Phương pháp xác định Staphylococcus aureus trong thực phẩm

1. Tổng quan về vi khuẩn staphylococcus aureus: Đặc điểm: - Hiếu khí hay kị khí tùy ý - Cầu khuẩn, Gram [+], chùm nho - Có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNA, phosphatese - Khả năng lên men đường manitol, trehalose, sucrose - Phản ứng đặc trưng: phản ứng đông tụ huyết tương Phân bố: - Thịt, cá, rau quả,sữa, trứng, qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến. Ngoài ra còn có trên lông, mụn nhọt, vết thương,

Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Đề tài Quy trình định lượng s.aureus bằng phương pháp đếm đĩa, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

BỘ CÔNG THƯƠNGTRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HỒ CHÍ MINHKHOA THỦY SẢNMÔN:MÔN: MÔN: PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨMĐỀ TÀI: QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG S.AUREUS BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM ĐĨAGVHD: NGUYỄN THỊ KIM OANH NHÓM THỰC HIỆN: 71. Tổng quan về vi khuẩn staphylococcus aureus:Đặc điểm:- Hiếu khí hay kị khí tùy ý- Cầu khuẩn, Gram [+], chùm nho- Có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNA, phosphatese- Khả năng lên men đường manitol, trehalose, sucrose- Phản ứng đặc trưng: phản ứng đông tụ huyết tươngPhân bố:- Thịt, cá, rau quả,sữa, trứng,qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến. Ngoài ra còn có trên lông, mụn nhọt, vết thương,- Có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl.- Hầu hết các vòng tan máu đều tạo sắc tố vàng sau 1 – 2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng.- Tạo độc tố Enterotoxin bền nhiệt.staphylococcus aureus Quy trình định lượng S.aureus 2.1 Phạm vi áp dụng:- Phương pháp này tham chiếu theo TCVN 4830 – 1: 2005 [ ISO 6888-1 : 1999]- *TCVN 4830-1:2005 : tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng Staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trên đĩa thạch có mặt trong các sản phẩm dùng cho con người hoặc thức ăn chăn nuôi, bằng cách đếm số khuẩn lạc thu được trên môi trường đặc [ môi trường Baird-Packer] ở 350C – 370C.2.2 Nguyên tắc:- Cấy lên bề mặt của môi trường chọn lọc, một lượng mẫu qui định [sản phẩm ở dạng lỏng hoặc huyền phù].- Ủ các đĩa ở điều kiện hiếu khí ở 37oC và kiểm tra 24h hoặc 48h.- Tính số lượng Staphylococcus aureus trong một ml hoặc một gram mẫu từ những khuẩn lạc điển hình và không điển hình trên các đĩa ở độ pha loãng khác nhau và khẳng định bằng kết quả thử coagulase dương tính.2.3 Môi trường và hóa chất:Môi trườngCông dụngDung dịch Saline Peptone Water [SPW]Dung dịch đẳng trương để pha loãng mẫuMôi trường Baird – ParkerMôi trường chọn lọc để nuôi cấy S.aureusMôi trường Trypticase Soy Agar [TSA]Bảo quản và phục hồi vsv trong quá trình nuôi cấyBrain heart broth [BHI]Huyết tương thỏDùng để khẳng định S.aureusHCl 10%Chỉnh pH môi trườngNaOH 10%2.5 Qui trình phân tích:Chương 3: Thuyết minh qui trình Lấy 10g [ mẫu rắn] hoặc hút 10ml [ mẫu lỏng]90ml dung dịch pha loãng SPWCho vào máy dập mẫu [mẫu rắn] hoặc lắc đều [mẫu lỏng]Đồng nhất mẫu[ hoặc túi nhựa vô trùng ]Bước 1: chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầuBước 2: Pha loãng mẫuHút 1ml dd 10 -19ml SPWDD 10 -2Nếu cần, lặp lại thao tác trên để có được dung dịch pha loãng 10 -3, 10 - 4, 10 -5, cho đến khi đạt được độ pha loãng thích hợp.Hút 0.1ml dd mẫu BPABước 3: Phân lập trên môi trường chọn lọcBước 4: quan sát, đếm số khuẩn lạcSau 24hĐánh dấu khuẩn lạc điển hìnhSau 24h tiếp theoKhuẩn lạc S.aureus dương tính,đánh dấu khuẩn lạc không điển hìnhBước 5+6: Phục hồi và khẳng địnhCấy 5 khuẩn lạc điển hình và 5 khuẩn lạc không điển hình từ BPA sang các ống nghiệm tương ứng chứa 5ml môi trường BHIỦ 37 ± 1oC trong 24 ± 3hHút 0,1 ml dịch nuôi cấy BHI vào ống nghiệm có kích thước 10mm × 75mm đã chứa 0,3 ml huyết tương thỏ [ hoặc theo hướng dẫn của nhà sản xuất]Kiểm tra sự động tụ của huyết tương sau 4, 6, 8, 24hXác định tỷ lệ khẳng định dựa trên số khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng.Báo cáo kết quảÂm tính: không có khối đông, hỗn hợp dung dịch vẫn đồng nhất như ống không cấy.Dương tính: có khối động tụ huyết tương chiếm ¾.Âm tínhDương tínhBước 7: báo cáo kết quảVí dụNồng độ pha loãngNtNaSố khuẩn lạc thử nghiệm phản ứng coagulaseSố phản ứng coagulase [+]HtHa10-230 555/5  4752 2/510-35 555/5  851 1/5Kết quảCảm ơn cô và các bạn đã chú ý lắng nghe

Tóm tắt nội dung tài liệu

1. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Phương pháp tiến hành: Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường lỏng SCA. Dùng que vòng cấy ria một lượng nhỏ khuẩn lạc lên môi trường SCA rắn trong ống nghiệm thạch nghiêng, ủ ở 350C trong khoảng 24-48 giờ. Đọc kết quả: [+] khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trường chuyển sang màu xanh dương. [-] khi không có khuẩn lạc và môi trường giữ nguyên màu xanh lục. 1.4 Cách tính kết quả Hình 8: thử nghiệm Citrate Từ số lượng các ống nghiệm có E. coli [+] ở mỗi độ pha loãng của mẫu, dùng bảng MPN loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp để tính ra mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng trị số MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng. Bài 2. Định lượng Staphylococcus aureus 2.1. Tóm tắt kiến thức cơ bản Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, hình cầu, gram dương, có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNAse, phosphatease [+] có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S. aureus đều mẫn cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl. Một số dòng có khả năng tăng trưởng làm Hình 9: S. aureus trên BPA tan máu trên môi trường thạch máu. S. aureus có thể nhiễm vào thực phẩm qua con đường tiếp xúc với người thao tác trong quá trình chế biến thực phẩm. Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm chỉ thị điều kiện vệ sinh và kiểm soát nhiệt độ kém của quá trình chế biến. 2.2 Quy trình định lượng Staphylococcus aureus bằng phương pháp MPN Phương pháp này được dùng để định lượng S. aureus trong mẫu có mật độ S. aureus thấp nhưng mật độ vi sinh vật cạnh tranh cao. Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 10 Homepage: //lethuylinh.weebly.com
2. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu thành các dãy nồng độ thập phân 10-1, 10-2, 10-3… Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh MSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ Chọn ống [+] đục ở mỗi độ pha loãng Ria lên đĩa thạch BPA, ủ ở 370C, 48 giờ Chọn khuẩn lạc đặc trưng [tròn lồi, đen bóng, có quầng trong và quầng sáng xung quanh [đôi khi chỉ xuất hiện 1 trong 2 quầng]] Cấy vào TSA, ủ ở 370C ± 10C , 24 giờ Thử nghiệm ngưng kết coagulase Ghi nhận số coagulase [+] ở mỗi độ pha loãng Tra bảng MPN Mật độ S.aureus [MPN/g hoặc MPN/ml] 2.3 Cách tiến hành và tính kết quả Mẫu phân tích: thịt heo sống, khối lượng 50g cho 1 lớp Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 11 Homepage: //lethuylinh.weebly.com
3. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Bước 1: pha môi trường Tên môi trường Thành phần Tổng thể tích Ghi chú 500 ml nước Phân phối cho mỗi tổ 27ml NaCl : 42.5g SPW cất SPW [9ml/ống nghiệm] [Saline Pepton Pepton: 5g trước khi khử trùng. [buổi 2] Water] Cao thịt: 1g 1000 ml nước Phân phối 90ml MSB cho MSB [Mannitol Salt Polypeptone: 10g cất mỗi tổ [10ml/ống nghiệm] Broth] trước khi khử trùng. [buổi 2] NaCl: 75g pH 7.4 ± 0.2 Mannitol: 10g Phenol red: 0.025g 1000 ml nước Phân phối 100ml BPA cho Môi trường cơ bản BPA cất cho môi mỗi tổ [20ml/petri] [buổi 2] [Baird Parker Tryptone:10g Cao thịt: 5g trường cơ bản Agar] Cao nấm men: 1g pH 7.0 ± 0.2 Sodium pyruvate: 10g Glycine: 12g Lithium chloride.6H2O: 5g Agar: 20g Môi trường hoàn chỉnh 5ml Bacto EY tellurite [45-500C] enrichment vào 95ml môi trường cơ bản được làm nóng chảy. Môi trường hoàn chỉnh phải đục. 1000 ml nước Phân phối 50ml BGBL cho Trypticase peptone: 15g TSA cất mỗi tổ [25ml/petri] [buổi 3] [Tryptone Soya Phytone peptone: 5g Agar] NaCl: 5g pH 7.3± 0.2 Agar: 15g Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 12 Homepage: //lethuylinh.weebly.com
4. Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP.HCM Bước 2: khử trùng dụng cụ và môi trường đã pha. Bao gói dụng cụ và phân phối môi trường vào dụng cụ, gắn nút và bao gói. Hấp tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. Bước 3: đồng nhất mẫu và pha loãng mẫu Cân 10g mẫu trong túi PE vô trùng, thêm 90ml dung dich SPW, đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu khoảng 30 giây. Pha loãng mẫu [xem bài 1, mục 1.3.2] Bước 4: Cấy mẫu vào canh MSB Chuyển 1ml dung dịch 10-1, 10-2, 10-3 vào ống 10ml canh MSB, mỗi nồng độ có 3 ống lặp lại, ủ ở 370C, 48 giờ. [xem bài 1, mục 1.3.2]. Chọn các ống [+] có vi sinh vật phát triển làm đục môi trường để tiến hành phân lập khuẩn lạc đơn trên BPA Bước 5: phân lập khuẩn lạc đơn trên BPA Dùng kỹ thuật cấy ria lên đĩa thạch BPA, ủ ở 370C, 48 giờ. Chọn khuẩn lạc đặc trưng :tròn lồi, đen bóng, có quầng trong và quầng sáng xung quanh; đôi khi chỉ xuất hiện 1 trong 2 quầng [xem Hình 10: hình dạng S. aureus trên BPA hình 10]. Chọn khuẩn lạc đặc trưng của S. aureus trên BPA để thử nghiệm sinh hóa coagulase Bước 6: thử nghiệm sinh hóa coagulase Nguyên tắc: các loài thuộc giống Staphylococcus có khả năng tiết ra môi trường enzyme coagulase có tác dụng làm kết tụ các thành phần của huyết tương, tạo thành các khối đông làm đông huyết tương. Phương pháp tiến hành: Huyết tương người hay thỏ đông khô thương phẩm được dùng cho thử nghiệm này. Cho vào ống nghiệm 0.5ml huyết tương người hay thỏ không pha loãng, bổ sung 0.5ml dịch nuôi cấy chủng thuần hoặc một lượng lớn sinh khối khuẩn lạc. Xoay nhẹ ống để trộn đều VSV. Ủ ống thử nghiệm ở 370C trong 4 giờ. Quan sát, ghi nhận sự ngưng kết mỗi 30 phút. Tiếp tục ủ đến 24 giờ nếu không thấy xuất hiện khối kết tụ. Đọc kết quả: [+] có sự kết tụ; [-] không có sự kết tụ, hỗn hợp vẫn đồng nhất Hình 11: thử nghiệm coagulase. Ống trên [+]; ống dưới [-] Biên soạn: Lê Thùy Linh Page | 13 Homepage: //lethuylinh.weebly.com

Page 2

YOMEDIA

Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, hình cầu, gram dương, có thử nghiệm coagulase, phản ứng DNAse, phosphatease [+] có khả năng lên men và sinh acid từ mannitol, trehalose, sucrose. Tất cả các dòng S. aureus đều mẫn cảm với novobiocine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% NaCl.

29-08-2011 563 101

Download

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2009-2019 TaiLieu.VN. All rights reserved.