi tập trung nồng độ muối cao. Chúng thường phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đất, trên động thực vật sống hoặc chết. Ước tính có khoảng trên 1.000 loài nấm, hầu hết sống hoại sinh trong đất, một số ít có khả năng kí sinh gây bệnh cho người và động vật. Hiện nay, đã phát hiện khoảng 400 loài gây bệnh cho người [13]. 1.1. Phân loại Hiện nay, có rất nhiều tác giả đã xây dựng các hệ thống phân loại nấm khác nhau. Trong đó, hệ thống phân loại nấm của G.C và cộng sự (1973) là được sử dụng rộng rãi cả trên toàn thế giới. Theo hệ thống này, nấm được chia thành 2 ngành là ngành nấm Nhầy (Myxomycota) và ngành nấm Thực (Eumycota hay Mycota). Tiếp theo, ngành nấm Nhầy được phân thành ba phân lớp nấm khác nhau. Trong khi đó, Nấm thực được chia năm phân ngành, hai phân ngành lại chứa ba phân lớp khác nhau đó là Chytridomycotina và Basidiomycotina. Sơ đồ phân loại được thể hiện ở Hình 1. Hình 1. Sơ đồ phân loại nấm theo ngành, lớp và phân lớp [14]. Ngành nấm Nhầy (Myxomycota) Acrasiomycetes Myxomycetes Plasmodiophoromycetes Ngành nấm Thực (Eumycota) Chytridiomycotina Zygomycotina Ascomycotina Basidiomycotina Deuteromycotina Chytridiomycetes Hyphochytridiomycetes Dimastigomycetes Oomycetes Teliomycetes Halobasidiomycetes Heterobasidimycetes
Hình 1. Hình ảnh nấm Linh chi [53]. 1.2. Phân bố Linh chi bao gồm nhiều loài nấm khác nhau phân bố rộng trong khu vực nhiệt đới, cận nhiệt đới và ôn đới trên khắp thế giới. Linh chi thường sống hoại sinh trên vỏ cây đại thụ sần sùi hay trên thân cây gỗ đã chết hoặc nguyên liệu giàu chất sơ trong rừng nhiệt đới và rừng cây lá kim ở vùng ôn đới [1]. Ở Việt Nam, Linh chi thường mọc chủ yếu ở các tỉnh vùng núi và chúng thường ưa mọc chủ yếu trên cây dầu dừa, cây dầu nước, cây ràng ràng, dẹ và dẻ [1]. 1.2. Đặc điểm sinh học Linh chi thuộc nhóm nấm lớn và rất đa dạng về chủng loại. Từ khi xác lập thành một chi riêng là Ganoderma theo Karst (1881), đến nay, người ta đã tìm ra 200 loài. Đặc biệt, G. lucidum đã được tìm thấy 45 loài [2]. 1.2.3. Hình thái của nấm Linh chi mọc thành cụm hoặc đơn lẻ. Phần thịt của thể quả nấm có màu nâu, mềm xốp nhưng hóa gỗ theo thời gian. Theo Nguyễn Hữu Đống và Đinh Xuân Linh (2000), thể quả của nấm gồm có hai phần, mũ nấm và cuống nấm (phần phiến đối diện với cuống nấm) [3]. Trên mũ nấm có hai vách, bào tử hình thành phía bên trong giữa hai vách, đây là đặc điểm giúp phân biệt nấm Linh chi với các loài khác. Mũ nấm (tai nấm) ban đầu có hình chùy, khi trưởng thành có hình bán nguyệt, hình quạt hoặc hình thận, kích thước thay đổi nhiều (dài 3 - 30 cm, rộng 2 - 25 cm, dày 0,5 - 2 cm) [3]. Mặt trên mũ nấm sáng bóng, màu nâu đỏ, có vân đồng tâm, lượn sóng và vân tán xạ. Mặt dưới phẳng, màu trắng hoặc vàng, có nhiều lỗ li ti, là nơi hình thành và phóng thích bào tử nấm. Bào tử nấm dạng trứng với hai lớp vỏ, giữa hai lớp vỏ có nhiều gai nhọn nối từ trong ra ngoài [3]. Cuống nấm dài, hình trụ tròn. Kích thước cuống nấm nằm trong khoảng 1 - 1,5 cm x 15 - 20 cm. Đầu cuống lệch một bên mũ, hoặc đôi khi nằm giữa trung tâm mũ [3] [15]. Cuống nấm cứng, ít phân nhánh, đôi khi có uốn khúc cong queo. Lớp vỏ cuống màu đỏ, nâu đỏ, nâu đen, bóng, không có lông, phủ suốt lên mặt tán nấm. Theo Kuo (2019), bào tử nấm có màu nâu, kích thước khoảng 9 - 12 x 5,5 -8 μm. Bào tử hình thuẫn, có gai lõm, một đầu tròn lớn, một đầu tròn nhỏ có lỗ là nơi khuẩn ty mọc ra nảy mầm [16]. Hình 1. Hình ảnh tổng quan của nấm [3]. Phần thịt của nấm dày từ 0,4 - 2,2 cm, màu vàng kem – nâu nhạt – trắng kem, phân chia kiểu lớp trên và lớp dưới. Ở lớp trên, các tia sợi hướng lên, các sợi phình hình chùy, màng rất dày, đan khít vào nhau tạo thành lớp vỏ láng, nhờ lớp vỏ này mà nấm chịu được mưa nắng. Ở lớp dưới hệ sợi tia xuống đều đặn, tiếp giáp vào tầng sinh bào tử. Tầng sinh sản (bảo tầng – thụ tầng) là một lớp ống dày 0,2 - 1,8 cm màu kem nâu nhạt gồm các ống nhỏ trắng, miệng tròn, màu trắng, vàng chanh nhạt, khoảng 3
ống thẳng đứng ở phía dưới của nắp có màu nâu sẫm, đường kính khoảng 200 m. Bề mặt bên trong của chúng được bao phủ bởi màng mỏng, tạo thành bào tử có màu nâu sẫm. Túi bào tử có hình elip hoặc hình thoi, thành mỏng và nhiều. Các bào tử có hình trứng hoặc hình elip với bề mặt có nhiều chấm và dài 8 m. Không chứa tinh bột và canxi oxalat. Hình 1. Hình ảnh tổng quan dưới kính hiển vi của nấm Linh chi [15].
1.2. Thành phần hóa học và các hợp chất có trong nấm Linh chi 1.2.4. Thành phần hóa học Theo Borchers và cộng sự (1999), nấm chứa khoảng 90% nước theo trọng lượng, 10% còn lại bao gồm 10 - 40% protein, 2 - 8% chất béo, 3 - 28% carbohydrate, 3 - 32% chất xơ, 8 - 10% tro, một số vitamin và khoáng chất. Một số vitamin có trong G. lucidum bao gồm vitamin B1, B2, B6, -carotene, C, D và E. Ngoài ra, các khoáng chất khác nhau như canxi, natri, kali, phospho, sắt, carbon, magie, kẽm, crom, asen, đồng, mangan, silic, nhôm, coban, molypden, niken và chì cũng đã được xác định [17]. Trong nghiên cứu về các thành phần không bay hơi của G. lucidum, nhiều nghiên cứu đã công bố loại nấm này chứa 1,8% tro, 26 - 28% carbohydrate, 3 - 5% chất béo thô, 59% chất xơ thô và 7 - 8% protein thô [17]. 1.2.4. Các hợp chất có tác dụng sinh học trong nấm Nấm chứa nhiều hợp chất sinh học quyết định tính dược lý quý hiếm như trong thể quả, khuẩn ty và bào tử. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh thành phần quan trọng và có hàm lượng cao trong nấm là polysaccharide và triterpenoid. a. Polysaccharide Polysaccharide là hợp chất có trọng lượng phân tử lớn và có ở tất cả bộ phận của nấm (thể quả, bào tử, sợi nấm). Có hơn 200 loại được trích ly từ nấm Linh chi. Đa số nghiên cứu thu hợp chất polysaccharide từ nấm bằng cách chiết xuất từ nước nóng, sau đó kết tủa bằng etanol hoặc metanol. Theo Chan và cộng sự (2007), khi nấm Linh chi bị thủy phân sẽ tạo ra các polysaccharide khác nhau về thành phần đường. Đường chủ yếu là glucose, ngoài ra còn có xylose, mannose, galactose và fructose ở các dạng khác nhau, bao gồm 1-3, 1-4 và 1-6 liên kết thay thế β và α-D hoặc L [52]. Nghiên cứu của Liu và cộng sự (2014) cho thấy, các hoạt chất polysaccharide có trong nấm Linh chi chỉ có polysaccharide trung tính (β-1-3, β-1-6 D-glucan), glucan có tính acid và polyglycan, heteroglucan liên kết protein, arabinoxyglucan, heteroglucan với liên kết (β-14 và peptidoglucan (ganoderma A,B,C). Các kiểu liên kết (1-3)-β-D- glucan làm cho mạch polysaccharide có dạng xoắn giống như tinh bột. Ngoài ra, (1- 3)-β-D-glucan có tính chất tan tốt trong nước nóng và tan kém trong nước lạnh. Các β-glucan trong thể quả của Linh chi có cùng khối lượng phân tử nhưng khác nhau về mức độ phân nhánh. Phân nhánh trong β-glucan chủ yếu là dạng 16. Các heteropolysaccharide trong Linh chi có thể cấu tạo từ đường D-glucose, D- galactose, D-xylose hoặc D-fructose [19]. Mặc dù, polysaccharide có nhiều cấu tạo phân tử khác nhau nhưng khung cơ bản của chúng vẫn bao gồm β-(1→3)-D-glucan trọng lượng phân tử cao với dạng phân nhánh (1→6)-β-D-glucosyl và các thành phần đường chính là mannose, glucose và galactose [19]. Khung cấu trúc cơ bản của polysaccharide đươc thể hiện ở Hình 1. Hình 1. Khung cấu trúc cơ bản của polysaccharide trong nấm [20]. Polysaccharide trong nấm Linh chi có nhiều hoạt tính sinh học quan trọng, bao gồm tác dụng chống viêm, hạ đường huyết, chống loét, chống ung thư và kích thích miễn dịch. Tác dụng chống ung thư của polysaccharide được đánh giá trên chuột bị u nguyên bào thần kinh đệm. GLP làm tăng nồng độ của interleukin-2 huyết thanh (IL-2), yếu tố hoại tử khối u-α (TNF-α) và interferon-γ (INF-γ), v. Từ đó, ức chế sự phát triển của u thần kinh đệm [21]. b. Triterpenoid Triterpenoid là một phân lớp của nhóm terpene có cấu trúc khung 30C. Theo nghiên cứu của Liu và cộng sự (2012), trong phần không phân cực của thể quả có các triterpenoid tự do. Hoạt chất chính bao gồm các acid ganoderic với 4 isopren dạng vòng và 2 dạng tuyến tính. Có hơn 140 loại aicd ganoderic khác nhau đã được xác định từ nấm Linh chi. Các loại GAs khác nhau bởi sự đặc trưng của các nhóm R. Hai loại triterpenoid đầu tiên được phân lập từ G. lucidum là các aicd ganoderic A và B [22]. Các nhà khoa học đã phân lập được hơn 300 loại triterpenoid với thành phần hóa học và cấu trúc phân tử khác nhau trong G. lucidum [23]. Đã có hơn 300 triterpenoid với thành phần hóa học và cấu trúc phân tử đã biết đã được báo cáo ở G. lucidum. Trong số này, hơn 50 loại được phát hiện là mới và duy nhất từ loại nấm này. Phần lớn thuộc nhóm acid ganoderic và lucidenic, ngoài ra còn có các triterpenoid khác như ganoderal, ganoderiols và ganodermic acid [23]. Hình 1. Cấu trúc hóa học của lanosterol và ba trong số nhiều triterpenoid được phân lập từ nấm Linh chi [22][23]. Như vậy, G. lucidum rất giàu triterpenoid và chính nhóm hợp chất này tạo cho thảo dược có vị đắng và có nhiều tác dụng như giảm lipid trong máu và chống oxy hóa. Hàm lượng triterpenoid khác nhau ở các bộ phận và các giai đoạn phát triển của nấm. Sự khác nhau đó có thể được sử dụng để phân biệt nấm dược liệu này với các loài khác có hình thái tương tự, sử dụng như một thước đo tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng của các mẫu Linh chi [23]. HIV là virus gây suy giảm miễn dịch ở người. Hiện nay, phương pháp điều trị bệnh chủ yếu bằng cách làm trì hoãn sự tiến triển từ HIV sang AIDS. Nghiên cứu chứng minh triterpenoid trong Linh chi có hoạt tính kháng protease của virus HIV-
hoạt động của nhóm carbonyl ở C-3 trong ganoderic acid DM có thể ức chế sự tăng trưởng của các tế bào ung thư [26]. Hình 1. Cấu trúc của Ganoderic acid A và Ganoderic acid DM [23] [24]. c. Saponin Triterpenoid phân bố rộng rãi trong giới thực vật và nấm, trong đó dạng dẫn xuất glycoside của chúng được gọi là saponin. Phần aglycone (được gọi là sapogenin) có thể là steroid (27C) hoặc một triterpene (30C). Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng các saponin triterpenoid này có nhiều hoạt tính sinh học hơn so với aglycone của chúng [27]. Saponin có nhiều tác dụng quan trọng như: Hạ đường huyết, giữ cho lượng đường trong máu của người ở giới hạn bình thường và hạn chế sự tăng insulin đột ngột. Hơn nữa, chúng ức chế việc giải phóng lipase, một loại enzym phân hủy chất béo trong chế độ ăn uống. Nhờ đó, cơ thể sẽ hấp thụ ít chất béo hơn từ thức ăn từ đó làm giảm được lượng mỡ bụng, chất béo trung tính và mức cholesterol giúp ức chế sự hình thành các mô mỡ và ngăn chặn sự thèm ăn [28]. Saponin cũng bảo vệ cơ thể chống lại nấm, vi khuẩn và virus [29]. d. Phenolic Phenolic là các hợp chất có nhiều hoặc một vòng thơm với các nhóm thế hydroxyl ở các vị trí khác nhau trên vòng. Chúng có thể tồn tại dưới dạng glycoside hoặc aglycones, hoặc các hợp chất liên kết tự do và bao gồm hầu hết các cấu trúc polymer hoặc monomer. Hợp chất phenolic rất đa dạng gồm phenolic đơn giản (acid phenolic) và các hợp chất phức tạp (tanin) [30]. Các hợp chất phenolic có trong nấm, chủ yếu bao gồm acid phenolic, flavonoid, acid hydroxybenzoic, acid hydroxycinnamic, lignans, tanin, stilbenes và polyphenol dạng oxy hóa. Một số nghiên cứu đã chứng minh hoạt tính sinh học quan trọng nhất của các hợp chất phenolic là hoạt tính chống oxy hóa, hấp thụ gốc tự do, phân hủy peroxide, v. Hợp chất phenolic cũng giúp bảo vệ chống lại một số rối loạn thoái hóa, bao gồm rối loạn chức năng não, lão hóa và các bệnh về tim mạch [31]. Chiết xuất dichloromethane của G. lucidum bao gồm flavonoid, terpenoid, phenolic và alkaloid thể hiện khả năng chống virus ung thư cổ tử cung type 16 ở người (HPV 16) [32]. 1.2. Các tác dụng quan trọng của nấm Linh chi trong y dược học Hiệu quả phòng chống và chữa trị ung thư Các nghiên cứu in vitro và in vivo đã chứng minh Linh chi có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư và hạn chế di căn xâm lấn, vô hiệu hóa các chất gây ung thư bằng cách bảo vệ các tế bào, gây độc tế bào trực tiếp đối với tế bào ung thư, [33]. Ví dụ dầu của bào tử nấm G. lucidum có khả năng ức chế sự sản xuất tế bào ung thư biểu mô ở vùng dạ dày và tế bào ung thư bạch cầu ở người (K562 và HL60) phụ thuộc vào liều lượng [34]. Tăng cường hệ thống miễn dịch trong cơ thể và hỗ trỡ chức năng tim mạch Theo Roy và cộng sự (2006), trong các liệu pháp thảo dược phương Tây, nấm Linh chi chủ yếu được sử dụng như một chất điều hòa miễn dịch. Vì mục đích này, G. lucidum thường được sử dụng cùng với các liệu pháp hóa trị hoặc xạ trị trong điều trị ung thư giúp ngăn ngừa nhiễm trùng cơ hội và chống lại các tác dụng phụ trong điều trị thường quy [15]. Kháng khuẩn và kháng virus Linh chi cũng được sử sụng để phòng ngừa nhiễm trùng cơ hội, chống lại tác dụng phụ của các liệu pháp giảm đau, hạn chế việc sử dụng morphine, ngăn ngừa bệnh tái phát và tăng cường phục hồi sức khỏe sau phẫu thuật [33]. Eo và cộng sự (1999) đã chứng minh dịch chiết từ cuống quả thể nấm G. lucidum được chiết bằng nước và metanol có tác dụng ức chế đối với virus herpes simplex týp 1 (HSV-1), virus herpes simplex týp 2 (HSV-2) và virus viêm miệng mụn nước (VSV) chủng New Jersey [35]. Chống oxy hóa và lão hóa Tia UV là một yếu tố chủ yếu gây ra lão hóa da. Thí nghiệm chiếu xạ tia UVB gây ra kích thích tiết MMP-1 (Matrix Metalloproteinase là enzyme phân hủy collagen và phá vỡ protein) và làm giảm quá trình tổng hợp collagen và có thể đẩy nhanh quá trình lão hóa da [36]. Lee và cộng sự (2018) đã chứng minh rằng chiết xuất G. lucidum có thể ức chế biểu hiện MMP-1 do UVB gây ra và tăng biểu hiện procollagen bằng cách ức chế con đường tín hiệu ERK (extracellunar regulated kinases [37]. Chiết xuất protein sợi nấm cho thấy các khả năng hấp thụ các gốc tự do tốt hơn so với chiết xuất protein từ quả thể thông qua hai xét nghiệm bao gồm 2,2′- azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) radical (ABTS) và 2,2- diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) [38].
Hình 2. Hình ảnh nấm Linh chi thu hái ở huyện A Lưới (Thừa Thiên Huế).
Vai trò Tên hóa chất Nguồn gốc Khảo sát hàm lượng một số hoạt chất và hoạt tính sinh học. Phenol, glucose, tris hydrochloride, vanillin, acid sulfuric, oleanolic acid, methanol, natri cacbonat, Folin- Ciocalteu, gallic acid, 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl, ascorbic acid, iron (III) chloride, kali ferricyanid, natri hydrophosphate, sodium dihydrogen phosphate dihydrate, trichloroacetic acid, Luria Bertani Broth. Tại phòng 401, 402 – Trung tâm Sinh học phân tử – Trường Đại học Duy Tân 2.2. Thiết bị Các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê trong Bảng 2. Bảng 2. Các dụng cụ, thiết bị sử dụng. Tên dụng cụ, thiết bị Hãng sản xuất Các dụng cụ thủy tinh: bình tam giác, cốc thủy tinh, đĩa petri, ống đong chia vạch, bình định mức Duran và IsoLab. Pipep tự động Finnpipette và đầu côn Fisherbrand. Ống effendorf Thermo scientific. Giấy lọc Whatman Máy li tâm lạnh chân không Sorvall BioFuge Stratos Refrigerated High - Speed Benchtop Centrifuge Thermo scientific Máy quang phổ UV-VIS V730 Japan Tủ hút Esco Cân kỹ thuật Shimadzu Ống falcon 15 ml Corning Tủ gia nhiệt Thermo scientific
2.3. Khảo sát hàm lượng một số hợp chất có trong cắn dịch chiết 2.3.2. Khảo sát hàm lượng polysaccharide tổng số Hàm lượng polysaccharide tổng số được khảo sát theo phương pháp phenol- acid sulfuric đậm đặc theo Đoàn Thị Tám và cộng sự (2020) [5]. a. Nguyên tắc Acid sulfuric đậm đặc sẽ thủy phân polysaccharide thành monosaccharide. Pentose (đường 5-cacbon) sau khi bị khử nước thành dẫn xuất furfural và các hexose (hợp chất 6-cacbon) ngưng tụ thành hydroxymethyl furfural. Các hợp chất này sau khi phản ứng với phenol tạo ra màu vàng cam và có độ hấp thụ ở bước sóng 490 nm. Phản ứng được thể hiện ở sơ đồ Hình 2 [39]. Hình 2. Sơ đồ tạo phức hợp của phản ứng phenol-sulfuric acid [39]. b. Chuẩn bị các dung dịch thử
Bảng 2. Dãy chuẩn dung dịch glucose ở các nồng độ (0,1 - 0,8 mg/mL). Nồng độ (mg/mL) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 Vglucose (mL) 0,02 0,04 0,08 0,12 0,16 Vnước cất (mL) 9,98 9,96 9,92 9,88 9,84
Trong đó: G: hàm lượng polysaccharide (%). C 1 : nồng độ polysaccharide chứa trong mẫu (mg/mL). C: nồng độ mẫu bột cao chiết (mg/mL) [5]. 2.3.2. Khảo sát hàm lượng saponin tổng số Hàm lượng saponin tổng số được khảo sát theo phương pháp vanillin-sulfuric acid theo Anh Le và cộng sự (2018) [40]. a. Nguyên tắc Trong điều kiện acid, quá trình aldol hóa xảy ra giữa các sapogenin thu được bằng thủy phân saponin trong dịch chiết và nhóm aldehyde trong vanillin. Các sapogenin steroid có hoặc không có liên kết đôi ở C-5, các sapogenin triterpenoid, sterol có nhóm OH ở vị trí C-3 của chúng phản ứng với vanillin trong môi trường axit để tạo ra phức hợp màu tím đỏ có độ hấp thụ cực đại ở 473 đến 560 nm [41]. b. Chuẩn bị các dung dịch thử - Dung dịch vanillin 8%: Cân chính xác 8 gam vanillin cho vào bình định mức 100 mL, thêm etanol vừa đủ 100 mL, lắc đều. - Dung dịch acid sulfuric 72%: Lấy 25 ml nước cất cho vào bình định mức 100 mL, thêm từ từ acid sulfuric đậm đặc vừa đủ 100 mL, lắc đều. - Dung dịch oleanolic acid (1,5 mg/mL): Cân chính xác 0,15 gam oleanolic acid cho vào bình định mức 100 mL, thêm methanol vừa đủ 100 mL, lắc đều. - Chuẩn bị dãy chuẩn dung dịch oleanolic acid như Bảng 2. Bảng 2. Dãy chuẩn dung dịch oleanolic acid ở các nồng độ (0,03 - 0,5 mg/mL). Nồng độ (mg/mL) 0,03 0,06 0,125 0,25 0,5 VOleanolic acid (mL) 0,21 0,42 0,83 1,67 3,33 VMeOH (mL) 9,79 0,58 9,17 8,33 6,67 - Mẫu dịch chiết (5,0 mg/mL): Cân chính xác 0,5 gam cao chiết cho vào bình định mức 100 mL, thêm nước cất vừa đủ 100 mL, lắc đều. c. Tiến hành
Trong đó: M: Hàm lượng saponin tổng số (%). a: Nồng độ saponin chứa trong mẫu (mg/mL). b: Nồng độ mẫu bột cao chiết (mg/mL) [6]. 2.3.2. Kháo sát hàm lượng phenolic tổng số Hàm lượng phenolic tổng số được khảo sát bằng thuốc thử Folin – Ciocalteu theo N. Siddiqui và cộng sự (2017) [42]. a. Nguyên tắc Các hợp chất phenolic có trong dịch chiết nấm được định lượng bằng phương pháp đo màu khi dùng với thuốc thử Folin - Ciocalteu. Thuốc thử Folin - Ciocalteu là hỗn hợp hai acid: acid phosphotungstic (H 3 PW 12 O 40 ) và acid phosphomolybdic (H 3 PMo 12 O 40 ), hỗn hợp acid này phản ứng với các hợp chất có nhóm hydroxy phenol trong thành phần hóa học để tạo thành các phức có màu xanh lam đặc trưng. Sử dụng phương pháp quang phổ để xác định được hàm lượng phenolic toàn phần có trong dịch chiết [43]. b. Chuẩn bị dung dịch thử
Nồng độ (mg/mL) 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 Vgallic acid (mL) 1 2 3 4 5 V nước cất (mL) 9 8 7 6 5
Trong đó: P: Hàm lượng phenolic tổng số (mg galic acid/g dịch chiết). a: Giá trị X từ đường chuẩn của gallic acid (mg/mL). V: Thể tích dịch chiết (mL). m: khối lượng dịch chiết có trong thể tích V (g) [42]. 2.3. Khảo sát một số hoạt tính sinh học có trong cắn dịch chiết .................2.3.3. Khả năng chống oxy hóa Khả năng hấp thụ gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picylhydrazyl) Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp hấp thụ gốc tự do DPPH theo M. Blois (1958) [44]. a. Nguyên tắc DPPH, 2,2-diphenyl-1-picylhydrazyl, là một gốc tự do điển hình có khả năng kết cặp hay “bắt giữ” các gốc tự do khác. Công thức được thể hiện ở Hình 2. Hình 2. Công thức hóa học của DPPH [45]. Cơ chế hoạt động quét gốc tự do DPPH là sự ghép đôi hydro và “đình chỉ” quá trình oxy hóa bằng sự chuyển các gốc tự do của DPPH sang trạng thái ổn định hơn. Như vậy, khi có mặt của chất chống oxy hóa, nó sẽ khử gốc tự do của DPPH và làm cho dung dịch bị giảm màu sắc. Từ đó, giá trị mật độ quang càng thấp chứng tỏ khả năng bắt gốc tự do DPPH càng cao và qua đó có thể tính được số lượng gốc tự do ban đầu dựa trên sự thay đổi hấp thụ quang học ở bước sóng 517 nm. Phản ứng được thể hiện ở sơ đồ Hình 2 [45]. Hình 2. Phản ứng hấp thụ gốc tự do của DPPH [45]. b. Chuẩn bị dung dịch thử
Bảng 2. Dãy chuẩn dung dịch ascorbic acid ở các nồng độ (0,2 - 1,0 mg/mL). Nồng độ (mg/mL) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Vascorbic acid (mL) 2 4 6 8 10 Vnước cất (mL) 8 6 4 2 0 - Mẫu dịch chiết (2,0 mg/mL): Cân chính xác 0,2 gam cao chiết cho vào bình định mức 100 mL, thêm nước cất vừa đủ đến 100 mL, lắc đều - Chuẩn bị dãy chuẩn dung dịch DC như Bảng 2. Bảng 2. Dãy chuẩn dung dịch DC ở các nồng độ (0,5 - 2,0 mg/mL). Nồng độ (mg/mL) 0,5 1,0 1,5 2,0 Vdịch chiết (mL) 0,375 0,75 1,125 1,5 Vnước cất (mL) 1,125 0,75 0,375 0 c. Cách tiến hành
Fe[(CN) 6 ]3- Fe[(CN) 6 ]4- Fe[(CN) 6 ]4- + Fe3+ Fe 4 [Fe(CN) 6 ] 3
( ) Trong đó: SCDPPH: Khả năng hấp thụ gốc tự do DPPH (%). AS: Độ hấp thụ quang của mẫu phân tích. Ab: Độ hấp thụ quang của mẫu trắng. An: Độ hấp thụ quang của mẫu đối chứng âm [44]. Giảm lực khử của iron (III) chloride Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp giảm lực khử của iron (III) chloride theo M. Oyaizu (1986) [46]. a. Nguyên tắc Sử dụng phản ứng oxy hóa khử để xác định khả năng chống oxy hóa của các hợp chất biểu hiện qua sự thay đổi màu của tác nhân khử. Trong điều kiện môi trường pH thấp, các hợp chất có khả năng chống oxy hóa sẽ khử trực tiếp anion Fe[(CN) 6 ]3- trong kali ferricyanid (K 3 [Fe(CN) 6 ]) thành Fe[(CN) 6 ]4-. Khi bổ sung FeCl 3 , Fe3+ tự do sẽ phản ứng với anion Fe[(CN) 6 ]4- tạo thành phức ferric ferrocyanid (Fe 4 [Fe(CN) 6 ] 3 ) có màu xanh dương và có độ hấp thụ ở bước sóng 700 nm. Phản ứng được thể hiện ở Hình 2 [46]. Hình 2. Phản ứng làm giảm lực khử iron (III) chloride. b. Chuẩn bị dung dịch thử
Trong đó: ODC: Mật độ quang chất đối chứng. ODS: Mật độ quang mẫu thí nghiệm. HTCO: Hoạt tính chống oxy hóa [46]. 2.3.3. Khả năng ức chế sinh trưởng của vi sinh vật Khảo sát khả năng ức chế sinh trưởng của vi sinh vật theo F. Hadacek và H. Greger (2000) [47]. a. Nguyên tắc Cắn dịch chiết nấm Linh chi được pha loãng ở các nồng độ khác nhau được hút và bơm vào từng lỗ được đục trên môi trường nuôi cấy có chứa các chủng vi khuẩn thử nghiệm, từ đó ảnh hưởng tới sự sinh trưởng bình thường của chúng. Mức độ nhạy cảm của các chủng vi khuẩn với các phân đoạn dịch chiết được thể hiện bằng đường kính các vòng vô khuẩn (vi khuẩn không phát triển). b. Cách tiến hành. - Sử dụng phương pháp đục lỗ thạch lên giá thể nuôi cấy để kiểm tra hoạt tính ức chế sinh trưởng của các chủng vi khuẩn thử nghiệm Escherichia coli DH5 . - Cắn dịch chiết được pha loãng ở nồng độ 30, 40, 50 mg/mL. Mẫu đối chứng âm là dung môi hòa tan cắn dịch chiết methanol, mẫu đối chứng dương là kháng sinh ampicillin 50 mg/mL. - Các chủng vi khuẩn thử nghiệm sau khi nuôi cấy trong falcon (15mL) chuyển sang nuôi cấy trên đĩa th |
